一类酚性化合物的制备方法及应用与流程

本发明属于化学药物领域，涉及一类酚性化合物及其在治疗包括溃疡在内的创面愈合中的应用。

背景技术：

创伤包括溃疡在内的成因、危害及治疗在以往申请专利cn105434450a中已经述及。创伤的组织重建过程至少包括细胞的增殖、迁移和血管形成，目前huvec(人脐静脉内皮细胞)已经成为研究促创伤愈合的重要模型。本发明采用人皮肤成纤维细胞(hdfs)和huvec测试发现具有促进创面修复的活性成分。

美洲大蠊(periplanetaamericana)为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，由其制备的康复新液临床上治疗各种创伤包括溃疡效果肯定，表明从中有望发现促创面愈合的活性成分或药物，但这方面的研究还比较欠缺。我们的研究显示美洲大蠊中多类成分从不同角度发挥促进创面愈合作用。

技术实现要素：

本发明提供了一种酚类化合物在制备促进创面愈合药物中的应用，所述创面为溃疡创面。

进一步的，所述化合物结构式为ⅰ-ⅲ中的一种。

进一步的，所述的化合物是通过从美洲大蠊中提取获得或通过人工合成获得。

进一步的，所述化合物具有促进细胞增殖、细胞迁移和血管生成的功效。

本发明还提供了一种酚类化合物的制备方法其制备步骤如下：

取美洲大蠊干燥虫体，经粉碎后，热水回流提取3次，每次2h，提取液减压浓缩得到总提物，总提物经反相色谱mcigelchp20p柱采用甲醇-水按0％～100％比例梯度洗脱得11个组分，分别为f1～f11，f9经sephadexlh-20凝胶得4个组分，分别为f9.1～f9.4，f9.3经mcigelchp20p色谱柱采用甲醇-水按10％～100％比例梯度洗脱得7个组分，分别为f9.3.1～f9.3.7，f9.3.4经rp-18柱以甲醇-水按15％～50％比例得5个组分，分别为f9.3.4.1～f9.3.4.5，f9.3.4.4经半制备hplc得化合物(e)-4-(3,4-dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one和2-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-oxoethylacetate，半制备hplc的流动相为甲醇-水，甲醇体积：水体积＝25:75，f9.3.4.5经半制备hplc得化合物methyl2-(4-hydroxyphenyl)acetate，半制备hplc的流动相为甲醇-水，甲醇体积：水体积＝20:80。

本发明的有益效果：

1.本发明首次公开了从美洲大蠊中提取分离所述的一类酚性化合物的方法。

2.本发明所述的酚性化合物是首次从美洲大蠊中分离鉴定得到的。

3.本发明所述的一类酚性化合物具有显著促进人成纤维细胞增殖、huvec细胞迁移和血管生成的功效。

附图说明

图1化合物促进hdfs增殖活性试验结果(n＝3)。,*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图2a和2b化合物促进huvecs迁移活性试验结果(n＝3)。,*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图3a和3b化合物促进血管生成活性试验结果(n＝3)。,*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例1本发明所述酚性化合物的提取分离及结构鉴定

美洲大蠊来源于四川好医生攀西药业有限责任公司美洲大蠊gap基地，美洲大蠊提取物是康复新液的主要成分。

取美洲大蠊干燥虫体25kg，经粉碎后，热水回流提取3次，每次2h，提取液减压浓缩得到总提物2kg，总提物经反相色谱mcigelchp20p柱采用甲醇-水按0％～100％比例梯度洗脱得11个组分，分别为f1～f11，f9(40g)经sephadexlh-20凝胶得4个组分，分别为f9.1～f9.4，f9.3(5g)经mcigelchp20p色谱柱采用甲醇-水按10％～100％比例梯度洗脱得7个组分，分别为f9.3.1～f9.3.7，f9.3.4(500mg)经rp-18柱以甲醇-水按15％～50％比例得5个组分，分别为f9.3.4.1～f9.3.4.5，f9.3.4.4(40mg)经半制备hplc得化合物(e)-4-(3,4-dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one(10.0mg，tr＝10.5min；对应编号qzl-10)和2-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-oxoethylacetate(3.5mg，tr＝18.1min；对应编号qzl-12a)，半制备hplc的流动相为甲醇-水，甲醇体积：水体积＝25:75，f9.3.4.5经半制备hplc得化合物methyl2-(4-hydroxyphenyl)acetate(5.2mg，tr＝14.8min；对应编号qyzl-104)，半制备hplc的流动相为甲醇-水，甲醇体积：水体积＝20:80。

化合物结果鉴定如下：

化合物(e)-4-(3,4-dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one，淡黄色固体，esi-msm/z:177[m–h]^–,¹hnmr(600mhz,cd3od)δ:7.51(1h,d,j＝16.2hz,h-7),7.08(1h,brs,h-2),6.99(1h,d,j＝7.5hz,h-6),6.79(1h,d,j＝7.5hz,h-5),6.54(1h,d,j＝16.2hz,h-8),2.33(3h,s,h-10)；¹³cnmr(methanol-d4,150mhz)δc201.6(c-9),150.0(c-4),146.9(c-3),146.9(c-7),127.7(c-1),124.7(c-8),123.6(c-6),116.5(c-2),115.3(c-5),27.0(c-10)。

化合物2-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-oxoethylacetate，淡黄色固体，esi-msm/z:209[m–h]^–,¹hnmr(400mhz,cd3od)δ:7.40(1h,dd,j＝8.2,1.8hz,h-6),7.38(1h,d,j＝1.8hz,h-2),6.84(1h,d,j＝8.2hz,h-5),5.32(2h,s,h-8),2.16(3h,s,h-oac)。

化合物methyl2-(4-hydroxyphenyl)acetate，淡黄色固体，esi-msm/z:165[m–h]^–,¹hnmr(400mhz,cd3od)δ:7.07(2h,d,j＝8.5hz,h-2,h-6),6.72(2h,d,j＝8.5hz,h-3,h-5),3.66(3h,s,h-och3),3.52(2h,s,h-7)。

实施例2酚性化合物促hdfs细胞增殖活性测试方法

人皮肤成纤维细胞(hdfs)购自美国模式菌种收集中心(atcc)。dmem培养基和胎牛血清购自gibco公司。将对数期hdfs细胞调整细胞悬液浓度约为3×10³/ml，接种于96孔培养板中，每孔100ml，置于37℃、5％co2条件下培养24h待细胞贴壁后，加入化合物溶液(终浓度20μm)培养100ml，空白对照组加入等量的新鲜培养基。各组设置3个平行孔，置于培养箱中孵育48h后，每孔加入20ml的5mg/mlmtt溶液，置于37℃、5％co2条件下孵育4h，终止培养，除去上清液，每孔加入150mldmso，震荡15min，待蓝紫色结晶充分溶解，在酶标仪490nm波长处测定吸光度值，每组取平均值，重复3次实验。

细胞增殖率(％)＝(实验组od值-空白对照组od值/空白对照组od值)×100％

实施例3酚性化合物促huvecs迁移实验方法

人脐静脉内皮细胞(huvecs)来自深圳大学医学部，由刘宝华教授研究组馈赠。m199培养基和胎牛血清购自gibco公司。收集对数期huvecs细胞，接种于24孔培养板中，每孔14×10⁴个细胞。置于37℃、5％co2条件下培养24h待细胞贴壁后，用1×pbs清洗3次，然后用含0.5％fbs的m199培养基饥饿6小时。饥饿结束后，用p10枪头进行划痕，实验组加入溶有药物(终浓度20μm)的m199培养基，空白组加入新鲜的m199培养基，并进行拍照。在37℃、5％co2条件下孵育6h后，用1×pbs清洗3次，加入新鲜的m199培养基，并进行拍照。划痕面积计算用imageproplus6进行。

迁移面积％＝(实验组0h划痕面积-实验组6h划痕面积/空白对照组0h划痕面积-空白组6h划痕面积)×100％

实施例4酚性化合物促huvecs血管生成活性测试

人脐静脉内皮细胞(huvecs)来自深圳大学医学部，由刘宝华教授研究组馈赠；m199培养基和胎牛血清购自gibco公司；matrigel胶购自corning公司。将matrigel胶均匀铺于预冷的96孔板中，每孔50μl，37℃孵育40min，待matrigel胶凝固后，每孔加入1×10⁴huvecs细胞，实验组加入待测化合物(终浓度20μm)处理，对照组不含药物。在37℃、5％co2条件下，培养6h后，于显微镜下观察拍照，图片分析用imagej软件进行，每个实验重复3次。

血管生成率(％)＝药物处理组成管长度/对照组成管长度×100％

由图可知，所述酚性化合物分别在人成纤维细胞增殖(图1)、人脐静脉内皮细胞迁移(图2a，2b)、血管形成方面显示明显的促进作用(图3a和3b)，表明具有促进创面愈合作用。