一种基于仿生设计的多功能硬脑膜修复材料及其制备方法与流程

本发明属于生物医用材料的组织工程技术领域，具体涉及一种基于仿生设计的多功能硬脑膜修复材料及其制备方法。

背景技术：

硬脑膜是一厚而坚韧的双层膜。外层是颅骨内面的骨膜，仅疏松地附于颅盖，特别是在枕部与颞部附着更疏松，称为骨膜层。但在颅的缝和颅底则附着更牢固，很难分离。颅内无硬膜内腔。硬脑膜内层较外层厚而坚韧，与硬脊膜在枕骨大孔处续连，称为脑膜层。主要作用是保护大脑。

在日常生活中，硬膜缺损是脊柱外科与神经外科手术中经常遇到的临床问题，交通事故、工矿意外及战争等都会造成开放性颅骨损伤和脊柱受损，还有一些先天性脑膜缺损、肿瘤转移以及其他原因都会造成硬脑膜缺损，当出现上述缺损，就会进行手术修补。调研发现，目前医疗结构在手术过程中所使用的修补材料一般有以下几类，一种是来自于自体组织的修补材料，此种材料具有生物相容性好，免疫反应低等优点，但是来源有限，价格昂贵，一种是同种异体材料，其同样来源小，且免疫反应高，第三种是异种生物材料，其同样存在较高的免疫排斥反应，还有一种就是人工合成材料，其具有价格相对低廉，来源广泛等优点。

当前，人工硬脑膜修复材料多从成分或者结构上面进行仿生设计，而没有结合成分、结构、性能三个方面的仿生设计，无法从多方面进行仿生，使得硬脑膜修复材料只能实现部分功能，无法适应硬脑膜材料功能上的复杂需求；当前的硬脑膜修复材料多从防止漏出脑脊液这一基本功能，及胶原这一硬脑膜成分出发进行仿生设计，依然存在因缝合/胶合边缘、修补材料中间出现缝隙，以及修复过程中因材料降解过快，修复性能不足而发生漏液、粘连等问题；同时硬脑膜修复材料成本较高，难以大规模生产和应用。

技术实现要素：

对现有技术存在的问题，本发明提供了一种结合成分、结构、性能三方面的仿生设计，以实现同时拥有较好的再生活性、防漏液、防粘连、抗菌性能和降解性能的三层结构的硬脑膜修复材料。

为了实现以上技术内容，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种基于仿生设计的多功能硬脑膜修复材料，所述的硬脑膜修复材料包括：

疏水防漏性能的聚乳酸层，所述的疏水层以聚乳酸为材料，通过静电纺丝制备得到聚乳酸薄膜；

亲水和修复功能的水凝胶层，所述的水凝胶层以明胶和sis粉末为材料，通过edc交联或光照交联的方法制备得到明胶-sis粉末水凝胶；

抗菌、防粘连性能的壳聚糖-聚乳酸层，所述的连接层以壳聚糖和聚乳酸为材料，通过静电纺丝制备得到壳聚糖-聚乳酸薄膜。

所述的壳聚糖-聚乳酸层通过静电纺丝方法直接纺在疏水层上形成双层静电纺丝薄膜。

所述的双层静电纺丝薄膜在水凝胶层快交联形成时,倒扣在水凝胶层上方。

所述的聚乳酸薄膜微米厚度的直径为1微米。

本发明的另一方面，上述多功能仿生硬脑膜修复材料的制备方法，包括：

先在玻璃片上铺好模型框(高度为约0.4mm的橡胶长方形细框)，取2ml混合好的脱细胞(0.01g/ml)-明胶(0.15g/ml)溶液加入框内，再加入1ml0.15g/mledc·hcl,0.03g/mlnhs混合液，用移液枪混合均匀。约30s后，待凝胶快形成时，将双层静电纺丝膜放在凝胶上方，铺平。

所述的明胶溶液为a型猪皮明胶与脱细胞材料溶于mes得到，所述的脱细胞材料为猪小肠黏膜下层(市售成年新鲜猪小肠)通过sds脱细胞得到的sis膜片，冻干球磨得到sis脱细胞粉末。

所述的n，n-(3-二甲基氨基丙基)-n-乙基碳化二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的摩尔比为0.2，浓度分别为0.15g/mledc·hcl,0.03g/mlnhs。

在本发明的一些实施例中，上述多功能仿生硬脑膜修复材料的制备方法，包括：

利用明胶和甲基丙烯酸制备甲基丙烯酸化水凝胶，用mes溶液溶解甲基丙烯酸化水凝胶在黑暗条件下制备10％甲基丙烯酸化水凝胶溶液，加入紫外光引发剂，在365nm紫外灯波长下，光照进行交联得到硬脑膜修复材料。

本发明所述的双层静电纺丝薄膜通过以下方法制备得到：

1)聚乳酸薄膜的制备

将浓度为8.5％w/v的聚乳酸溶液注入至注射器中进行静电纺丝，形成聚乳酸静电纺丝薄膜；

2)双层静电纺丝薄膜的制备

将含有壳聚糖和聚乳酸的溶液注入之注射器，在聚乳酸薄膜上进行静电纺丝，在聚乳酸薄膜上制备壳聚糖-聚乳酸薄膜，得到双层静电纺丝薄膜。

所述的聚乳酸溶液中聚乳酸分子量为28.6万，溶剂为二氯甲烷。

所述的聚乳酸薄膜静电纺丝过程采用9号针头，设置正负电极间距为15cm，正极电压10v，负极电压-5v，推进速率为0.5ml/h，进行静电纺丝。

所述的含有壳聚糖和聚乳酸的溶液中壳聚糖和聚乳酸的质量比为8:2，溶剂为体积比9:1的六氟异丙醇和冰醋酸混合液，溶质总体质量体积分数为2.5％w/v。

所述的壳聚糖-聚乳酸薄膜制备过程中采用7号针头，设置正负电极间距为20cm，正极电压16v，负极电压-7v，推进速率为1.2ml/h，进行静电纺丝。

本发明的有益效果为：

本发明通过通过降低原材料成本和降低产品的生产成本，提供了一种低成本但性能优异的硬脑膜修复材料，本发明使用的明胶，是胶原经温和而不可逆断裂后的多肽混合物，它拥有胶原的功能，比胶原便宜；静电纺丝使用的聚乳酸和壳聚糖，成本均较为低廉。

另外本发明通过成分、结构、性能三方面的仿生，实现拥有防漏液，防粘连，诱导再生，抗免疫，抗菌，较好的降解性能等多功能的硬脑膜修复材料。

附图说明

图1是本发明结合物的扫描电镜图；其中a为修复材料中聚乳酸薄膜层结构；b为水凝胶-双层纺丝膜结合处结构；c为水凝胶层结构；

图2是本发明结合物力学性能检测。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明以明胶、sis粉末、聚乳酸、壳聚糖四种材料为原料，通过静电纺丝的方法制备聚乳酸薄膜，发挥其疏水性能，实现防漏液的功能；通过edc交联和光照交联两种方法制备明胶-sis水凝胶，利用其亲水性能，及脱细胞材料本身的高活性实现优异的修复再生功能；中间以壳聚糖-聚乳酸静电纺丝薄膜进行连接，壳聚糖呈碱性，聚乳酸呈酸性，降解物对ph的影响可相互抵消，保持中性环境。壳聚糖本身被证明具有良好的抗菌，抗粘连性能，因此能实现优异的抗菌抗粘连功能。

其中明胶为成分仿生的主要原料；静电纺丝薄膜—水凝胶双层结构是仿照硬脑膜的双层结构而设计；疏水聚乳酸-亲水水凝胶，及较好抗菌、抗粘连性能的壳聚糖，活性sis粉末是仿照硬脑膜的性能而设计。

本发明的制备流程为：静电纺丝聚乳酸薄膜—静电纺丝壳聚糖-聚乳酸薄膜—在双层静电纺丝薄膜上连接明胶-sis粉末水凝胶。

实施例1

一种基于仿生设计的多功能硬脑膜修复材料及其制备方法，包括以下步骤：

1)静电纺丝聚乳酸薄膜

将磁力搅拌24小时的1ml8.5％(w/v)plla(聚乳酸)注入到玻璃注射器中(d＝12mm)，该聚乳酸溶液中聚乳酸分子量为28.6万，溶剂为二氯甲烷，使用9号针头，设置正负电极间距为15cm，正极电压10v，负极电压-5v，推进速率为0.5ml/h，进行静电纺丝，形成微米厚度的直径为1微米左右的聚乳酸静电纺丝薄膜。

2)静电纺丝壳聚糖-聚乳酸薄膜

将含2.5％w/v总量的壳聚糖和聚乳酸溶液，磁力搅拌24小时，其中壳聚糖和聚乳酸的质量比为8:2，溶剂为六氟异丙醇和冰醋酸，六氟异丙醇和冰醋酸的体积比为9:1。取1ml溶液注入到玻璃注射器中(d＝12mm)，使用7号针头，设置正负电极间距为20cm，正极电压16v，负极电压-7v，推进速率为1.2ml/h，在聚乳酸薄膜上进行静电纺丝，形成微米厚度的直径为100nm左右的壳聚糖-聚乳酸静电纺丝薄膜。

3)edc交联法在双层静电纺丝薄膜上制备明胶-sis粉末水凝胶

取1cm×2cm双层静电纺丝薄膜至于聚四氟乙烯培养皿中；称取1ga型猪皮明胶和0.01g脱细胞材料，配制10％(w/v)的明胶溶液，(溶剂：50mlmes，mesbufferph＝5.3左右)，在45℃下磁力搅拌进行溶解；将溶解好的明胶溶液倒入放有双层静电纺丝薄膜基底的聚四氟乙烯培养皿中，同时加入n，n-(3-二甲基氨基丙基)-n-乙基碳化二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)(ph5.3，0.05m)浸渍，其中nhs与edc的摩尔比保持恒定在0.2。交联反应进行16小时。然后用含有0.1m磷酸氢二钠和1m氯化钠的溶液置换反应混合物2小时(ph8.5,50ml)以猝灭交联，随后将样品用去离子水洗涤4小时1小时(50毫升)。所有洗涤步骤都在4℃下进行。

其中脱细胞材料为猪小肠黏膜下层(市售成年新鲜猪小肠)通过sds脱细胞得到的sis膜片，冻干球磨得到sis脱细胞粉末。

实施例2

一种基于仿生设计的多功能硬脑膜修复材料及其制备方法，包括以下步骤：

1)静电纺丝聚乳酸薄膜

将磁力搅拌24小时的1ml6％(w/v)plla(聚乳酸)注入到玻璃注射器中(d＝12mm)，该聚乳酸溶液中聚乳酸分子量为28.6万，溶剂为二氯甲烷，使用9号针头，设置正负电极间距为15cm，正极电压10v，负极电压-5v，推进速率为0.5ml/h，进行静电纺丝，形成微米厚度的直径为1微米左右的聚乳酸静电纺丝薄膜。

2)静电纺丝壳聚糖-聚乳酸薄膜

将含2.5％w/v总量的壳聚糖和聚乳酸溶液，磁力搅拌24小时，其中壳聚糖和聚乳酸的质量比为8:2，溶剂为六氟异丙醇和冰醋酸，六氟异丙醇和冰醋酸的体积比为9:1。取1ml溶液注入到玻璃注射器中(d＝12mm)，使用7号针头，设置正负电极间距为20cm，正极电压16v，负极电压-7v，推进速率为1.2ml/h，在聚乳酸薄膜上进行静电纺丝，形成微米厚度的直径为100nm左右的壳聚糖-聚乳酸静电纺丝薄膜。

3)光照交联法在双层静电纺丝薄膜上制备明胶-sis粉末水凝胶取1cm×2cm双层静电纺丝薄膜至于聚四氟乙烯培养皿中；

a型猪皮明胶在60度下以10％(w/v)混合到磷酸盐缓冲盐水中并搅拌至完全溶解；在50度搅拌条件下将8ml甲基丙烯酸(ma)加入到明胶溶液中并使其反应4小时；加入预热(40度)pbs的5倍稀释液以终止反应；将混合物用12-14kda截留透析袋，40度下用蒸馏水透析一周，以除去盐和ma，将溶液冻干72小时，以产生白色多孔泡沫，并储存于-20度，直至进一步使用；

用mes溶液(mesbufferph＝5.3左右)溶解gelma，在黑暗条件下制备10％gelma溶液，在溶液中加入0.5％(w/v)i2959紫外光引发剂；将混合的溶液倒入聚四氟乙烯培养皿中，在365nm紫外灯波长下，光照3min进行交联，后放置至4度冰箱。

4)依照双层静电纺丝薄膜的形状，截取所得三层结构材料，即得到三层硬脑膜修复材料。

实施例3

如图1所示，水凝胶层结构表面十分光滑，为水凝胶干燥后的一般表面形貌特征，水凝胶-双层纺丝膜结合处水凝胶层位于纺丝下方，呈现出凹凸不平的形貌；此外，壳聚糖-聚乳酸纺丝镶嵌在水凝胶层内，并连接水凝胶层。其中水凝胶与纺丝结合界面中，缠绕在聚乳酸纺丝中的壳聚糖-聚乳酸纺丝与水凝胶紧密结合，并且带动聚乳酸与水凝胶结合，使聚乳酸表面包裹一层水凝胶。

按照脑脊液的配方体外配制人脑脊液，在材料中聚乳酸电纺表面进行接触角实验。结果显示接触角的均值为143.56°，发现接触角较大，且水滴能维持这个状态10分钟以上(风干影响)，证明本材料具有优异的防漏液性能。

截取试样在力学试验机上进行测试，如图2所示，虽然材料的断裂强度比较低，只有0.28n/mm²,但是其拥有较高的弹性模量，为1.63n/mm²，弹性很高，可以发生较大的变形，此外，材料的最大变形率超过1。在应变约0.2处拉伸曲线出现明显的波动，为水凝胶层断裂。

判断，该材料能适应硬脑膜的环境(来自脑脊液的脉动流的径向压力产生周向应力/应变，并且头部的弯曲运动可以在纵向方向上对硬脑膜产生拉伸载荷。kleiven(2006)基于nahum(1977)和trosseille(1992)等人对尸体进行的冲击实验计算了颅内压(icp)水平，发现峰值约为100kpa，及缝合/粘合过程的拉力，对其力学性能要求不高)。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。