碳酸酐酶抑制剂在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用的制作方法

本发明涉及抗动脉粥样硬化药物领域，具体涉及碳酸酐酶抑制剂，醋甲唑胺及乙酰唑胺对血管平滑细胞钙化、动脉粥样硬化的预防和治疗作用。

背景技术：

动脉粥样硬化(atherosclerosis，as)是一种常见的以慢性炎症反应为主要特征的血管系统疾病，是导致心血管病变的重要危险因素，主要累及大中型血管动脉内膜。血管内皮细胞受损为其起始环节，继而大量血脂沉积、单核细胞集聚和泡沫细胞形成、血管内皮细胞功能紊乱和平滑肌细胞增生，最终导致动脉粥样硬化病变。血管钙化(vascularcalcification)是动脉粥样硬化、高血压、糖尿病、血管损伤、慢性肾病和衰老等病变过程中普遍存在的病理表现，是血管壁早期损伤的一种适应性过程。大量研究显示，动脉钙化是一种主动的、由细胞所调控的类成骨过程，包括血管平滑肌细胞向成骨细胞表型转换以及羟磷酸盐结晶沉淀。在动脉粥样硬化血管钙化的形成过程中核心蛋白结合因子(runt-relatedtranscriptionfactor2，runx2)、骨形成发生蛋白(bonemorphogeneticprotein2，bmp2)、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，alp)相互作用、相互影响，通过多条途径进行类似成骨样细胞分化的过程。

碳酸酐酶1(carbonicanhydrase1,ca1)是碳酸酐酶家族(carbonicanhydrase,ca)中的一员，可以可逆地催化二氧化碳水化形成碳酸氢根，碳酸氢根不稳定迅速地与钙离子结合形成碳酸钙。本申请发明人用蛋白质组学方法对强直性脊柱炎(ankylosingsporidylitis)关节滑膜进行了分析。通过与类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，ra)、骨关节炎(osteoarthritis，oa)滑膜组织比较，发现ca1在强直性脊柱炎患者的滑膜中特异性高表达，并通过加速碳酸钙沉积导致关节钙化，骨化和关节融合。强直性脊柱炎最显著的病理表现是髋关节和脊柱关节炎症、骨增生、关节融合和纤维化，该病病变程度与患者滑膜严重程度密切相关。本申请发明人还研究了ca1与乳腺癌钙化的关系，发现ca1在乳腺癌患者组织和血液中高表达，导致部分癌细胞钙化并抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞迁移。ca1还通过调节乳腺癌细胞雄激素受体(androgenreceptor，ar)和x-框结合蛋白1(x-boxbindingprotein1，xbp1)的表达促进乳腺癌病变进程。乙酰唑胺(acetazolamide，az)和醋甲唑胺(methazolamide，mtz)是碳酸酐酶的抑制剂，可抑制多种碳酸酐酶亚型的表达。

与一些实验室提出ca可能对动脉粥样硬化发挥重要作用，oksala等发现ca家族的ca2和ca12在人动脉粥样硬化斑块中高表达，并可能与晚期动脉粥样硬化中单核细胞来源的破骨细胞样细胞有关，但ca1的表达与血管平滑肌细胞矿化及动脉粥样硬化的关系还未见报道，碳酸酐酶抑制剂是否对于主动脉的动脉粥样硬化具有治疗作用尚不明确。

技术实现要素：

针对以上技术缺陷，本申请研究了碳酸酐酶1(ca1)对动脉粥样硬化的作用和作用机制，本研究首次发现ca1在动脉粥样硬化钙化组织中高表达，另外还发现ca1的表达与血管平滑肌钙化、增殖、凋亡及迁移均有一定程度的关联。为了研究ca1、血管平滑肌细胞钙化及动脉粥样硬化三者间的关系，本申请采用碳酸酐酶抑制剂——醋甲唑胺喂食小鼠动脉粥样硬化模型，体内观察ca1的表达与动脉粥样硬化的关系，及碳酸酐酶抑制及对动脉粥样硬化的治疗作用；同时，体外培养大鼠血管平滑肌细胞(rat-vsmc)，诱导其钙化，观察细胞钙化后ca1的表达，检测ca1表达被抑制后的rat-vsmc细胞，其钙化、增殖、迁移及凋亡状况。体外证明ca1与血管平滑肌细胞钙化、增殖、迁移及凋亡相关，确认了通过碳酸酐酶抑制剂可以缓解血管平滑肌细胞钙化、降低血脂综合指数、降低外周血血清中炎症因子的表达，实现治疗动脉粥样硬化的技术效果。

现有技术中针对ca2和ca12在动脉粥样硬化部位的高表达进行了报道，但是本领域内公知同工酶的生物活性差异较大，现有研究表明ca1具有催化水合反应，促进钙盐形成，与骨组织病变相关，但未见ca1与主动脉或心血管疾病相关的报道，其在主动脉病变组织中的高表达具有不可预见性。进一步的，碳酸酐酶抑制剂药物不仅能够缓解主动脉血管平滑肌细胞钙化，还具有降低血脂综合指数及血清中炎症因子数量的作用，除缓解钙化之外，还表现出了降血脂和抗炎活性，对动脉粥样硬化疾病及并发症的防治有重要意义。

为了实现以上技术目标，本申请提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供检测ca1的试剂在制备血管平滑肌钙化诊断试剂中的应用。

优选的，上述应用中，该检测ca1的试剂用于检测胸主动脉血管平滑肌中的ca1含量。

本发明第二方面，提供一种用于血管平滑肌钙化的诊断试剂，该试剂用于检测胸主动脉血管平滑肌中ca1含量的表达。

本发明第三方面，提供检测ca1的试剂在制备动脉粥样硬化诊断试剂中的应用。

优选的，上述应用中，检测试剂用于检测主动脉组织中的ca1含量。

本发明第四方面，提供一种用于动脉粥样硬化诊断的试剂，该试剂用于检测主动脉组织中ca1含量的表达。

优选的，上述应用中检测ca1试剂的产品包括用于real-timepcr、westernblot、southern杂交、northern杂交、点杂交、荧光原位杂交、dna微阵列、aso法、高通量测序法、免疫法检测的试剂。

本发明第五方面，提供碳酸酐酶抑制剂在制备防治心血管疾病的药物或保健品中的应用。

优选的，上述心血管疾病为血管平滑肌钙化。

优选的，上述心血管疾病为动脉粥样硬化。

优选的，上述碳酸酐酶抑制剂为乙酰唑胺或醋甲唑胺或两者的混合物。

本发明第六方面，提供一种药物组合物，该药物组合物以乙酰唑胺或醋甲唑胺或乙酰唑胺与醋甲唑胺的混合物为活性成分，还包括药学上可接受的辅料。

优选的，上述药物组合物为一种抗血管平滑肌细胞钙化的药物组合物。

优选的，上述药物组合物为一种防治动脉粥样硬化的药物组合物。

优选的，上述药物组合物为一种降血脂的药物组合物。

优选的，上述药物组合物为一种抗炎的药物组合物。

本发明的有益效果

1.本申请通过检测健康志愿者与动脉粥样硬化患者主动脉组织中ca1的含量，发现患者的主动脉硬化组织中ca1含量高表达，且具有统计学意义，揭示了ca1可能与动脉粥样硬化的形成相关，提供了一种新的动脉粥样硬化的诊断标志物。

2.本申请通过体外诱导大鼠心肌平滑细胞钙化检测碳酸酐酶抑制剂对血管平滑肌细胞钙化作用的影响。通过十六烷基氯化吡啶定量检测钙化水平表明，加入乙酰唑胺培养的血管平滑肌细胞钙化程度明显降低，说明ca1的表达与血管平滑肌钙化相关，有望通过抑制碳酸酐酶的表达改善血管平滑肌钙化。

3.本申请通过建立体外血管平滑肌钙化模型及小鼠动脉粥样硬化模型，证明了碳酸酐酶抑制剂能够通过改善血管平滑肌钙化治疗动脉粥样硬化，降低动脉粥样硬化小鼠血脂综合指数，降低外周血血清中炎症因子的含量，可作为动脉粥样硬化形成机制及治疗做出了贡献。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1为ca1在动脉粥样硬化组织中的表达情况图；

其中，图1a为westernblot检测ca1在人动脉粥样硬化对照组组织中的表达情况；图1b为westernblot检测ca1在动脉粥样硬化组织中的表达情况；图1c用imagej软件将ca1蛋白表达量化并用内参校准后的相对蛋白表达程度(*p<0.05，p＝0.0204)；图1d为real-timepcr检测ca1在动脉粥样硬化组织和对照组中的表达情况。图1e为westernblot检测ca1在各组小鼠主动脉中的表达情况；图1f用imagej软件将ca1蛋白表达量化并用内参校准后的相对蛋白表达程度。(**p<0.01，avsb，p＝0.002；*p<0.05，bvsc，p＝0.014；**p<0.01，bvsd，p＝0.003。a正常组；b模型组；c治疗组；d预防治疗组)

图2为大鼠血管平滑肌细胞(rat-vsmc)的生物钙化检测结果图；

其中，图2a茜素红染色法检测大鼠血管平滑肌细胞(rat-vsmc)的生物钙化结果；图2b为十六烷基氯化吡啶定量检测钙化水平，实验结果均由三次实验得出。(***代表p<0.001)；图3为real-timepcr检测rat-vsmc细胞钙化前后骨化标志物runx2、alp、bmp的表达图；实验结果均由三次实验得出。*代表p<0.001，**代表p<0.01。

图3为real-timepcr检测rat-vsmc细胞钙化前后骨化标志物runx2、alp、bmp的表达图。

其中，实验结果均由三次试验得出。*代表p<0.001，**代表p<0.01。

图4为ca1在rat-vsmc细胞中的蛋白表达以及细胞悬液炎症因子表达情况图；

其中图4a为westernblot检测ca1在四组rat-vsmc细胞中的蛋白表达情况；图4b用imagej软件将ca1蛋白表达量化并用内参校准后的相对蛋白表达程度，实验结果均由三次实验得出；图4c表示流式细胞术检测四组细胞细胞悬液il-10、ifn-γ、il-5、il-2、tnf-α、gm-csf、il-4、il-13、il-6细胞因子的浓度变化。*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001。

图5为转染sirna后，rat-vsmc细胞行为变化图；

图5a为westernblot检测rat-vsmc细胞转染sirna72h后ca1的蛋白表达；图5b为用imagej软件将ca1蛋白表达量化并用内参校准后的相对蛋白表达程度，**代表p<0.01；图5c为cck-8检测rat-vsmc细胞转染sirna后增殖能力；图5d左侧为transwell法检测allstarsirna组rat-vsmc细胞迁移染色图，右侧为transwell法检测anti-ca1sirna组rat-vsmc细胞迁移染色图；图5e为细胞迁移数目统计图表；图5f为细胞凋亡比例柱状图。*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001；图5g为流式细胞术检测allstarsirna组rat-vsmc细胞各部分细胞凋亡比例图像；图5h为流式细胞术检测anti-ca1sirna组rat-vsmc细胞各部分细胞凋亡比例图像。

图6为小鼠体重、生化指标图以及血清炎症因子浓度变化图；

图6a为小鼠体重变化图(各组n＝18)；图6b为四组小鼠(各组n＝10)血清血脂tc、tg、ldl-c、hdl-c浓度比较；图6c为四组小鼠动脉粥样硬化指数比较分析；图6d为小鼠血清no水平的比较；图6e为流式细胞术检测四组(各组n＝10)小鼠血清il-10、ifn-γ、il-5、il-2、tnf-α、gm-csf、il-4、il-13、il-6细胞因子的浓度变化统计；图6f为流式细胞术检测四组小鼠血清cxcl1/kc、ccl2/mcp-1、il-18、il-12p70、il-1β、il-17a、il-33、il-1α细胞因子的浓度变化统计。*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001。

图7为第21周四组小鼠主动脉染色结果图；

其中，图7a为苏丹iv大体染色图；图7b为油红o染色；图7c为he染色图；图7d为vonkossa染色图；图7e为ca1免疫组化染色图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术所介绍的，现有技术中针对ca1与动脉粥样硬化的关系以及碳酸酐酶抑制药物对于动脉粥样硬化的治疗作用还未有相关研究，本申请对动脉粥样患者主动脉硬化组织中的ca1含量进行了检测，显示ca1在患者主动脉组织中的含量高表达，且具有统计学意义。另外通过细胞模型和动物造模实验证明了碳酸酐酶抑制剂能够缓解血管平滑肌细胞钙化，降低血脂综合指数，具有治疗动脉粥样硬化的作用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本申请的技术方案。

实施例1

1.人体动脉粥样硬化组织的获取

本申请研究所用的组织标本均取自山东大学附属千佛山医院心外科手术病人(济南，中国)。其中对照组标本取自心脏移植供体志愿者(n＝7)，具体见表1a。动脉粥样硬化组织标本取自主动脉瘤和主动脉夹层且有动脉粥样硬化病症的患者(n＝7)。患者多有高血压、影像学检测显示主动脉有钙化，具体见表1b。样本从相关组织取材后立即存放在-80℃冰箱以备后续实验。组织样本收集均由患者签署知情同意授权书。所有涉及人体为对象的医学研究(包括人体标本和人体数据)均遵循《赫尔辛基宣言》，动物实验严格遵守世界卫生组织制定的有关活体动物实验研究的国际指导原则和中华人民共和国《实验动物管理条例》进行(2017)。以上研究计划均经山东省千佛山医院伦理委员会批准(批准号20160901)。

表1a移植供体动脉组织样本

表1b动脉粥样硬化组织样本

2.大鼠血管平滑肌细胞(rat-vsmc)细胞培养及诱导钙化

实验方法参照发表文献：ray,jennalynn,etal."isolationofvascularsmoothmusclecellsfromasinglemurineaorta."methodsincellscience23.4(2001):185-188.首先选取4周龄雄性sd大鼠(80-100g)麻醉处死后，无菌条件下分离出胸主动脉，剥除血管外膜结缔组织并冲洗血管和管腔，轻轻刮除内膜，然后将血管剪成1mm²左右的组织小块。将这些处理好的组织块放入含有生长培养基(含4.5g/l葡萄糖、15％胎牛血清(gibco)、1％青链霉素(gibco)和10mm/l丙酮酸钠)培养皿中，在37℃，5％的co2的培养箱中进行培养。将细胞进行传代培养，取3～8代长势良好的血管平滑肌细胞(3～8代血管平滑肌细胞的表型比较稳定)用于后续的钙化诱导实验。以1×10⁵细胞/孔的密度将细胞接种于6孔培养板内，第二天待细胞80％汇合后加入含有10mmβ-磷酸甘油(sigma)的钙化诱导培养基连续培养14天，每隔2天换一次液。开始进行钙化诱导时被定义为实验第一天。实验方案的设计基于liuy等的研究：yliu,etal."cortistatinattenuatesvascularcalcificationinrats."regulatorypeptides159.1(2010):35-43.

3.乙酰唑胺对rat-vsmc细胞钙化的影响

ca抑制剂乙酰唑胺(acetazolamide,az)(sigma)溶解于0.05％的dmso中。为了验证rat-vsmc细胞钙化过程中ca1的作用，将rat-vsmc细胞以相同的密度1×10⁵细胞/孔接种于6孔板内，按100μmol/l加az于被诱导钙化的培养细胞中。实验参照发表的文献：hallge,kennyad:roleofcarbonicanhydraseinboneresorptioninducedby1,25dihydroxyvitamind3invitro.calciftissueint1985,37(2):134-142.及hallge,kennyad:roleofcarbonicanhydraseinboneresorptioninducedbyprostaglandine2invitro.pharmacology1985,30(6):339-347。同时设置乙酰唑胺对照组，即在钙化诱导培养基中加入0.05％的dmso，其他培养过程和乙酰唑胺组一样。

4.茜素红染色分析

rat-vsmc细胞钙化诱导14天，弃去培养基，pbs洗3遍(pbs，solabio)，95％乙醇固定10分钟，然后加入0.5％(w/v)茜素红(ar-s,solabio)(ph＝4.2)室温染色30分钟，pbs再洗3遍。显微镜(显微镜olympusix71)下观察各组细胞钙化结节的形成情况，并拍照。

5.十六烷基氯化吡啶定量检测钙化水平分析

rat-vsmc细胞钙化诱导14天并进行茜素红染色分析后，加入10％(w/v)的十六烷基氯化吡啶。37℃恒温箱孵育1小时，酶标仪(美国moleculardevices公司)562nm波长下检测其光密度值(od值)，以od值代表其矿化程度的高低。

6.实时荧光定量pcr检测ca1、runx2、alp、bmp2表达

按照rnapuretissue&cellkit说明书中的实验条件和步骤，提取人体组织、大鼠血管平滑肌细胞以及小鼠主动脉组织总rna。紫外分光光度仪测定rna的纯度和浓度后，根据toyobo逆转录试剂盒操作说明书将rna逆转录为cdna，然后用实时荧光定量pcr(美国lifetechnology公司，steponeplus)检测mrna的表达。总反应体系10μl，包含5μlsybrgreen(sybrgreenreal-timepcrmastermix,toyobo)，2μlrnasefreeh2o，1μl上下游引物和1μlcdna。反应条件为95℃预变性10min，(95℃15s，60℃34s，72℃30s)×45cycle，72℃延伸3min。使用gapdh(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，gapdh)mrna作为内参来比较ca1、runx2、alp、bmp2mrna的表达水平。同一样本重复3次。mrna的相对表达量通过公式ratio＝2^–δδct＝2^{-δct(sample)}来计算。其中δct＝ct目的基因–ct内参基因。引物的特异性通过熔解曲线分析进行证实。引物序列见表2。

表2.pcr引物序列(按顺序写)

7.westernblotting(wb)检测ca1表达

分别收集人体组织标本、小鼠主动脉组织标本、诱导钙化和乙酰唑胺处理的血管平滑肌细胞样本，加入细胞裂解液(ripalysisbuffer,beyotime)，冰上裂解30分钟，然后12000rpm离心30分钟。bca试剂盒(solabio)测定蛋白上清液浓度后，加入loadingbuffer(beyotime)95℃10min使蛋白彻底变性。12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离后，采用湿转法将蛋白转移到pvdf膜上。5％脱脂奶粉(伊利)室温封闭1小时后，加入含ca1抗体(abcam，108367)，4℃孵育过夜。采用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1:10000)(碧云天生物技术有限公司，a0208)，37℃孵育1小时。洗膜充分后，采用ecl底物显色试剂盒(millipore)显色，以gapdh表达水平作为标准内参。各实验至少独立重复3次，用imagej软件对目的蛋白灰度值进行定量分析。

8.ca1小干扰rna转染

生物公司(吉玛基因)合成anti-ca1sirna，序列为5’-ggaugcccuaagcucaguutt-3’。将rat-vsmc细胞铺于六孔板，待细胞贴壁后进行转染。提前0.5-1h对六孔板细胞进行换液，每孔加入1ml10％fbs+dmem新鲜培养液。配置转染试剂混合液，用无菌去离子水将5×transfectionbuffer稀释成1×transfectionbuffer，再加入3μlanti-ca1sirna以及7.2μlpepmute^tmsirnatransfectionreagent(美国signagen公司)。移液器吹打50次混匀，室温静置15分钟后加入铺好细胞的六块板中。转染24h后更换新鲜10％fbs+dmem培养液。转染72h后收集细胞提取蛋白，wb检测干扰效率。实验以allstarsirna为对照，该sirna不抑制任何基因表达。

9.cck-8检测rat-vsmc细胞增殖功能

rat-vsmc细胞anti-ca1sirna转染24小时后收集细胞并后铺于96孔板。在转染0、24、48、72h分别向相应孔加入10μlcellcountingkit-8(日本同仁)溶液，培养箱孵育2h。酶标仪测定od450，比较两组细胞存活情况是否有差异。

10.transwell小室检测rat-vsmc细胞迁移功能

rat-vsmc细胞anti-ca1sirna转染24h后，弃孔内液体，pbs冲洗2遍，胰酶消化后离心重悬进行细胞计数。取出transwell小室(美国corning公司)，置于24孔板内，形成上下两室，下室加入600μl10％fbs+dmem培养液，上室加入100μl不含血清的细胞悬液(约含8×10⁴个细胞)，37℃孵育24小时。然后取出小室，吸去上清，用棉棒轻轻擦去小室内壁细胞，务必擦拭干净，以免影响后续实验结果的观察。小室置于甲醇中固定15分钟，晾干后再次擦拭小室内壁。0.01％结晶紫染色10分钟，pbs洗2遍后晾干，各组细胞的染色和冲洗时间应保持一致。用手术刀将小室轻轻割下，封片，彻底晾干后显微镜下观察并进行细胞计数(显微镜olympusbx51)。

11.annexinv-fitc/pi流式细胞术检测rat-vsmc细胞凋亡

rat-vsmc细胞anti-ca1sirna转染48h后，每组取5-10×10⁴个细胞离心，pbs洗3遍，加入100μlbindingbuffer重悬，再加入抗体annexinv-fitc(北京达科为生物技术有限公司)5μl、pi10μl，混匀后室温避光孵育15min。每管加入400μlbindingbuffer重悬，用流式细胞仪上机检测。

12.建立小鼠动脉粥样硬化模型

健康雄性8周龄c57bl/6j-apoe^-/-小鼠(北京维通利华)，体重22±2g，在无特定病原体级(spf级，specificpathogen-free)条件下饲养，小鼠房温度维持在18～22℃，湿度控制在50％～60％之间，通风良好，12/12小时光照/黑暗模拟昼夜交替环境。动物可自由获取食物和高压消毒灭菌水，饲养笼具、引水瓶定期消毒，所有垫料均经过高压灭菌，定期更换，房间内定期紫外灯消毒。小鼠分组适应性喂养2周，随机分为以下四组(每组小鼠进行编号)。①正常组(14只)普通饲料喂养apoe^-/-小鼠21周。1至21周期间，按0.1ml/10g体重灌胃给予生理盐水，隔天1次。第12周时，随机选取1只小鼠，取主动脉，he染色观察病理改变。第15、18、21周时再随机选取小鼠，取主动脉，he染色观察。小鼠解剖前采血并测定小鼠血清总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)含量。②模型组(16只)高脂饲料(1％胆固醇和10％脂肪，其余为普通基础饲料)喂养apoe^-/-小鼠21周。1至21周期间，按0.1ml/10体重g灌胃给予生理盐水，隔天1次。第12周，随机选取小鼠，取主动脉，he染色观察病理改变。确定模型建立成功后，高脂饲料继续喂养，待到第15、18、21周时，再随机选取小鼠，取主动脉，he染色观察。小鼠解剖前采血并测定小鼠血清总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)含量。③治疗组(15只)高脂饲料喂养apoe^-/-小鼠18周。1至12周期间，按0.1ml/10g体重灌胃给予生理盐水，隔天1次；12至21周按0.1ml/10g体重灌胃给醋甲唑胺(杭州澳医保灵药业有限公司)，药物剂量约0.5mg/只/天(25mg/kg/day)，隔天1次。第15、18、21周时，随机选取小鼠，取主动脉，he染色观察病理改变。小鼠解剖前，采血并测定各组小鼠血清总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)含量。④预防治疗组(18只)高脂饮食喂养apoe^-/-小鼠21周。1至21周期间，按0.1ml/10g体重灌胃给醋甲唑胺，药物剂量约0.5mg/只/天(25mg/kg/day)，隔天1次。12周时，随机选取3只小鼠，取主动脉，he染色观察病理改变。待到第15、18、21周时，再随机选取小鼠，取主动脉，he染色观察。小鼠解剖前，采血并测定各组小鼠血清总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)含量。每周观察各组小鼠的精神反应，肢体活动，皮肤情况，毛发颜色及光泽度等健康状况，对小鼠体重进行称量并记录。

13.小鼠血脂检测

实验开始第21周，各组小鼠采用眼球放血法取血，装有血液的ep管室温静置30分钟后3000rpm离心10分钟，吸出上层血清，无菌ep管分装后-80℃冰箱保存备用。试剂盒(南京建成)测定各组小鼠血清总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)含量，并计算动脉硬化指数(ai)＝[tc-(hdl-c)]/hdl-c。

14.小鼠血清中一氧化氮(no)含量检测

实验开始第21周，收集上述四组小鼠血清，试剂盒(南京建成)测定上述四组小鼠血清中一氧化氮(no)含量。

15.流式细胞术检测rat-vsmc细胞悬液和第21周各组小鼠外周血血清炎症因子表达

分别收集rat-vsmc培养14天后四组细胞悬液和第21周四组小鼠血清。在检测板上，每孔加入捕获微球混合液25μl、荧光试剂25μl、待测样品25μl，置于摇床上，500rpm室温避光孵育2小时。加入200μlwashbuffer，250g离心5min。洗涤2次，吸弃上清，加入100μlwashbuffer重悬。炎症因子试剂盒(biolegend)流式仪上机检测炎症因子的表达情况。fcap_array_v3软件(bdbiosciences)分析所有炎症因子(il-10、ifn-γ、il-5、il-2、tnf-α、gm-csf、il-4、il-13、il-6、cxcl1/kc、ccl2/mcp-1、il-18、il-12p70、il-1β、il-17a、il-33、il-1α)的浓度变化。

16.苏丹红iv染色

实验开始第21周，小心剥离各组小鼠胸腹主动脉至髂动脉分支，仔细剥离动脉周边的结缔组织，将主动脉纵向展开。pbs清洗，将主动脉置于herherimers(苏丹iv5g，70％酒精500ml，丙酮50ml混匀)液中浸泡20min，然后80％酒精分色20min，流水冲洗1h。显微镜下观察拍照。

17.小鼠油红o染色观察主动脉粥样硬化斑块

实验开始第21周，取各组小鼠主动脉小鼠制成冰冻切片，置于装有蒸馏水的染缸中冲洗2min，70％乙醇水溶液的染缸中2min，再放入装有油红o工作液(油红o储存液与去离子水按照3:2比例稀释后使用，现配现用，不可久存)的染缸中染色10min。取出切片架，置于装有70％乙醇水溶液的染缸中分化，在显微镜下观察效果。蒸馏水清洗2min。切片架浸入苏木素中1min后，放入自来水中返蓝。甘油明胶封片。光镜下观察拍照，观察粥样硬化斑块。

18.小鼠主动脉苏木素-伊红染色

取小鼠主动脉血管，4％多聚甲醛固定24h。常规石蜡包埋连续切片，常规脱蜡、脱水后进行(hemotoxilin-eosin，he染色)。光镜下观察拍照，观察主动脉组织结构。

19.vonkossa染色

实验开始第21周，取小鼠主动脉血管组织常规脱水、包埋、切片(厚度5μm)。切片常规脱蜡脱水，经蒸馏水洗1min后切片入vonkossa(solabio)银溶液强光照射15-60min，蒸馏水洗1min，然后用海波溶液处理2min，he染色液复染细胞核。经过规脱水、透明、中性树胶封片后，光镜下观察小鼠主动脉钙盐沉积情况并拍照。

20.免疫组织化学法检测小鼠主动脉组织ca1的表达

小鼠主动脉石蜡切片常规脱蜡，抗原修复后加入双氧水去内源性过氧化物酶(中杉金桥)，室温孵育10min，pbs洗3遍，滴加羊抗兔ca1多克隆抗体(1:200，cusabio)，4℃过夜。隔天复温后加入反应增强液(中杉金桥)，室温孵育20min，pbs洗3遍，再加入兔抗山羊igg聚合物(中杉金桥)。室温孵育20min，pbs洗3遍。滴加dab显色液，立即镜下观察，自来水终止显色。苏木素复染5min，自来水浸泡1min，酒精梯度脱水干燥，二甲苯透明后封片，光镜下观察拍照。

21.统计学处理

采用spss17.0软件(biomedicalcomputerprograms)进行正态和方差齐性的检验。对于符合检验标准的数据以表示。采用单因素方差分析进行多组间显著性检验，两两比较采用lsd法，p＜0.05为差异有统计学意义。

三、结果

1.检测ca1在动脉粥样硬化组织中的表达

本申请用real-timepcr和westernblot检测ca1在患有动脉粥样硬化的主动脉瘤和主动脉夹层术后组织中的表达情况。结果显示，人动脉粥样硬化组织中有ca1的蛋白表达，且比健康人主动脉组织中含量高(*p<0.05，p＝0.0204)，分子量为29kd，结果见图1a～1c。与健康人主动脉组织相比，人动脉粥样硬化组织ca1mrna表达水平明显升高，且差异有统计学意义(*p<0.05，p＝0.029)，结果见图1d。

另外，本申请也检测了模型小鼠动脉粥样硬化组织中的ca1蛋白表达情况。与正常对照组(普通饲料喂养组)相比，动脉粥样硬化模型组小鼠ca1在蛋白表达水平明显增高，分子量为29kd，差异有统计学意义(p＝0.002)。与模型组相比，治疗组和预防治疗组小鼠ca1蛋白水平明显降低，差异有统计学意义(p值分别为0.014和0.003)。结果见图1e、1f。

2.研究ca1对大鼠血管平滑肌细胞(rat-vsmc)钙化的作用

本申请用β-磷酸甘油(β-gp)诱导rat-vsmc细胞钙化，同时也用ca1抑制剂乙酰唑胺(az)处理培养细胞。由于乙酰唑胺被溶于dmso，所以本研究也用dmso做对照组。rat-vsmc细胞经β-gp培养14天后，茜素红染色检测到大量橘红色钙化结节，而正常对照组经茜素红染色后未发现钙化结节。尽管有β-gp诱导，加入az后钙化结节也很少见到，但dmso组仍可观察到很多钙化结节。结果见图2a。十六烷基氯化吡啶定量检测细胞钙化水平的结果与显微镜观察基本相似，β-gp诱导后细胞钙化水平显著升高(p<0.001)。加入az后细胞钙化水平陡然下降(p<0.001),基本与未诱导水平相同(p>0.05)。结果见图2b。结果表明，经β-磷酸甘油处理后，rat-vsmc确实开始了生物矿化过程，产生了大量的钙沉积。当ca1的抑制剂az被加入后，β-gp诱导细胞钙化被抑制。

本申请采用real-timepcr对rat-vsmc细胞钙化前后骨化标志物runx2、alp、bmp的mrna表达进行了检测。与正常对照组相比，诱导钙化细胞的runx2、alp、bmp表达量出现显著性增高(p分别为0.038、0.0038和0.046)，说明rat-vsmc在加入钙化诱导培养基后细胞确实发生了生物矿化，结果与之前的茜素红染色结果一致。经az处理的rat-vsmc细胞其成骨标志基因runx2、alp、bmp表达量明显减少，与β-gp加dmso混合组相比差异具有统计学意义(p分别为0.048、0.017和0.042)，见图3。以上结果进一步说明ca1抑制剂能有效抑制rat-vsmc细胞的生物矿化过程。

本申请采用westernblot分析rat-vsmc细胞ca1蛋白表达量的变化。结果表明，rat-vsmc细胞钙化后，ca1蛋白表达显著增高(*p<0.05，p＝0.0101)，经乙酰唑胺处理后ca1的表达量减少，钙化程度明显降低(**p<0.01，p＝0.004)，结果见图4a。以上结果证明钙化过程中ca1表达升高，进一步显示ca1抑制剂能有效抑制rat-vsmc细胞的生物矿化过程。

收集四组细胞悬液，用流式细胞术分析各细胞因子(il-10、ifn-γ、il-5、il-2、tnf-α、gm-csf、il-4、il-13、il-6)的水平变化。结果表明，与正常对照组相比，rat-vsmc细胞钙化后ifn-γ、tnf-α、gm-csf、il-6水平明显升高(p分别为0.002、<0.001、0.003、0.023)。乙酰唑胺处理后ifn-γ、tnf-α、gm-csf、il-6浓度明显下降(p分别为0.026、<0.001、0.011和0.014)，差异有统计学意义。结果见图4c。

3.研究ca1表达对rat-vsmc细胞的作用

本申请用anti-ca1sirna转染rat-vsmc细胞，用westernblotting观察细胞内ca1表达受到了抑制后细胞的行为变化。与allstarsirna组相比，anti-ca1sirna处理后细胞ca1表达降低53％，差异有统计学意义(p＝0.0046)，结果见图5a、5b。说明anti-ca1sirna对ca1的抑制效果显著，可用于后续实验。

本申请用cck-8分析法检测ca1表达被抑制后，rat-vsmc细胞的增殖状况。结果显示，rat-vsmc细胞被anti-ca1sirna组转染24后，与allstarsirna组相比在细胞增殖上无统计学差异(p＝0.3806),但转染48、72小时后，anti-ca1sirna处理组与allstarsirna处理组在细胞增殖上有统计学差异(p分别为0.0021和0.0067)，结果见图5c。说明ca1被抑制后rat-vsmc细胞的增殖能力降低，ca1表达影响细胞增殖能力。

本申请用transwell方法检测抑制rat-vsmc细胞内ca1表达后细胞迁移能力。统计结果显示，与allstarsirna组相比，anti-ca1sirna组细胞迁移能力明显降低，差异有统计学意义(p<0.0001)，结果见图5d～5f。由此说明ca1表达可以调控rat-vsmc细胞的迁移能力。

本申请用流式技术检测抑制rat-vsmc细胞内ca1表达后细胞凋亡能力。转染48小时后，与allstarsirna处理组相比，anti-ca1sirna处理组rat-vsmc细胞凋亡增高，差异有统计学意义(p＝0.0353)，结果见图5g～5h。

4.研究ca1表达及其抑制剂醋甲唑胺对动脉粥样硬化小鼠模型的作用

本申请采用经典apoe-/-小鼠高脂饲料喂养的方法建立动脉粥样硬化模型。整个实验动物喂养期间，四组小鼠精神活跃，毛色光滑正常，皮肤状态良好，无明显差异。每周记录小鼠的进食量和体重变化。随着喂养时间的变化，四组小鼠的体重均随时间的增加而增加，不同时间点小鼠的体重存在明显差异。与正常对照组相比，其他三组体重增长较快，但高脂饮食组间小鼠体重无明显差异。进食量在四组之间不存在显著差异。结果见图6a。

21周喂养结束后，四组小鼠分别取血检测血清血脂水平。血清血脂检测结果数据显示，与正常对照组相比，高脂高胆固醇模型组小鼠血清tc、tg、ldl-c含量明显升高(p分别<0.001、<0.001和0.001)，hdl-c含量明显减少(p<0.001)，差异有统计学意义。经醋甲唑胺灌胃治疗的小鼠血清tc、tg、ldl-c水平明显减低(p值分别为0.0036、0.0039和0.0056)，hdl-c水平明显增高(p＝0.012)。醋甲唑胺治疗组小鼠血清与模型组小鼠血清相比tc、tg、ldl-c水平减低(p分别为0.0014、0.0013和0.001)，hdl-c水平明显增高(p＝0.004)，差异有统计学意义。醋甲唑胺预防治疗组小鼠血清与治疗组小鼠血清相比tc、tg、ldl-c水平减低，但tc、tg差异无统计学意义(p值分别为0.502和0.158)，ldl-c(p＝0.009)。hdl-c水平增高，但没有统计学差异(p＝0.506)。同组间小鼠血清tc、tg、ldl-c、hdl-c没有明显差异。结果见图6b。计算各组小鼠动脉硬化指数(ai)＝[tc-(hdl-c)]/hdl-c，与正常对照组相比，模型组小鼠动脉粥样硬化指数明显升高(p<0.001)。与模型组相比，醋甲唑胺治疗组和预防治疗组动脉粥样硬化指数明显降低，差异有统计学意义(p分别<0.001、p<0.001)。结果见图6c。

试剂盒测定喂养21周各组小鼠血清中no的含量。检测结果显示，与正常对照组相比，高脂高胆固醇模型组小鼠血清no的含量降低(p＝0.014)。与模型组相比，醋甲唑胺治疗组小鼠血清no水平明显升高(p＝0.041)，差异有统计学意义，预防治疗组小鼠血清no水平也明显升高(p＝0.041)，差异有统计学意义。与治疗组相比，预防治疗组小鼠血清no水平升高，但差异没有统计学意义，结果见图6d。

收集各组小鼠血清，用流式细胞术分析各细胞因子(il-10、ifn-γ、il-5、il-2、tnf-α、gm-csf、il-4、il-13、il-6、cxcl1/kc、ccl2/mcp-1、il-18、il-12p70、il-1β、il-17a、il-33、il-1α)的水平变化。结果表明，在小鼠血清中，与正常对照组相比，模型组小鼠ifn-γ、tnf-α、gm-csf、il-6、cxcl1/kc和ccl2/mcp-1水平明显升高(p分别为0.015、0.014、0.037、0.0026、0.004和<0.001)。与模型组相比，醋甲唑胺治疗组ifn-γ、tnf-α、il-6、cxcl1/kc、ccl2/mcp-1浓度明显下降(p分别为0.036、0.02、0.0015、0.00105和0.005)，gm-csf浓度也下降，但差异无统计学意义(p＝0.216)。与模型组相比，醋甲唑胺预防治疗组ifn-γ、tnf-α、gm-csf、il-6、cxcl1/kc和ccl2/mcp-1浓度也明显下降(p分别为0.037、0.019、0.046、0.0027、0.0296和0.007)。与正常对照组相比，模型组中其余细胞因子浓度皆无统计学差异(p>0.05)。结果见图6e、6f。

喂养至21周，小鼠主动脉大体标本用苏丹红iv染色。结果显示，白色区域为正常主动脉内膜，红色区域为动脉粥样硬化斑块染色。与正常对照组相比，高脂高胆固醇模型组小鼠主动脉粥样硬化斑块面积明显增多，醋甲唑胺治疗组小鼠主动脉斑块面积减少，预防治疗组面积更小，结果见图7a。结果提示，灌胃醋甲唑胺能小鼠显著减弱动脉粥样硬化斑块的形成。

喂养至21周，取小鼠主动脉靠近根部的一段血管，制成冰冻切片。小鼠主动脉横切面进行油红o染色检测动脉粥样硬化斑块形成及脂肪沉积情况。正常对照组主动脉腔壁光滑，无动脉粥样硬化斑块形成，模型组主动脉内膜红染最为明显，出现大量脂质点、脂质条纹及典型的动脉粥样硬化斑块突出于动脉内膜。醋甲唑胺治疗组和预防治疗组小鼠均有不同程度的动脉粥样硬化斑块形成，但预防治疗组斑块大小与数量明显小于醋甲唑胺治疗组，更小于模型组的。结果见图7b。结果提示，给予apoe^-/-小鼠灌胃醋甲唑胺能显著减轻主动脉横切面动脉粥样硬化病变程度。

分别在喂养第21周处死四组小鼠制成切片进行he染色观察动脉粥样硬化程度。斑块病变程度随喂养时间延长逐渐加重。光学显微镜下观察各组小鼠主动脉石蜡切片he染色情况。正常对照组小鼠主动脉无斑块形成，血管内壁薄且光滑，内皮细胞和血管平滑肌细胞排列整齐，中膜厚度正常。模型组小鼠可见明显向心性动脉粥样硬化斑块，大量泡沫细胞形成和堆积其中，出现大量胆固醇结晶，平滑肌层松弛，结构紊乱，炎性细胞聚集，主动脉内膜增厚，凸向血管腔，管腔狭窄明显，醋甲唑胺治疗组和醋甲唑胺预防治疗组动脉粥样硬化程度明显减弱，与治疗组相比，预防治疗组动脉粥样硬化程度更弱，结果见图7c。

同时vonkossa染色结果显示，模型组小鼠内膜有大量明显的黑褐色钙盐沉积。与模型组相比，醋甲唑胺处理组和预防处理组小鼠均未见明显钙盐沉积，表明醋甲唑胺处理后可使小鼠动脉粥样硬化程度明显减弱。见图7d。

免疫组织化学法检测上述小鼠主动脉组织连续切片中ca1的表达情况。与正常对照组相比，模型组可见大量棕黄色免疫信号，表明ca1在模型组中高表达，且钙化部位出现ca1高表达。与模型组相比，治疗组免疫信号明显减少，表明动脉粥样硬化程度减弱伴随有ca1表达量的减少，预防治疗组免疫信号较模型组明显减少，提示ca1的表达量减少。结果见图7e。进一步说明醋甲唑胺的应用对动脉粥样硬化起到一定的治疗作用。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

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<110>常晓天

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