祖师麻甲素在制备治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染引起的肺部疾病相关制剂的应用的制作方法

本发明涉及祖师麻甲素的新用途，具体是祖师麻甲素在制备治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染引起的肺部疾病相关制剂的应用。

背景技术：

细菌性肺炎是目前全球性公共健康难题，是威胁人类健康的重大问题，其发病率和死亡率逐年增高。肺部细菌感染可造成广泛的炎性细胞浸润和组织损伤，严重情况下可导致呼吸道窘迫，是导致死亡的主要原因之一。金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌等被证明是导致细菌性肺炎的重要病原体。临床上，通常根据药敏试验结果，选择该细菌敏感的抗生素进行治疗。在金黄色葡萄球菌引起的肺炎中，细菌产生的凝固醇可在菌体外形成保护膜以抗吞噬细胞的杀灭作用，而各种酶的释放可导致肺组织的坏死和脓肿形成。

耐甲氧西林金葡菌(mrsa)为医院及社区感染的主要病原菌之一。具有广谱耐药性，对β-内酰胺类和头孢类抗生素均耐药，对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹喏酮类、磺胺类、利福平均产生不同程度的耐药，对万古霉素敏感。mrsa感染可引起菌血症，也见于肺炎、外科感染、溃疡面感染、侵袭性导管相关感染等。由于mrsa对多数抗生素不敏感，导致由其引发的细菌性肺炎治疗时间延长，总疗程可达数周至数月，其治疗方案通常需根据病情采用吸氧、止咳化痰、输液与抗休克等。

祖师麻甲素(daphnetin)是从瑞香属植物长白瑞香(daphnekoreannakai)中提取出来的有效成分，化学名为7，8-二羟基香豆素(7，8-dithydroxycoumarin)，主要存在于瑞香科属植物中。祖师麻甲素具有扩张冠状血管，增加冠脉血流量，减少心肌耗氧量，改善心肌代谢促进心功能恢复，扩张末梢血管以及抗动脉血栓形成和抑制血小板凝集作用，并有兴奋垂体-肾上腺皮质系统的作用。除此之外，祖师麻甲素还具有降血脂、抗炎、镇静催眠、抗疟疾、杀蚜虫、抗菌等作用。目前已有其抗菌活性的报道，主要包括：大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌等。目前还尚未有祖师麻甲素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染引起的细菌性肺炎活性的相关报道。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供祖师麻甲素的一种新用途。

为了解决上述技术问题，本发明公开了祖师麻甲素在制备治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染引起的肺部疾病相关制剂的应用。

其中，所述祖师麻甲素是从瑞香属植物中提取的天然产物，具有7,8-二羟基香豆素的结构：

进一步地，所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染引起的肺部疾病包括肺炎、肺损伤。

其中，所述相关制剂包括药物、保健品或食品。

所述的药物包含祖师麻甲素和药学上可接受的载体。

进一步地，所述的药物为祖师麻甲素与药学上可接受的载体制成的粉剂、片剂、注射液、胶囊或口服液。

其中，在制备成片剂时，将祖师麻甲素添加载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然而压片制成片剂。

在制备成粉剂时，将祖师麻甲素添加载体乳糖或玉米淀粉，制粒，整粒，干燥，制成粉剂。

在制备成胶囊剂时，将祖师麻甲素添加载体乳糖或玉米淀粉，制粒，整粒，干燥，然后装胶囊制成胶囊剂。

在制备成口服液制剂时，取祖师麻甲素加入单糖浆，分装，灭菌，即得口服液制剂。

本发明和现有技术相比具有以下优点：(1)实验结果表明，本发明首次发现祖师麻甲素能够有效改善耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引起的肺部感染的症状；(2)本发明首次发现祖师麻甲素能够有效增强巨噬细胞对细菌的清除能力，降低肺组织和血液中细菌菌落总数；(3)祖师麻甲素能够降低肺泡灌洗液及肺组织中炎症因子的分泌，且对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染后所引起的炎症信号通路的活化具有抑制作用，显著延长小鼠的生存期；(4)本发明提供的具有防治耐甲氧西林金黄色葡萄球菌肺部感染相关疾病的复方组合物，可以方便和药物载体制备成多种剂型，临床上服用方便，并且使用安全，长期服用无毒副作用。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为祖师麻甲素对小鼠肺部病理结构及炎症细胞浸润的影响情况；

图2为祖师麻甲素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌肺部感染小鼠肺泡灌洗液和肺组织中炎症因子表达的影响情况，其中，**p<0.01；

图3为祖师麻甲素对小鼠肺组织和血液中细菌载量的影响情况，其中，*p<0.05，#p<0.05；

图4为祖师麻甲素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌肺部感染小鼠存活率的影响情况；

图5为祖师麻甲素对巨噬细胞杀菌功能的影响情况，其中，**p<0.01。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。

1、实验材料

1.1实验用药物及试剂：祖师麻甲素(sigma-aldrich)；dmso(sigma-aldrich)；elisa试剂盒(r&dsystems)；小鼠巨噬细胞株raw264.7和金黄色葡萄球菌mrsausa300(atcc)；抗体(cellsignalingtechnology)。

1.2实验用动物及饲养：c57/bl6小鼠，4-6周龄，由南京大学模式动物所提供；全价营养颗粒饲料：由江苏省协同医药生物技术有限公司提供；饲养条件：室温20±2℃，湿度55-65％，明暗交替，光度适度，通风洁净良好。

2、实验方法

2.1金葡菌肺部感染模型的构建。将balb/c小鼠(6-8周龄)分为正常对照组、金葡菌感染组、祖师麻甲素治疗组，每组8只。祖师麻甲素治疗组小鼠，腹腔注射祖师麻甲素，其他组小鼠注射dmso，1小时后使用5％的异氟烷进行吸入诱导麻醉，待小鼠进入外科深麻醉期后，以2％的浓度维持麻醉。正常对照组气管灌注pbs，其他组以耐甲氧西林金葡菌(10⁸cfu/只)气管灌注建立感染模型。12小时后，处死部分小鼠，取肺组织用4％多聚甲醛固定后，进行h&e染色，观察祖师麻甲素治疗对小鼠肺部病理特征的改善情况。

2.2祖师麻甲素对机体炎症反应的作用。每组取5只小鼠进行肺泡灌洗，通过elisa方法检测肺泡灌洗液(balf)中炎症因子(il-6、il-1β、tnf-α)的表达水平；将未经灌洗小鼠的肺取出，匀浆后提取rna，q-pcr法检测肺组织中炎症因子的表达情况(il-6、il-1β、tnf-α)；以平板稀释法分析肺组织和血液中细菌的载量；记录祖师麻甲素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细菌性肺炎小鼠生存率的影响并绘制生存曲线。

2.3祖师麻甲素对巨噬细胞杀伤耐甲氧西林金黄色葡萄球菌作用的影响情况。raw264.7细胞用无菌pbs洗两遍，分为daph组(160μm)和dmso细胞组，预处理1h后，以耐甲氧西林金葡菌(moi＝10)感染细胞2h；用pbs洗2遍后，加入含有5μg/ml的溶葡萄球菌素的培养基培养细胞；分别于8、18、24h去掉上清，pbs洗2遍，用250μl0.1％tritonx-100充分裂解细胞，收集至离心管中；将含菌细胞裂解液用无菌pbs梯度稀释，分别取10μl接种于lb琼脂平板上，于37℃培养16-18h，计数cfu，计算金黄色葡萄球菌的存活率。

3、实验结果

3.1祖师麻甲素对小鼠肺部病理结构及炎症细胞浸润的影响情况。如图1所示，未感染耐甲氧西林金葡菌的对照组小鼠气管上皮纤毛整齐排列，肺泡腔内无炎性分泌物，肺泡结构完好。金葡菌感染的模型组小鼠肺组织病理改变明显，支气管管腔狭窄，充满炎性渗出物，肺泡壁充血增厚，肺泡正常结构小时，肺泡腔内炎性细胞浸润，气管上皮纤毛脱落，部分纤毛消失；祖师麻甲素处理组小鼠肺组织与模型组比较，基本无炎性渗出物，部分肺泡及间质有炎性细胞分布，肺组织结构清晰，与模型组对比炎症明显减轻。

3.2祖师麻甲素对小鼠体内炎症反应的作用。如图2所示，经祖师麻甲素处理的小鼠肺泡灌洗液细胞及肺组织中的炎症因子il-6、tnf-α和il-1β的表达水平明显低于二甲基亚砜处理组，且有一定的时间依赖性，表明祖师麻甲素对细菌感染引起的炎症反应具有一定的抑制作用。为了检测祖师麻甲素对耐甲氧西林金葡菌感染小鼠生存期的影响，小鼠预先用5mg/kg的祖师麻甲素处理1小时(对照小鼠不接受祖师麻甲素处理，用二甲基亚砜处理)，然后气管灌注耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(10⁸cfu/只)，连续观察6天。祖师麻甲素处理可以显著延长耐甲氧西林金葡菌感染小鼠的生存期，如图4所示。金葡菌感染第12小时，取血，处死部分小鼠后取出肺组织，用平板稀释法，分别测定肺组织和血液中的细菌载量，图3结果表明经祖师麻甲素处理组小鼠肺组织和血液中的细菌载量明显低于二甲基亚砜处理组小鼠。

3.3祖师麻甲素对巨噬细胞体外杀菌功能的影响情况。分别以二甲基亚砜和祖师麻甲素预处理raw264.7细胞，再用耐甲氧西林金葡菌感染该细胞。如图5结果显示，比较金葡菌感染的不同时间点细胞内残余菌量，祖师麻甲素组较二甲基亚砜组有明显减少，特别是8、18小时时两者差异有显著性差异，表明祖师麻甲素处理可有效增强小鼠raw264.7巨噬细胞清除金黄色葡萄球菌的能力。

本发明提供了祖师麻甲素在制备治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染引起的肺部疾病相关制剂的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。