本发明属于联苯乙酸新用途的
技术领域：
，涉及联苯乙酸或其盐在制备凝血因子xa抑制剂药物中的应用。实验表明联苯乙酸及其盐具有显著的选择性抑制凝血因子xa的作用，临床上可用于治疗或者预防脑梗死、脑栓塞、心肌梗死、心绞痛、肺梗塞形成、肺栓塞、伯格氏疾病、重度静脉血栓形成、弥漫性血管内凝血综合症、瓣膜替换术或关节置换后的血栓形成、血管形成术的血栓形成和再闭合、系统炎性响应并发症、多器官功能紊乱并发症、体外循环期间的血栓形成。
背景技术：
：联苯乙酸作为非甾类抗炎药应用已经有数十年的历史，例如cn1073094a公开了联苯乙酸外用制剂，用于治疗减轻疼痛或者炎症，cn101168502a公开了联苯乙酸氨丁三醇盐的制备方法和用于解热镇痛药物的制备。通常所说的解热镇痛药物具有一定的抗凝血作用，是指其抗凝作用一般通过抑制血小板聚集发挥作用。长期应用可产生阿司匹林抵抗，产生耐药性。并且不可避免的会引起胃肠道出血风险，甚至较为严重的肝肾损害、瑞夷综合征等严重不良反应。目前，临床上治疗血栓性疾病的药物主要有抗血小板药物、溶血栓药和抗凝血药物3大类。由于传统的抗凝血药物在临床使用的局限性，新型口服抗凝药物如凝血因子xa抑制剂等成为了研究热点药物并逐步走向临床。凝血因子xa属于丝氨酸蛋白酶，其在凝血瀑布反应中有着重要作用，可通过内、外源性凝血路径予以激活。凝血因子xa的作用环节位于内源性和外源性凝血途径的交汇点，可裂解凝血酶原生成凝血酶，通过抑制凝血因子xa可抑制凝血酶的生成，从而抑制凝血。由于它不抑制已生成的凝血酶的活性，因而极少引起出血副反应。另外血中的凝血因子xa浓度远远小于凝血酶的浓度，也就是说凝血因子xa抑制剂发挥药效时的浓度要比凝血酶抑制剂低得多，因此其效果比凝血酶抑制剂会更好副作用会更小。到目前为止尚未发现联苯乙酸及其盐用作凝血因子xa抑制剂的报道。技术实现要素：本发明提供联苯乙酸及其盐在制备凝血因子xa抑制剂药物中的应用，所述联苯乙酸及其盐优选为联苯乙酸的盐，联苯乙酸的盐是指由联苯乙酸与药学上可接受的无毒碱制备的盐。其相应的盐可以方便地由包括无机碱和有机碱在内的药学上可接受的无毒碱制备。无机碱的盐包括铝盐、铵盐、钙盐、铜盐(铜和亚铜)、铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、锰盐(锰和亚锰)、钾盐、钠盐、锌盐等。优选的是铵盐、钙盐、镁盐、钾盐和钠盐。由药学上可接受的有机无毒碱制备的盐包括衍生自天然存在的和合成来源的伯胺、仲胺和叔胺的盐。可以形成盐的药学可接受的有机无毒碱包括例如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、n,n'-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、n-乙基吗啉、n-乙基哌啶、葡糖胺、氨基葡萄糖、组氨酸、异丙胺、二环己基胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等。更优选为联苯乙酸氨丁三醇盐。联苯乙酸及其盐作为凝血因子xa抑制剂，可有效治疗或者预防脑梗死、脑栓塞、心肌梗死、心绞痛、肺梗塞形成、肺栓塞、伯格氏疾病、重度静脉血栓形成、弥漫性血管内凝血综合症、瓣膜替换术或关节置换后的血栓形成、血管形成术的血栓形成和再闭合、系统炎性响应并发症、多器官功能紊乱并发症、体外循环期间的血栓形成。本发明的另一种目的是提供联苯乙酸及其盐制备治疗或者预防脑梗死、脑栓塞、心肌梗死、心绞痛、肺梗塞形成、肺栓塞、伯格氏疾病、重度静脉血栓形成、弥漫性血管内凝血综合症、瓣膜替换术或关节置换后的血栓形成、血管形成术的血栓形成和再闭合、系统炎性响应并发症、多器官功能紊乱并发症、体外循环期间的血栓形成的任一药物中的应用，所述联苯乙酸及其盐优选为联苯乙酸的盐，更优选为联苯乙酸氨丁三醇盐。为了实现本发明的目的，需要将联苯乙酸及其盐制成临床可用的药物剂型，优选为注射剂、片剂、胶囊、颗粒剂、干混悬剂、滴丸、分散体等。为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质、抗氧剂等中的一种或任意几种组合。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等中的一种或任意几种组合。崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等中的一种或任意几种组合。润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等中的一种或任意几种组合。助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等中的一种或任意几种组合。粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等中的一种或任意几种组合。甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等中的一种或任意几种组合。矫味剂包括：甜味剂及各种香精中的一种或任意几种组合。防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等中的一种或任意几种组合。基质包括：peg6000，peg4000，虫蜡等中的一种或任意几种组合。以上列举的辅料仅为举例说明，并不对本发明技术方案的范围构成任何限制。本发明为实现其目的采用的技术方案是：联苯乙酸或其盐在制备xa抑制剂药物中的应用，联苯乙酸或其盐、与药学上可接受的辅料组合制成药物。联苯乙酸或其盐在制备xa抑制剂药物中的应用，所述药物的剂型为临床可用的药物剂型。联苯乙酸或其盐在制备xa抑制剂药物中的应用，按重量份数计，原料包括联苯乙酸30份、蔗糖粉670份、海藻酸钠20份、甜菊素3份、羟丙基纤维素15份、十二烷基硫酸钠3份、日落黄0.1份、羧甲基淀粉钠15份，剂型为干混悬剂。联苯乙酸或其盐在制备xa抑制剂药物中的应用，按质量份数计，原料包括联苯乙酸盐12.0g-50.0份、注射用水1000-5000份，调ph值8.2，所述联苯乙酸盐为联苯乙酸氨丁三醇盐或联苯乙酸2-二甲基氨基乙醇盐，药物剂型为注射剂。联苯乙酸或其盐在制备xa抑制剂药物中的应用，按重量份数计，原料包括联苯乙酸镁50份、羧甲基淀粉钠9份、微晶纤维素22.5份、乳糖115.5份、聚维酮k301.5份、微粉硅胶1.5份，剂型为片剂。联苯乙酸或其盐在制备xa抑制剂药物中的应用，按重量份数计，原料包括联苯乙酸铵盐50份、淀粉50份、微晶纤维素25份、乳糖112份、糊精10份、硬脂酸镁3份，剂型为胶囊剂。所述联苯乙酸盐为联苯乙酸铝盐、联苯乙酸铵盐、联苯乙酸钙盐、联苯乙酸铜盐(铜和亚铜)、联苯乙酸铁盐、联苯乙酸亚铁盐、联苯乙酸锂盐、联苯乙酸镁盐、联苯乙酸锰盐(锰和亚锰)、联苯乙酸钾盐、联苯乙酸钠盐、联苯乙酸锌盐中的一种。优选的是铵盐、钙盐、镁盐、钾盐或者钠盐中的一种。所述联苯乙酸盐为由药学上可接受的有机无毒碱制备的盐，包括衍生自天然存在的和合成来源的伯胺、仲胺或者叔胺的盐中的一种。所述有机无毒碱为精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、n,n'-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、n-乙基吗啉、n-乙基哌啶、葡糖胺、氨基葡萄糖、组氨酸、异丙胺、二环己基胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺或者氨丁三醇中的一种。所述有机无毒碱为氨丁三醇。联苯乙酸或其盐在制备治疗或者预防脑梗死、脑栓塞、心肌梗死、心绞痛、肺梗塞形成、肺栓塞、伯格氏疾病、重度静脉血栓形成、弥漫性血管内凝血综合症、瓣膜替换术或关节置换后的血栓形成、血管形成术的血栓形成和再闭合、系统炎性响应并发症、多器官功能紊乱并发症、体外循环期间的血栓形成的任一药物中的应用。本发明的有益效果是：联苯乙酸及其盐具有凝血因子xa抑制剂，并且可以有效治疗或者预防脑梗死、脑栓塞、心肌梗死、心绞痛、肺梗塞形成、肺栓塞、伯格氏疾病、重度静脉血栓形成、弥漫性血管内凝血综合症、瓣膜替换术或关节置换后的血栓形成、血管形成术的血栓形成和再闭合、系统炎性响应并发症、多器官功能紊乱并发症、体外循环期间的血栓形成。具体实施方式为了证实本发明技术方案的技术效果，按照“一、具体实施例”中的实施例制成各种药物。同时本发明还进行了药效学实验，即“二、实验验证”中的实验例，但这些实施方式也不对本发明技术方案的范围构成任何限制。一、具体实施例实施例1：联苯乙酸干混悬剂制剂组方：联苯乙酸30克、蔗糖粉670克、海藻酸钠20克、甜菊素3克、羟丙基纤维素15克、十二烷基硫酸钠3克、日落黄0.1克、羧甲基淀粉钠15克。制备方法：1、按照制剂组方准备各组分，并粉碎；2、取1克甜菊素，0.05克日落黄、十二烷基硫酸钠3克、联苯乙酸30克，500克蔗糖粉，按等量递增的方法混匀，用25ml20％的乙醇水溶液制粒，得到手握成团、手松则散、有毛边的松散颗粒和粉末，为a部分，共548克；3、取剩余的甜菊素2克、日落黄0.05克和蔗糖粉170克，以及羟丙基纤维素15克、羧甲淀粉钠15克和海藻酸钠20克，按等量递增的方法混匀，用15ml20％的乙醇水溶液制粒，得到有毛边的松散颗粒，为b部分，共231g；4、将步骤2得到的所述a部分和步骤3得到的所述b部分混匀，用25ml40％的乙醇水溶液制粒，得到手握成团、手松则散的松散半湿颗粒；5、将步骤4得到的所述松散半湿颗粒在60℃、真空度为0.05-0.07mpa的条件下干燥40-60分钟，过2号筛整粒，取通过2号筛但不能通过3号筛的颗粒，分装，共得987袋，7.6克/袋。实施例2：联苯乙酸氨丁三醇盐注射剂原料：联苯乙酸氨丁三醇盐12.0g、注射用水1000ml、无水碳酸钠溶液，调节ph值至8.2。制备方法：称取联苯乙酸氨丁三醇盐12.0g，加入冷却后的注射用水1000ml，用0.1mol/l无水碳酸钠溶液适量使溶解，按配制总量加入0.1％针用活性炭(即0.8g)，60℃保温搅拌15分钟后过滤脱碳，冷却室温后补加冷却后注射用水，调节ph值至8.2，搅均，经0.22μm的微孔滤膜过滤后灌封于5ml的西林瓶中，每瓶灌装4ml，封口，经121℃条件下15min热压灭菌即得，共得232支成品。实施例3联苯乙酸镁盐片剂原料：联苯乙酸镁50g、羧甲基淀粉钠9g、微晶纤维素22.5g、乳糖115.5g、聚维酮k301.5g、微粉硅胶1.5g。制备方法：称取分别粉碎过200目筛的联苯乙酸镁50g，羧甲基淀粉钠9.0g，微晶纤维素22.5g，乳糖115.5g，聚维酮k301.5g，微粉硅胶1.5g，将联苯乙酸镁、羧甲基淀粉钠、微晶纤维素、乳糖充分混匀，将聚维酮k30用30ml纯净水溶解作为粘合剂，制成软材，用18目筛制粒后，于60℃干燥，干颗粒过16目筛整粒，加入微粉硅胶混匀，调节片重为200毫克/片压片即得，共制成957片成品。实施例4：联苯乙酸铵盐胶囊剂原料：联苯乙酸铵盐50g、淀粉50g、微晶纤维素25g、乳糖112g、糊精10g、硬脂酸镁3g。制备方法：称取分别粉碎过200目筛的联苯乙酸铵盐50g，淀粉50g，微晶纤维素25g，乳糖112g，糊精10g，硬脂酸镁3g，将联苯乙酸铵盐、淀粉、微晶纤维素、乳糖充分混匀，用60℃的纯净水30ml，将糊精溶为糊状作为粘合剂，制成软材，用20目筛制粒后，于65℃干燥，干颗粒过18目筛整粒，加入硬脂酸镁混匀，按照每粒胶囊内容物250毫克装入胶囊即得，共制成978粒成品。实施例5：联苯乙酸二乙胺盐滴丸剂原料：联苯乙酸二乙胺盐50g、peg40045g、羧甲基淀粉钠5g、peg6000100g。制备方法：称取联苯乙酸二乙胺盐50g，peg40045g，羧甲基淀粉钠5g，peg6000100g，混合共融后，制成滴丸，丸重20毫克，共得成品9845粒成品。实施例6：联苯乙酸二环己基胺盐颗粒剂原料：联苯乙酸二环己基胺盐45g，蔗糖粉4944g，食用香精1g，聚维酮k3010g。制备方法：称取分别粉碎过200目筛的联苯乙酸二环己基胺盐45g，蔗糖粉4944g，食用香精1g，聚维酮k3010g，将联苯乙酸二环己基胺盐、蔗糖粉、食用香精充分混匀，用纯净水100ml，将聚维酮k30溶解作为粘合剂，制成软材，用20目筛制粒后，于60℃干燥，干颗粒过18目筛整粒，按照5克/袋装袋即可，共制成成品938袋成品。实施例7：联苯乙酸2-二甲基氨基乙醇盐注射剂原料：联苯乙酸2-二甲基氨基乙醇盐50.0g、注射用水5000ml、无水碳酸钠溶液、调节ph值至8.2。制备方法：称取联苯乙酸2-二甲基氨基乙醇盐50.0g，加入冷却后的注射用水5000ml，用0.1mol/l无水碳酸钠溶液适量使溶解，按配制总量加入0.1％针用活性炭(即5g)，60℃保温搅拌15分钟后过滤脱碳，冷却室温后补加冷却后注射用水，调节ph值至8.2，搅均，经0.22μm的微孔滤膜过滤后灌封于安瓿中，每支灌装5ml，封口，经121℃条件下30min热压灭菌即得，共得991支成品。实施例8：联苯乙酸哌啶盐分散体原料：100g联苯乙酸哌啶盐、800g的醋酸羟甲基丙基纤维素琥珀酸酯、3000ml纯净水。制备方法：称取100g联苯乙酸哌啶盐与800g的醋酸羟甲基丙基纤维素琥珀酸酯均匀溶解于3000ml纯净水中，然后在喷雾干燥机中进行喷雾干燥，即得联苯乙酸哌啶盐固体分散体粉碎，即得。实施例9：联苯乙酸n,n'-二苄基乙二胺盐软胶囊原料：联苯乙酸n,n'-二苄基乙二胺盐600g、5g司盘20、5400g玉米油、10gbht(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)。制备方法：称取联苯乙酸n,n'-二苄基乙二胺盐600g与5g司盘20混匀，加入5400g玉米油中，搅拌至均匀，加入10gbht(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)充分搅拌至均匀，按照每粒胶囊内容物0.6克制成软胶囊，共制成9887粒成品。二、试验验证实验例1：体外xa抑制作用体外评价通过测定ic50值来评价受试化合物对人或大鼠的xa因子或其他酶如凝血酶或胰蛋白酶的抑制能力，其中ic50值与抑制常数ki相关联。在显色测定中使用纯化的酶。使用flexstationⅲ(美国分子仪器公司)测定37℃下时间进程中线性部分(通常是加入底物2-10分钟后)在405nm处的吸光度的变化来测量发色底物水解的初始速度。通过绘制水解的相对速度(与未受抑制的对照组相比)对受试化合物浓度的对数曲线后，通过线性回归计算，测定导致底物水解的速率降低50％的抑制剂的浓度。根据cheng-prusoffequationki＝ic50/(1+[s]/km)计算酶抑制常数(ki),其中[s]为底物浓度，km为通过双倒数作图法确定的米-曼二氏常数。通过graphpadprism软件得到受试化合物的ic50值。使用"形剂量效应(可变斜率)"拟合曲线。人/大鼠凝血因子xa试验：采用tris-hcl缓冲液(50mm,ph8.3，150mmnacl)测定人或人鼠的凝血因子xa活性抑制作用。通过将50μl人凝血因子xa(enzymeresearchlaboratories,inc；终浓度为8.36nm或50μl大鼠凝血因了xa(enzymeresearchlaboratories,inc；终浓度为57.5nm)的缓冲液滴加到greiner384微量滴定板的合适孔中的方法测定ic50。含2μl2％(v/v)dmso的测定缓冲液(未受抑制的对照组)或各种浓度的待测化合物稀释在含有2％(v/v)dmso的测定缓冲液中，并添加48μl衬底s-2222(chromogenic；化学式：bz-iie-glu(γ-or)-gly-arg-pna·hclr＝h(50％)，其中r＝ch3(50％))的测定缓冲液，终浓度为0.172mm。该试验中将受试化合物与酶预培养10分钟，然后加入底物s-2222得到100μl终体积以开始试验。ki<10μm的受试化合物被认为是积极的。经上述试验方法测定，本发明所述联苯乙酸及盐的ki均小于10μm，因此，联苯乙酸及其盐可作为有效的xa因子抑制剂。人凝血酶试验：采用缓冲液(10mm的hepes缓冲液，ph7.4，2mmcacl2)测定人凝血酶活性抑制作用。选择greiner384微量滴定板中合适的孔测定ic50，含有50μl人凝血酶(sigma公司)的缓冲液，终浓度为0.05nih单位/ml，含2μl2％(v/v)dmso的测定缓冲液(未受抑制的对照组)或各种浓度的待测化合物稀释在含有2％(v/v)dmso的测定缓冲液中；加入含有48底物s-2238(chromogenix；化学式：h-d-phe-pip-arg-pna·2hcl)的缓冲液，终浓度为3μm。该试验中将受试化合物与酶预培养10分钟，然后加入底物得到100μl终体积以开始试验。表1：联苯乙酸及其盐体外xa抑制试验结果由以上实验结果可以看出，联苯乙酸及其盐均对凝血因子xa有较好的抑制作用，对凝血酶本身的作用并不明显。实验例2联苯乙酸及其盐的凝血酶原时间(pt)试验该实验的目的是测量受试化合物的体外抗凝血活性。从麻醉状态下的大鼠腹主动脉抽血。用含有1/10体积的0.11m柠檬酸钠的塑料管收集血液，在2500g、4℃立即进行离心分离10分钟，得到血浆，并在-80℃下保存。通过使用市售的试剂盒(武汉塞力斯生物科技有限公司，中国)的温控全自动血凝分析仪(compact-x，behnk-elektronik(be)，德国)测量凝血酶原时间(pt)。用dmso(10μm)制备受试化合物(依度沙班和联苯乙酸及其盐)的原液，血浆中进行系列稀释(分别为0、0.25、0.50、l.00、2.00，4.00μm)。将0.2mlpt试剂(在37℃下温育3分钟)加入到0.1ml的受试血浆和正常对照血浆(在37℃下温育3分钟)。测量凝血时间，并与对照血浆相对比。试验结果用形成初始血纤维蛋白链双倍时间(2×pt)的抑制剂浓度表示。结果见表2。表2：联苯乙酸及其盐体外抗凝活性试验结果受试药物2×pt(μm)依度沙班0.63联苯乙酸1.04联苯乙酸镁盐0.9联苯乙酸铵盐1.05联苯乙酸氨丁三醇盐0.59联苯乙酸二乙胺盐1.19联苯乙酸二环己基胺盐1.13联苯乙酸2-二甲基氨基乙醇盐1.25联苯乙酸哌啶盐1.46联苯乙酸n,n'-二苄基乙二胺盐1.02联苯乙酸钠盐0.84联苯乙酸钙盐1.09联苯乙酸2-二甲基氨基乙醇盐1.33联苯乙酸乙醇胺盐1.34联苯乙酸乙二胺盐0.98联苯乙酸n-乙基吗啉盐1.38联苯乙酸n-乙基哌啶盐0.89由以上结果，可以看出，联苯乙酸及其盐均在小于1.5μm的浓度达到双倍凝血酶原时间，可见联苯乙酸及其盐均具有较强的体外抗凝血活性。实验例3联苯乙酸及其盐的抗血栓活性研究动静脉分流大鼠模型：用大鼠动静脉(av)分流血栓形成模型验证联苯乙酸及其盐制成药物(参照实施例1-9)的抗血栓作用，测试方法如下：健康wistar雄性大鼠40只，随机分成对照组(给予同体积生理盐水)、低剂量组(受试药物1.5mg/kg)、中剂量组(受试药物3mg/kg)、高剂量组(受试药物6mg/kg)。采用灌胃(固体制剂加生理盐水制成混悬液后灌胃；液体制剂，加生理盐水稀释后直接灌胃)法给药，给药后1小时行动静脉旁路血栓形成术，用乌拉坦麻醉大鼠(1.2g/kg，ip)，将大鼠背固定于37℃恒温解剖台上。分离动脉和左颈外静脉，在三段聚乙烯管的中段放入一根长5cm的4号手术丝线，将肝素生理盐水溶液(50μl/ml)充满聚乙烯管腔，将管两端分别插入右颈总动脉和左颈外静脉以形成瘘管，立即松开动脉夹，准确计时15min，中断血流，迅速取出丝线称重，总重量减去丝线重量即血栓重量。观察血栓重量及血栓形成抑制率，血栓形成抑制率计算公式如下：抑制率(％)＝(对照组血栓重-给药组血栓重)/对照组血栓重×100％实验结果见表3。表3联苯乙酸及其盐的抗血栓活性体内研究结果由以上结果可以看出，联苯乙酸及其盐制成的药物，在三个剂量均表现出较强的抑制血栓生成的活性。当前第1页12