一种二氢杨梅素固体脂质纳米粒及制备方法与流程

本发明属于药物制剂领域，涉及一种二氢杨梅素固体脂质纳米粒及其制备方法。

背景技术：

二氢杨梅素(dihydromyricelin，dmy或dhm)为藤茶中主要黄酮类化合物，属于二氢黄酮醇类。二氢杨梅素具有抗肿瘤、抗炎抑菌、抗氧化、降降血脂血糖、解酒护肝等多种药理活性。基于广泛的药理活性和良好的安全性，二氢杨梅素极具开发价值。二氢杨梅素能够抑制肝癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞和膀胱癌细胞的增殖，促进多种肿瘤细胞凋亡，因此将二氢杨梅素制成肿瘤靶向给药系统，将解决肿瘤耐药性问题。

但由于其结构中含有6个酚羟基，易被金属离子、氧气、光线等氧化，以及ph值的增加和温度的升高均会加速其氧化进程。室温条件下，其水溶性(0.2mg/ml)和脂溶性(正辛醇-水(ph5.0)中的油水分配系数0.4503)较差。dmy药动学研究结果表明，dmy在大鼠体内肠黏膜渗透率较低，可推测其口服用药生物利用度差，体内半衰期短，吸收、代谢迅速。故其稳定性差、成药性差、体内半衰期短、溶解度低和吸收代谢快等缺陷严重影响了其临床应用和体内药效。

目前已有报道二氢杨梅素的长循环纳米脂质体、脂质体、微囊、自乳化系统、包合物等均不同程度存在粒径较大、包封率、载药量不高的问题，有待提高。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题，在于提供一种二氢杨梅素固体脂质纳米粒及制备方法，将二氢杨梅素制成固体脂质纳米粒以改善其临床应用缺陷，并提高包封率和载药量。

本发明是这样实现的：

本发明首先提供了一种二氢杨梅素固体脂质纳米粒，以固态的天然或合成的类脂为载体，将二氢杨梅素药物包裹或夹嵌于类脂核中，制成粒径为10-1000nm的胶粒给药体系，其原料组成包括载体、表面活性剂、二氢杨梅素，以水为分散介质。

进一步地，所述载体包括室温下呈固态的山嵛酸甘油酯、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯。其中优选油包水型单硬脂酸甘油酯，制备的二氢杨梅素纳米粒粒径小，包封率、载药量高。

进一步地，所述表面活性剂优选具有较佳的乳化能力和安全性的非离子型表面活性剂泊洛沙姆188，另外其对二氢杨梅素本身具有较好的溶解性。

优选地，本发明的原料配比按重量分数为：载体2.5％～5.5％，表面活性剂2％～10％，二氢杨梅素0.3％～0.5％，余量为水。

最优选地，本发明的原料配比按重量分数为：二氢杨梅素0.4％，单硬脂酸甘油酯3％，泊洛沙姆1886.5％，余量为水。

本发明还提供了所述二氢杨梅素固体脂质纳米粒的制备方法，即高压均质法，具体包括如下步骤：

a)将二氢杨梅素粉末和载体混合，加入无水乙醇溶解，加热至设定温度t使其完全熔化形成油相；

b)将表面活性剂和超纯水混合溶解，并加热至温度t形成水相；

c)将水相及油相在相同的温度t下混合并充分搅拌，使无水乙醇挥发完全得到混合液；

d)采用高速均质分散机将混合液均质分散1分钟得初乳液；

e)将初乳液经高压均质机循环均质3次得到二氢杨梅素固体脂质纳米粒混悬液。

所述的步骤a、b中的温度t为所选用的载体的熔点温度。

所述步骤d中形成粗乳液的判断依据为将样品轻微摇晃，观察挂壁回流乳液色泽均一，较为透亮为准。

所述的步骤d中高速均质分散机的转速为8000r/min。

所述的步骤e中高压均质机的压力为800bar。

本发明还提供了另一种所述二氢杨梅素固体脂质纳米粒的制备方法，即熔融超声法，具体包括如下步骤：

将表面活性剂和超纯水混合溶解，并加热至温度t，作为水相。另将二氢杨梅素粉末、载体混合，加乙醇在温度t下搅拌熔融，即为油相。待两相完全溶解且温度相同时，将水相倒入油相中并快速搅拌充分混合，待混合液挥至无醇味，用超声波细胞粉碎机进行探头超声5min，即得二氢杨梅素固体脂质纳米粒混悬液；所述温度t为所选用的载体的熔点温度。

所述超声波细胞粉碎机的条件为：将变幅杆调至6，功率200w，每超声1s间隔2s。

本发明制备的二氢杨梅素固体脂质纳米粒混悬液均一，在透光处可见明显的乳光。得到的固体脂质纳米粒混悬液可进一步冷冻干燥得到冻干粉，即为固体脂质纳米粒。

本发明采用的乙醇是发挥助溶的作用，加入量按照乙醇体积：纳米粒混悬液总体积为1:10加入。

本发明具有如下优点：本发明的固体脂质纳米粒以水为分散介质，其具有生理相容性好、体内可降解、无生物毒性、物理稳定性高、促进吸收、提高生物利用度、控释以及良好的靶向性等优势。本发明通过选择合适的固体脂质及乳化剂，优化原料配比，可提高二氢杨梅素的稳定性、包封率和载药量，以期改善口服生物利用度。采用高压均质法制备二氢杨梅素固体脂质纳米粒，可操作性强，可用于工业化大规模生产。

附图说明

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

图1为本发明的二氢杨梅素固体脂质纳米粒透射电镜图(×100000)。

图2为本发明的二氢杨梅素固体脂质纳米粒体外释药曲线(n＝3)。

具体实施方式

本发明通过design-expert8.0软件优化处方，具体：因素为投药量、药脂比、表面活性剂的质量；评价指标为粒径，包封率，载药量。以泊洛沙姆188为表面活性剂，以单硬脂酸甘油酯为载体材料，进行以下预实验：

(1)称取泊洛沙姆188，并量取一定量超纯水将其超声溶解，置于恒温磁力搅拌器加热至75～80℃，即为水相。

(2)另称取二氢杨梅素、单硬脂酸甘油酯，加少量乙醇，与水相在同温状态下搅拌熔融，即为油相。

(3)待水相和油相完全溶解且温度相同时，将水相倒入油相并快速搅拌使其充分混合。待混合液挥至无醇味，用高速均质机8000r/min均质分散1min得初乳液。接着将初乳液于高压均质机(800bar)循环均质3次，即得二氢杨梅素固体脂质纳米粒混悬液。

本发明采用超滤法分离二氢杨梅素固体脂质纳米粒的游离药物，hplc法测定包封率和载药量。

本发明测定包封率和载药量的具体步骤为：

(1)色谱条件色谱柱：topods-aq柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：甲醇-0.1％磷酸水溶液为35:65，检测波长：二氢杨梅素为291nm，流速1.0ml/min；柱温30℃；进样量10μl。

(2)游离二氢杨梅素测定：精密吸取二氢杨梅素固体脂质纳米粒混悬液500μl于超滤离心管，8000r/min离心10min，取离心液100μl，用甲醇定容至1ml，按上述色谱条件测定。

(3)二氢杨梅素总量测定：另精密吸取二氢杨梅素固体脂质纳米粒混悬液500μl于10ml量瓶中，甲醇加热溶解、定容、摇匀，用0.45μm滤头过滤，按上述色谱条件测定。

(4)本发明包封率和载药量计算公式：包封率＝(w总－w游离)/w总；载药量＝(w总－w游离)/(w脂质+w总－w游离)(其中w总表示二氢杨梅素的总量，w游离表示游离二氢杨梅素的量，w脂质表示单硬脂酸甘油酯的质量)。

本发明在预实验的基础上，确定影响二氢杨梅素固体脂质纳米粒制剂学性质的显著因素为药物的质量、脂质及表面活性剂的用量(本发明考虑了不同的脂质对纳米粒制剂性质的影响，数据见表1，采用单硬脂酸甘油酯作为脂质载体，制备的二氢杨梅素纳米粒粒径小，包封率、载药量高)。接着以粒径、包封率、载药量为指标，应用星点设计-响应面法优化其处方配比。以design-expert8.0软件优化配方设计，拟出最优化的配比条件：二氢杨梅素0.4％，单硬脂酸甘油酯3％，泊洛沙姆1886.5％，余量水。同时通过电位测定、微观形态观察、体外释药特性考察对制得的二氢杨梅素固体脂质纳米粒进行了初步质量评价。

结果：根据最优化的配比条件，进行3次以上的验证实验，得到的二氢杨梅素固体脂质纳米粒的平均粒径(117.97±2.5％)nm，分布范围是20～500nm；zeta电位为(-23.96±6.5％)；包封率(85.92±3.3％)％，载药量(8.63±3.7％)；如图1透射电镜显示纳米粒表面光滑，呈球形或类球形；与游离二氢杨梅素相比，固体脂质纳米粒24h体外累积释放率达95.96％，48h基本释放完全，表明其具有缓释效果。如表2所示，本发明制备的二氢杨梅素固体脂质纳米粒与已有剂型相比，粒径小，包封率、载药量较高。

表1不同脂质载体材料对固体脂质纳米粒制剂性质的影响

注：上述实验各载体材料、药物、乳化剂重量分数分别为3％、0.3％、6％。

表2本法制备二氢杨梅素固体脂质纳米粒与已有剂型数据对比

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[3]叶勇,欧贤红,黄秋洁.正交法优选二氢杨梅素微囊的制备工艺[j].时珍国医国药,2012,23(9):2251-2252。

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实施例1

称取6.0g泊洛沙姆188，并量取适量超纯水将其超声溶解，加热至恒温75～80℃，作为水相。另称取二氢杨梅素粉末0.4g、单硬脂酸甘油酯4.0g，加10ml乙醇。与水相在同温状态下搅拌熔融，即为油相。待两相完全溶解且温度相同时，将水相倒入油相并快速搅拌充分混合。待混合液挥至无醇味，用高速均质机8000r/min均质分散1min得初乳液。接着将初乳液于高压均质机(800bar)循环均质3次。即得二氢杨梅素固体脂质纳米粒混悬液。室温冷却后于4℃冰箱保存。

实施例2

称取3.0g泊洛沙姆188，并量取适量超纯水将其超声溶解，加热至恒温75～80℃，作为水相。另称取二氢杨梅素粉末0.4g、单硬脂酸甘油酯4.0g，加10ml乙醇。与水相在同温状态下搅拌熔融，即为油相。待两相完全溶解且温度相同时，将水相倒入油相并快速搅拌充分混合。待混合液挥至无醇味，用高速均质机8000r/min均质分散1min得初乳液。接着将初乳液于高压均质机(800bar)循环均质3次。即得二氢杨梅素固体脂质纳米粒混悬液。室温冷却后于4℃冰箱保存。

实施例3

称取8.0g泊洛沙姆188，并量取适量超纯水将其超声溶解，加热至恒温75～80℃，作为水相。另称取二氢杨梅素粉末0.4g、单硬脂酸甘油酯5.0g，加10ml乙醇。与水相在同温状态下搅拌熔融，即为油相。待两相完全溶解且温度相同时，将水相倒入油相并快速搅拌充分混合。待混合液挥至无醇味，用高速均质机8000r/min均质分散1min得初乳液。接着将初乳液于高压均质机(800bar)循环均质3次。即得二氢杨梅素固体脂质纳米粒混悬液。室温冷却后于4℃冰箱保存。

实施例4

称取6.7g泊洛沙姆188，并量取适量超纯水将其超声溶解，加热至恒温75～80℃，作为水相。另称取二氢杨梅素粉末0.4g、单硬脂酸甘油酯3.0g，加10ml乙醇。与水相在同温状态下搅拌熔融，即为油相。待两相完全溶解且温度相同时，将水相倒入油相并快速搅拌充分混合。待混合液挥至无醇味，用高速均质机8000r/min均质分散1min得初乳液。接着将初乳液于高压均质机(800bar)循环均质3次。即得二氢杨梅素固体脂质纳米粒混悬液。室温冷却后于4℃冰箱保存。

实施例5

称取6.0g泊洛沙姆188，并量取适量超纯水将其超声溶解，加热至恒温75～80℃，作为水相。另称取二氢杨梅素粉末0.4g、单硬脂酸甘油酯2.60g，加10ml乙醇。与水相在同温状态下搅拌熔融，即为油相。待两相完全溶解且温度相同时，将水相倒入油相并快速搅拌充分混合。待混合液挥至无醇味，用高速均质机8000r/min均质分散1min得初乳液。接着将初乳液于高压均质机(800bar)循环均质3次。即得二氢杨梅素固体脂质纳米粒混悬液。室温冷却后于4℃冰箱保存。

实施例6

称取4.0g泊洛沙姆188，并量取适量超纯水将其超声溶解，加热至恒温75～80℃，作为水相。另称取二氢杨梅素粉末0.4g、单硬脂酸甘油酯5.0g，加10ml乙醇。与水相在同温状态下搅拌熔融，即为油相。待两相完全溶解且温度相同时，将水相倒入油相并快速搅拌充分混合。待混合液挥至无醇味，用高速均质机8000r/min均质分散1min得初乳液。接着将初乳液于高压均质机(800bar)循环均质3次。即得二氢杨梅素固体脂质纳米粒混悬液。室温冷却后于4℃冰箱保存。

实施例7

称取6.0g泊洛沙姆188，并量取适量超纯水将其超声溶解，加热至恒温75～80℃，作为水相。另称取二氢杨梅素粉末0.4g、单硬脂酸甘油酯5.4g，加10ml乙醇。与水相在同温状态下搅拌熔融，即为油相。待两相完全溶解且温度相同时，将水相倒入油相并快速搅拌充分混合。待混合液挥至无醇味，用高速均质机8000r/min均质分散1min得初乳液。接着将初乳液于高压均质机(800bar)循环均质3次。即得二氢杨梅素固体脂质纳米粒混悬液。室温冷却后于4℃冰箱保存。

实施例8

称取8.0g泊洛沙姆188，并量取适量超纯水将其超声溶解，加热至恒温75～80℃，作为水相。另称取二氢杨梅素粉末0.4g、单硬脂酸甘油酯3.0g，加10ml乙醇。与水相在同温状态下搅拌熔融，即为油相。待两相完全溶解且温度相同时，将水相倒入油相并快速搅拌充分混合。待混合液挥至无醇味，用高速均质机8000r/min均质分散1min得初乳液。接着将初乳液于高压均质机(800bar)循环均质3次。即得二氢杨梅素固体脂质纳米粒混悬液。室温冷却后于4℃冰箱保存。

下面通过对本发明实施例1-8制备的纳米粒各种理化性质测定的描述，进一步说明本发明结果的优点。

实验例1粒径和电位测定

精密吸取各实施例制备的纳米粒混悬液100μl，超纯水稀释至10ml量瓶，摇匀，采用nicomptm380zlszetapotential/particlesizer纳米粒度仪测定其粒径大小和zeta电位，测定结果见表3。

表3实施例1-8粒径、zeta电位、包封率和载药量测定结果

实验例2二氢杨梅素固体脂质纳米粒体外释放试验

采用平衡透析法考察二氢杨梅素固体脂质纳米粒体外的释放行为。释放介质为ph5.8磷酸盐缓冲液(含2％吐温80)，介质体积为100ml，介质温度为(37±0.5)℃，转速为100r·min^－1。精密移取2.0ml固体脂质纳米粒混悬液(二氢杨梅素浓度为4.0mg/ml)置于经预先处理的透析袋(截留分子量8000～14000)中，用透析袋夹夹紧两端袋口后置于释放介质中，分别在0.5、1、2、4、8、12、24、48h用100ml等温新鲜释放介质置换，吸取1ml释放介质经0.45μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，采用hplc法测定二氢杨梅素含量。另精密称取二氢杨梅素粉末适量，用ph5.8磷酸盐缓冲液加热溶解，制备成和固体脂质纳米粒同浓度的溶液。同样精密移取2.0ml二氢杨梅素溶液(游离二氢杨梅素)置于透析袋内，同上进行释放试验，按下式计算二氢杨梅素的累计释放率(qi)。qi＝(c1+c2+……+ci)v/c0v0(v0和c0分别为透析袋中加入的样品体积与质量浓度，v为透析介质体积，ci为每个时间点测得的二氢杨梅素质量浓度)。

游离二氢杨梅素和实施例4制备的二氢杨梅素固体脂质纳米粒体外释放曲线见附图2。结果表明：游离二氢杨梅素在0.5h累积释放率达60.07％，4h时的累积释放率为99.45％，基本释放完全；纳米粒在4h前属于快速释放期，累积释放率达75.09％，4h后释药较缓，24h时累积释放率达95.97％，说明本发明的固体脂质纳米粒具有延缓药物释放的作用。

综上，本发明制备的二氢杨梅素固体脂质纳米粒，粒径较小为110～130nm，分布狭窄。缓释效果较好，有助于二氢杨梅素药效的发挥。采用高压均质法制备包封率和载药量较高，适合工业化生产。本发明的实施，将进一步丰富二氢杨梅素的剂型，有望将其制成疗效更好、毒副作用更小，用于口服、静脉、肺部及皮肤给药的现代制剂。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。