甘草醇作为PBK/TOPK激酶抑制剂的新用途的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体涉及甘草醇作为pbk/topk激酶抑制剂的新用途。

背景技术：

甘草是多年生早本植物，是我国卫生部公布的药食同源植物，具有抗炎、镇咳祛痰、抗癌等多种生物活性。据报道，甘草皂苷类、甘草黄酮类和甘草香豆素类化合物是甘草的三大类主要活性成分。甘草醇(glycyrol，gc)是甘草根中特有的生物活性成分，属甘草香豆素类中的一种，具有抗菌、抗炎、免疫抑制、抑制cyp酶活性、抗肿瘤等生物活性。

topk，又称pbk或pd/z结合激酶，是mappk家族中的一种ser/thr激酶。正常生理情况下，topk在细胞有丝分裂、细胞周期调控、细胞增殖、细胞胞浆移动、dna修复等生理过程中发挥重要功能。然而，topk蛋白的异常表达(尤其是过度表达)与疾病的发生密切相关。现今，有关topk过表达与疾病的报道日益增多，靶向topk激酶的抑制剂也受到广泛关注。因此，研发特异性topk激酶抑制剂对揭示其生理/病理功能具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供甘草醇的一种药物新用途。

本发明所提供的甘草醇的药物新用途是其在制备下述1)—4)任一项中的应用：

1)与pbk/topk蛋白结合的产品；

2)抑制pbk/topk蛋白的激酶活性的产品；

3)pbk/topk激酶抑制剂；

4)抑制pbk/topk激酶介导的靶标蛋白磷酸化的产品。

以甘草醇为活性成分制成的药物制剂也属于本发明的保护范围。

所述药物制剂具体可为：1)与pbk/topk蛋白结合的药物制剂；2)抑制pbk/topk蛋白的激酶活性的药物制剂；3)pbk/topk激酶抑制剂；4)抑制pbk/topk激酶介导的靶标蛋白磷酸化的药物制剂。

上述药物制剂可制成各种形式的口服或注射制剂，包括：胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、丸剂、滴丸剂、缓控释制剂、口服液、合剂、糖浆剂、液体注射剂、注射用粉剂和注射用片剂等。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明还提供一种抑制pbk/topk蛋白的激酶活性的方法。

本发明所提供的抑制pbk/topk蛋白的激酶活性的方法，为：使得甘草醇与pbk/topk蛋白结合。

所述方法中，所述甘草醇与pbk/topk蛋白的结合常数为0.915±0.215μm。

所述甘草醇结合于pbk/topk蛋白的atp结合位点。

抑制浓度范围为：3.3～13.3μm/μgpbk/topk蛋白。

本发明还提供一种甘草醇-pbk/topk蛋白复合体。

所述甘草醇结合于pbk/topk蛋白的atp结合位点。

本发明通过实验表明，甘草醇可以与pbk/topk蛋白直接结合，并通过结合于pbk/topk蛋白的atp结合位点抑制pbk/topk蛋白的激酶活性。

附图说明

图1为本发明实施例1中甘草醇与pbk/topk蛋白的分子对接示意图。

图2表明pbk/topk蛋白与甘草醇的直接结合。

图3表明spr测定的pbk/topk蛋白与甘草醇的直接结合作用。

图4表明甘草醇对topk激酶活性的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的甘草醇为实验室参考已报到的文献自制(qiao,x.；liu,c.；ji,s.；lin,x.；guo,d.；ye,m.simultaneousdeterminationoffiveminorcoumarinsandflavonoidsinglycyrrhizauralensisbysolid-phaseextractionandhigh-performanceliquidchromatography/electrosprayionizationtandemmassspectrometry.plantamed.2014,80,237–242.)，纯度为98％。

实施例1、利用三维定量构效关系模型进行计算机模型pbk/topk蛋白与甘草醇的直接作用

利用分析软件获得pbk/topk蛋白的预测空间三维结构(三维模型建立时的参考文献：morrisgm,hueyr,lindstromw,sannermf,belewrk,goodselldsandolsonaj.autodock4andautodocktools4:automateddockingwithselectivereceptorflexibility.jcomputchem.2009；30:2785-2791和trottoandolsonaj.autodockvina:improvingthespeedandaccuracyofdockingwithanewscoringfunction,efcientoptimization,andmultithreading.jcomputchem.2010；31:455-461)。并将pbk/topk蛋白与甘草醇的空间三维结构进行分子对接。结果见图1。甘草醇结合于pbk/topk蛋白的atp结合位点(图1a,且与该位点嵌合良好(图1b)。甘草醇的末端烯烃结构能与atp结合位点的第98、174位缬氨酸和第115位甲硫氨酸具有疏水相互作用，形成疏水补丁；同时，甘草醇的羟基基团能够与atp结合位点的第121位赖氨酸,125位天冬氨酸,第172位天冬酰胺形成氢键(图1c)。综上，甘草醇通过以上相互作用力与pbk/topk蛋白直接作用。

实施例2、pbk/topk蛋白与甘草醇的直接结合作用

将sepharose4b(ge,17-0430-01)在hcl水溶液中充分溶胀，然后置于含有10mm甘草醇的孵育液中4℃孵育16小时；取出sepharose4b，孵育液充分洗涤后4℃封闭16小时，洗涤液洗涤后得到甘草醇-sepharose4b磁珠复合体。

将甘草醇-sepharose4b磁珠复合体与pbk/topk纯蛋白在反应液中4℃孵育16小时，完成后取磁珠复合体，用tris缓冲液洗涤5次，利用westernblot方法检测甘草醇与pbk/topk蛋白的结合情况。实验结果见图2，甘草醇-sepharose4b珠子可以与pbk/topk蛋白直接作用并结合。westernblot检测中，用于检测topk的一抗为抗topk(cst,4942)，二抗为兔二抗(mbl,458)。

实施例3、利用表面等离子共振技术(spr)测定pbk/topk蛋白与甘草醇的直接结合作用

(1)将his-topk蛋白溶解在含有0.5％吐温20的pbs缓冲液中，上机进样，使pbk/topk蛋白固定于nta芯片(ge,29-1049-88)上。

(2)将0～1.98μm的甘草醇溶于流动缓冲液(50mmtis-hcl、150mmnacl、10mmkcl、5mmmgcl2、0.005％吐温20和5％dmso，ph7.4)内，在室温条件下，梯度流过biacoret200芯片，进行biacore分析(流速：30ul/min)，实验结果见图3，结果显示甘草醇可以与pbk/topk蛋白直接结合，结合常数为0.915±0.215μm。

实施例4、甘草醇抑制pbk/topk蛋白的激酶活性的实验

以失活组蛋白h3(1μg)为底物，用1.5μg活性topk进行体外激酶分析。在1×激酶缓冲液(25mmtris(ph7.5)、5mmb-甘油磷酸盐、2mmdtt、0.1mmna3vo4、10mmmgcl2、5mmmncl2)中，分别加入甘草醇使其最终浓度为5、10、20μm，同时加入1μg失活组蛋白h3、1.5μg活性topk、100μmatp，32℃下反应1.5h，加入5×sds样品缓冲液停止反应。用westernblot分析磷酸化、总组蛋白h3和topk，结果见图4，可见甘草醇能抑制活化pbk/topk蛋白的激酶活性，从而抑制组蛋白histoneh3的磷酸化。westernblot检测中，用于检测p-histoneh3的一抗为抗p-histoneh3(cst,3642s)，用于检测topk的一抗为抗topk(cst,4942)，二抗为兔二抗(mbl,458)。