提高动物肌肉内脂肪沉积的方法及用途与流程

本发明涉及一种提高动物肌肉内脂肪沉积的方法及用途，属于生物和现代农业
技术领域：
的应用技术。
背景技术：
：骨骼肌是运动系统的动力部分，主要由成束状排列的肌细胞(肌纤维)构成，各细胞外面都包有纤细的网状膜，叫肌内膜；各肌束又被肌束膜包裹，在每块肌肉的外面，又包有一层较厚的结缔组织，叫肌外膜。肌纤维根据收缩特征分为慢肌(i)和快肌(iia，iib，iix)；按照代谢特征分为：氧化型(i，iia)和酵解型肌纤维(iib，iix)。正常的肌肉组织中，有较少量的脂肪沉积，而且与肌纤维类型密切相关。较快肌纤维，慢肌纤维中含有较多的线粒体和脂滴沉积。当肌肉组织发生病变后，如脂质沉积性肌病(lsm)、肌肉萎缩等，肌肉中有异常含量的脂质沉积；肥胖病等代谢性疾病患者肌肉组织中也会沉积较多的脂滴。另外，老年人的肌肉组织出现萎缩，肌肉中脂肪沉积会增加。表明，肌肉组织中脂肪的沉积与一些疾病的发生密切相关。因此，研究如何调控肌肉内脂肪沉积对于人类健康具有重要的意义。在畜牧生产中，肌肉内脂肪沉积与猪肉品质密切相关。目前，猪肉品质与安全问题是目前我国养猪业发展亟待解决的关键问题之一。肌肉脂肪主要包括肌内脂肪和肌间脂肪。肌间脂肪就是肌纤维束之间的脂肪；肌内脂存在于肌外膜、肌束膜、甚至肌内膜上，营养状况好的家畜，其肌纤维膜的毛细血管上也有脂肪。肌肉内脂肪含量与猪肉的感官品质和食用品质密切相关，直接影响着肉的风味、多汁性、嫩度、色泽等。另外，imf含量低的猪肉往往pse(pale，soft，exudative)肉发生率较高，而pse猪肉的发生直接影响着肉色、系水力和食用品质，严重降低了猪肉的经济价值。因此，开展调控猪肉中的肌内脂肪含量研究，对畜牧业的健康发展和满足消费者对优质肉的需求具有重大的意义。成体肌肉组织具有损伤修复和再生的功能，肌肉组织中所含的肌肉干细胞(肌卫星细胞)数目及功能直接影响着肌肉的再生功能。除了肌肉干细胞外，其他干细胞如脂肪干细胞等也参与此损伤修复过程。当肌肉干细胞数目或功能出现问题时会导致肌肉再生障碍，此时肌肉中会沉积结缔组织、脂肪组织等非肌肉组织。这为本发明提供可行性。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种提高动物肌肉内脂肪沉积的方法，以及该方法在科学研究和畜牧生产中的用途。为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于诱导肌肉组织损伤和脂肪沉积的制剂zju-glm1，每100ml的制剂zju-glm1由以下成分组成：40～60ml甘油，0.1～1mm(mmol/l)甜菜碱，0.1～1mm亚油酸(十八碳二烯酸)，余量为质量浓度是0.85～0.9％的氯化钠水溶液。即，在40～60ml甘油、0.01～0.1mmol甜菜碱、0.01～0.1mmol亚油酸中加入质量浓度是0.8～1.0％的氯化钠水溶液定容至100ml。作为本发明的用于诱导肌肉组织损伤和脂肪沉积的制剂zju-glm1的改进：所述氯化钠水溶液的浓度为0.9％。作为本发明的用于诱导肌肉组织损伤和脂肪沉积的制剂zju-glm1的进一步改进：每100ml的制剂zju-glm1由以下成分组成：50ml甘油，0.1mm(mmol/l)甜菜碱，0.1mm亚油酸，余量为质量浓度是0.9％的氯化钠水溶液。本发明还同时提供了利用上述制剂zju-glm1从而提高动物骨骼肌肌肉内脂肪沉积的方法：采用肌肉注射zju-glm1制剂，注射肌肉为胫骨前肌(ta)肌肉，注射剂量为2.0～4.0ml/kg，取样时间为注射后14～28天；得高肌肉内脂肪沉积模型。本发明还同时提供了上述高肌肉内脂肪沉积模型的用途：用于研究高脂肪沉积的肌肉模型对葡萄糖耐受及代谢的影响，用于研究肌肉中脂质代谢、肌纤维类型和炎症因子等相关基因表达研究的模型，并可延伸用于提高养猪生产中肌肉内脂肪含量。本发明首先根据肌肉组织再生特性和肌肉干细胞生物学知识，配制出一种能够诱导肌肉组织损伤和脂肪沉积的制剂zju-glm1。当采用小鼠作为实验对象，提高肌肉内脂肪沉积的方法建立，具体为：将10-12周左右的小鼠麻醉，麻醉方法如下：用0.9％生理盐水配制1％的戊巴比妥钠，小鼠称重后计算注射剂量，注射剂量为50mg/kg，采用腹腔注射方法。注射完后等待5～10分钟，待小鼠进入麻醉期，开展下一步实验。麻醉后，用微量注射器将50～100μlzju-glm1制剂注射到小鼠胫骨前肌(ta)肌肉组织中，注射后14～28天后取样观察，确定最佳注射剂量和最佳取样时间------注射剂量为100μl，取样时间为注射后14天。在本发明中，高肌肉内脂肪沉积模型的鉴定方法为：肌肉组织切片后，采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosinstaining，he)染色法、油红o染色、免疫荧光染色及肌肉中甘油三酯含量测定等技术手段进行鉴定。鉴定结果表明，本发明能成功建立高肌肉内脂肪沉积模型。本发明具有以下有益效果：本发明根据肌肉干细胞功能和肌肉组织损伤修复这一特性，将麻醉后的动物(小鼠)利用zju-glm1制剂诱导肌肉损伤和脂肪沉积，经过不同注射剂量和不同诱导时间的研究，通过he染色、油红o染色、脂肪标志基因免疫荧光染色、甘油三酯含量测定等鉴定得到高肌肉内脂肪沉积的动物模型。本发明是利用成体干细胞技术、组织再生修复技术及zju-glm1制剂和现代分子生物学技术等共同实现了本发明，不仅开拓了科学研究模型，同时也开拓了目前调控猪肌肉中脂肪沉积等研究的新思路。本发明建立的一种提高动物骨骼肌肌肉内脂肪沉积的方法，方法简单、可行，同时能显著提高肌肉内脂肪沉积，是研究肌肉中脂质代谢和沉积的一种强有力的研究技术，在生命科学领域、医学科学领域、畜牧业领域等中都具有重要的意义。附图说明下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。图1是ta肌肉组织切片he染色检测结果图；对照组(生理盐水组)；glm1处理组(zju-glm1组)；图中：40x、100x分别指在40和100倍显微镜下拍照；箭头指的白色细胞为脂肪细胞。图2是ta肌肉组织切片油红o染色检测结果图；对照组(生理盐水组)；glm1处理组(zju-glm1组)；图中：40x、100x分别指在40和100倍下检测结果；图中白色箭头所指黑色为油红o阳性染色。图3是ta肌肉组织切片免疫荧光染色检测结果图；对照组(生理盐水组)；glm1处理组(zju-glm1组)；图中：白色箭头所指为部分脂肪细胞。图4是肌肉组织中甘油三酯含量检测结果图；对照组(生理盐水组)；glm1处理组(zju-glm1组)；**p<0.01。图5是肌肉组织中游离胆固醇含量检测结果图；对照组(生理盐水组)；glm1处理组(zju-glm1组)。图6是肌肉组织中游离脂肪酸含量检测结果图；对照组(生理盐水组)；glm1处理组(zju-glm1组)。图7是葡萄糖耐受试验检测结果图。图8是肌肉组织中脂肪标志基因检测结果图；对照组(生理盐水组)；glm1处理组(zju-glm1组)；**p<0.01。图9是肌肉组织中fabp4蛋白表达检测结果图；对照组(生理盐水组)；glm1处理组(zju-glm1组)。图10是肌肉组织中酵解型肌纤维荧光定量检测结果图；对照组(生理盐水组)；glm1处理组(zju-glm1组)，*p<0.05；**p<0.01。图11是肌肉组织中氧化型肌纤维荧光定量检测结果图；对照组(生理盐水组)；glm1处理组(zju-glm1组)。图12是肌肉组织中炎症因子il-1b和cd68荧光定量检测结果图；对照组(生理盐水组)；glm1处理组(zju-glm1组)；*p<0.05。图13是肌肉组织中趋化因子ccl2和ccl7荧光定量检测结果图；对照组(生理盐水组)；glm1处理组(zju-glm1组)；*p<0.05。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1、(一)、高肌肉内脂肪沉积动物模型的建立1、zju-glm1制剂配制：根据肌肉组织再生特性和肌肉干细胞生物学知识，配制一种能够诱导肌肉组织损伤和脂肪沉积的制剂，该制剂命名为zju-glm1，每100ml的制剂zju-glm1由以下成分组成：50％甘油，0.1mm(mmol/l)甜菜碱，0.1mm亚油酸，余量为质量浓度是0.9％的氯化钠水溶液。即，在50ml甘油、0.01mmol甜菜碱、0.01mmol亚油酸中加入质量浓度是0.9％的氯化钠水溶液定容至100ml。2、试验动物麻醉：将10-12周左右的小鼠用麻醉试剂麻醉，麻醉方法为：用0.9％生理盐水配制1％的戊巴比妥钠，小鼠称重后计算注射剂量，注射剂量为50mg/kg，采用腹腔注射方法。注射完后等待5～10分钟，待小鼠进入麻醉期，开展下一步实验。3、肌肉注射zju-glm1：试验动物麻醉后，用微量注射器将50～100μlzju-glm1制剂注射到小鼠胫骨前肌(ta)肌肉组织中，同时设同体积生理盐水注射组作为对照组。注射后14～28天取样观察，确定最佳注射剂量和最佳取样时间------注射剂量为100μl，取样时间为注射后14天。(二)zju-glm1制剂诱导肌肉内脂肪沉积效果鉴定1、he染色鉴定：将(一)中建立的动物模型，在第14、28天时取ta肌肉组织，切片后经过he染色鉴定。he染色方法为常规方法：ta肌肉石蜡切片，经过二甲苯脱去切片中的石蜡，然后依次经由95％酒精ⅰ(3min)2次、80％酒精(1min)、蒸馏水(1min)浸泡。然后将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟，酸水及氨水中分色，各数秒钟。流水洗涤后，入酒精伊红染色液染色2-3分钟。染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明；然后将已透明的切片滴上树胶，盖上盖玻片封固。待树胶略干后，贴上标笺，染色完成，观察染色结果。其中苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。he染色结果表明：ta肌肉组织注射100ulzju-glm1并处理14天效果较好。在14天时，ta肌肉中注射100μlzju-glm1制剂后能诱导肌肉内沉积大量脂肪细胞(白色空泡，图1，黑色箭头所示为部分脂肪细胞)，而生理食盐水对照组未见明显的脂肪细胞(图1)。2、油红o染色鉴定：为了确认zju-glm1制剂能提高肌肉内脂肪沉积，处理14天的ta肌肉组织切片后通过油红o染色的方法鉴定诱导产生的脂肪细胞。油红o工作液的配制方法为：首先配置油红o贮存液，0.5g油红溶于100ml异丙醇进行超声溶解，滤纸过滤后放棕瓶中保存。油红o工作液则为现配现用，按6ml贮存液与4ml水的比例混匀静置10min，用滤纸过滤后使用。油红o染色方法为常规方法：将ta切片用4％的多聚甲醛固定20min，弃掉多聚甲醛后每孔加200μl的油红o工作液(现配现用，按6ml0.5％油红o贮存液与4ml水的比例混匀静置10min，用滤纸过滤后使用)染色20min，染色后用60％异丙醇洗两遍，拍照。脂肪细胞可被染成橘红色，可见zju-glm1制剂注射的肌肉组织中出现大量脂肪细胞和脂滴聚集(图2)。根据图2，可得知zju-glm1制剂处理后在肌肉组织中诱导产生了大量的脂肪细胞，显著提高了肌肉组织中脂肪沉积。表明成功诱导肌肉内脂肪沉积。3、免疫荧光鉴定：为了进一步确认zju-glm1制剂可以较好的诱导肌肉内脂肪沉积，通过免疫荧光染色技术进一步鉴定zju-glm1制剂处理后诱导产生的脂肪细胞。ta肌肉切片利用perilipin(脂肪标志基因)和dystrophin(肌纤维)两种抗体进行免疫荧光染色。免疫荧光染色方法为常规方法：将ta肌肉切片脱蜡后，用pbs洗一遍，加入4％多聚甲醛固定15min，pbs洗三遍，加入0.1m甘氨酸室温静置10min，pbs洗三遍，加入200μl的封闭液室温静置60min；将一抗perilipin：封闭液＝1:200的体积比先进行稀释，然后再加入该稀释后的一抗perilipin200μl，4℃过夜；第二天弃一抗后用pbs缓冲液洗三遍，加入dylight549标记兔抗羊二抗igg(1:200稀释于pbs缓冲液中)和hochst稀释液(1:1000稀释于pbs缓冲液中)200μl，避光室温染色45-60min，pbs洗三遍，封片后进行荧光拍摄。perilipin阳性为脂肪细胞。免疫荧光染色结果显示，对照组未见明显的perilipin阳性细胞；而zju-glm1制剂组ta肌肉切片中出现大量的perilipin阳性细胞(图3，白色箭头为部分perilipin阳性脂肪细胞)。根据图3，可进一步得知，zju-glm1制剂可显著提高肌肉内脂肪细胞的数量。4、肌肉中甘油三酯、游离脂肪酸和胆固醇测定鉴定：通过甘油三酯测定试剂盒、胆固醇测定试剂盒和游离脂肪酸测定试剂盒等检测对照组和zju-glm1组ta肌肉组织中甘油三酯、胆固醇和游离脂肪酸的含量。结果显示，与对照组相比，zju-glm1组显著提高肌肉组织中甘油三酯含量(图4)和胆固醇含量(图5)，对游离脂肪酸也有较大的提高(图6)。根据甘油三酯含量等测定结果进一步得知，zju-glm1制剂显著提高了肌肉内脂肪沉积。通过1-4步骤的鉴定，可以确认，zju-glm1制剂诱导的高肌肉内脂肪沉积动物模型建立成功。(三)提高动物骨骼肌肌肉内脂肪沉积方法的用途1、利用该方法建立的高肌肉脂肪沉积模型研究糖代谢调控：利用该方法建立的动物模型，在第14天时，进行葡萄糖耐受实验。葡萄糖耐受试验方法如下：测试前将对照组和zju-glm1组小鼠禁食16小时，称取小鼠重量，然后腹腔注射2.0g/kg的葡萄糖，然后每隔15min测定取小鼠尾巴末端血液，用血糖仪测定不同时间点的血糖含量。研究结果显示，高肌肉脂肪沉积模型鼠对葡萄糖代谢有一定程度的影响(图7)，可以作为糖代谢及脂质沉积性肌病等的研究模型。2、利用该方法建立的高肌肉脂肪沉积模型研究脂肪沉积相关基因表达：取14天的对照和zju-glm1组ta肌肉样品，提取总rna，通过荧光定量pcr研究脂质沉积相关基因如adipoq、leptin、perilipin和pparγ的表达情况。18s为内参基因。同时提取总蛋白，用westernblot技术研究脂质沉积标志基因fabp4的蛋白水平。荧光定量pcr引物分别为：adipoq-f：gttcccaatgtacccattcgcadipoq-r：tgctgccgtcataatgattctgleptin-f：gtggctttggtcctatctgtcleptin-r：cgtgtgtgaaatgtcattgatccperilipin-f：caagcacctctgacaaggttcperilipin-r：gttggcggcatattctgctgpparγ-f：gcatggtgccttcgctgapparγ-r：tggcatctctgtgtcaaccatg18s-f：agtccctgccctttgtacaca18s-r：cgatccgagggcctcacta荧光定量pcr扩增体系：sybrrox(2×)5.0μl，forwardprimer(10μmol/l)0.2μl，reverseprimer(10μmol/l)0.2μl，dna模板3.6μl，ddh2o1.0μl，total10.0μl。荧光定量pcr反应条件：(1)95℃预变性10s；(2)95℃变性5s，60℃退火和延伸30s并采集荧光信号，共40个循环。荧光定量检测结果表明，与对照组相比，zju-glm1组ta肌肉中adipoq、leptin等脂质沉积相关基因的表达显著提高(图8)。westernblot结果表明，与对照组相比，zju-glm1组ta肌肉中fabp4的蛋白水平显著提高(图9)。3、利用该方法建立的高肌肉脂肪沉积模型研究肌纤维类型相关基因表达：取14天的对照和zju-glm1组ta肌肉样品，提取总rna，通过荧光定量pcr研究肌纤维类型相关基因的表达情况。荧光定量pcr引物分别为：i-f：gcctgggcttacctctctatcaci-r：cttctcagacttccgcaggaaiia-f：cagctgcaccttctcgtttgiia-r：cccgaaaacggccatctiib-f：gtcctggcctctgagagcatiib-r：tcaaggataagggcgacagciix-f：ggacccacggtcgaagttgiix-r：cccgaaaacggccatct荧光定量pcr扩增体系及反应条件同步骤2。荧光定量检测结果表明，与对照组相比，zju-glm1组ta肌肉中酵解型肌纤维iix、iib基因表达显著降低(图10)，氧化型肌纤维i、iia基因表达升高(图11)。4、利用该方法建立的高肌肉脂肪沉积模型研究炎症相关基因il1b、cd68、ccl2、ccl7的表达：取14天的对照和zju-glm1组ta肌肉样品，提取总rna，通过荧光定量pcr研究炎症相关基因的表达情况。荧光定量pcr引物分别为：il1b-f：gcaactgttcctgaactcaactil1b-r：atcttttggggtccgtcaactcd68-f：tgtctgatcttgctaggaccgcd68-r：gagagtaacggcctttttgtgaccl2-f：caggtccctgtcatgcttctccl2-r：tctggacccattccttcttgccl7-f：gctgctttcagcatccaagtgccl7-r：ccagggacaccgactactg荧光定量pcr扩增体系及反应条件同步骤2。荧光定量检测结果表明，与对照组相比，zju-glm1组ta肌肉中il1b表达显著提高(图12)，趋化因子ccl2基因表达显著升高(图13)。对比例、将上述制剂zju-glm1的配方改成为如下：配方ⅰ：在100ml配方ⅰ制剂中，含甘油25％，甜菜碱0.1mm，亚油酸0.1mm，余量为质量浓度是0.9％的氯化钠水溶液。配方ⅱ：在100ml配方ⅰ制剂中，含乙醇20％，甜菜碱0.1mm，亚油酸0.1mm，余量为质量浓度是0.9％的氯化钠水溶液。配方ⅲ：在100ml配方ⅲ制剂中，含乙醇10％，甜菜碱0.1mm，亚油酸0.1mm，余量为质量浓度是0.9％的氯化钠水溶液。注射剂量与取样时间同上述步骤(一)；检测方法同上述步骤(二)、(三)；所得结果与本发明的对比如下表1所述，从而证明zju-glm1能较好的诱导肌肉内脂肪沉积。表1肌肉损伤情况肌肉再生情况肌肉内脂肪沉积情况zju-glm1严重损伤部分再生大量沉积配方ⅰ较重损伤基本完全再生少量沉积配方ⅱ严重损伤极少部分再生无沉积配方ⅲ严重损伤极少部分再生无沉积注：当甘油超过60％时，效果不如zju-glm1，无法实现肌肉内脂肪的大量沉积。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。序列表<110>浙江大学<120>提高动物肌肉内脂肪沉积的方法及用途<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gttcccaatgtacccattcgc21<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tgctgccgtcataatgattctg22<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gtggctttggtcctatctgtc21<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cgtgtgtgaaatgtcattgatcc23<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5caagcacctctgacaaggttc21<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gttggcggcatattctgctg20<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gcatggtgccttcgctga18<210>8<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8tggcatctctgtgtcaaccatg22<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9agtccctgccctttgtacaca21<210>10<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10cgatccgagggcctcacta19当前第1页12