2,2-(4-羧基辛酰胺基)苯甲酸甲酯在制备治疗炎症性疾病药物中的应用的制作方法

本发明属于化合物新用途技术领域，具体涉及2,2-(4-羧基辛酰胺基)苯甲酸甲酯或其可药用的盐在制备治疗炎症性疾病药物中的应用。

背景技术：

g蛋白偶联受体(gpcrs)根据下游偶联的g蛋白种类分为三类：gs蛋白、gi蛋白、gq蛋白和g12/13蛋白四种，分别介导不同的信号传递。目前g蛋白偶联受体被发现仅存在于真核生物中。可以结合g蛋白偶联受体的配体包括神经递质、信息激素、多肽类及小分子化合物等。g蛋白偶联受体参与了许多疾病的发生发展，因此是重要的药物靶标，据统计报道目前市场上约30％的药物均是以g蛋白偶联受体作为靶点的。gq/gi偶联受体有许多的亚家族，包括：(1)嘌呤受体家族(purinergicreceptor)，成员有p1、p2；(2)腺苷受体家族(adenosinereceptor)，成员有a1、a2a、a2b及a3。嘌呤受体家族在调节心肌氧消耗、冠状动脉血流、抗炎、血管反应性、细胞凋亡、细胞因子分泌等方面起着重要作用。

p2亚族根据组织分布和药理学特征又可分5个亚型：p2x、p2y、p2z、p2u及p2t。其中p2x、p2z属于离子通道型受体；p2y、p2u和p2t属于g蛋白偶联受体。已经报道的g蛋白偶联受体的p2y受体家族包含8种亚型(p2y1、2、4、6、11、12、13、14)，广泛分布于各种细胞和组织中，而且各亚型之间同源性比较低，因此不同的亚型对配体具有很高的选择性。其中p2y1、2、4、6受体结合gq并激活plc途径；p2y12、13、14受体结合gi抑制腺苷酸环化酶的活性；p2y4受体偶联gq/gi两种g蛋白；p2y11受体偶联gq/gs两种g蛋白。p2y受体介导免疫调节、血小板聚集、平滑肌细胞增殖等一系列生物学效应。p2y14受体主要存在于心脏、胎盘、脂肪组织、胃肠道以及外周免疫细胞中，它能够提高小神经胶质细胞的超敏性，中性粒细胞的流动性；增加肥大细胞释放介质和肾闰细胞炎症，并在中枢神经系统中能够抑制星形胶质细胞释放间质金属蛋白酶和肿瘤坏死因子。最近的研究表明，在p2y14受体基因敲除的小鼠中，p2y14受体的拮抗作用具有潜在的治疗糖尿病的作用。还有报道称udp和udp-glu作为配体激活p2y14受体与炎症、哮喘等疾病有很大关系。目前对p2y14受体抑制剂的研究仅仅报道了3种结构类型的化合物(嘧啶并哌啶类、2-萘酸类和3-取代苯甲酸类)，但还都在临床前研究阶段。其中活性和选择性最高的为2-萘酸类，然而目前报道的2-萘酸类结构的抑制剂存在溶解性差、口服生物利用度低、合成纯化难度大等缺陷，给进一步讨论构效关系及生物学评价带来了较大的困难。因此寻找新结构类型的p2y14受体拮抗剂，改善2-萘酸类抑制剂存在的成药性差等问题，成为发现活性强、选择性好的p2y14受体抑制剂的新策略。

技术实现要素：

发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了2,2-(4-羧基辛酰胺基)苯甲酸甲酯或其可药用的盐在制备治疗炎症性疾病药物中的应用。

技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

2,2-(4-羧基辛酰胺基)苯甲酸甲酯或其可药用的盐在制备治疗炎症性疾病药物中的应用，其化学结构式如下所示：

优选：

所述可药用的盐包含盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐、醋酸盐、马来酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、甲基苯磺酸盐、富马酸盐或酒石酸盐。

所述炎症性疾病为p2y14受体相关的疾病。

所述炎症性疾病为急性痛风性关节炎、类风湿性关节炎、骨性关节炎、动脉粥样硬化、败血症或肺炎等。

所述2,2-(4-羧基辛酰胺基)苯甲酸甲酯或其可药用的盐能够抑制p2y14受体。

所述2,2-(4-羧基辛酰胺基)苯甲酸甲酯或其可药用的盐能够抑制巨噬细胞炎性反应。

本发明还提供了含有2,2-(4-羧基辛酰胺基)苯甲酸甲酯或其可药用的盐的组合物在制备治疗炎症性疾病药物中的应用。

优选，所述组合物是以2,2-(4-羧基辛酰胺基)苯甲酸甲酯或其可药用的盐作为活性成分，加上药学上可接受的辅料所制成的药物。

本发明所述2,2-(4-羧基辛酰胺基)苯甲酸甲酯或其可药用的盐在治疗炎症性疾病时，可以单独使用，也可以与其他药物配合同时使用，或者与其他药物一起制成复方制剂使用，都可以达到治疗炎症性疾病的目的。

本发明所述药学上可接受的辅料，是指制备不同剂型时加入所需的各种常规辅料，例如稀释剂、黏合剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、矫味剂、包合材料、吸附材料等以常规的制剂方法制备成任何一种常用的口服制剂，例如可以是颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液、汤剂、滴丸剂等。

本发明首次发现了2,2-(4-羧基辛酰胺基)苯甲酸甲酯不仅具有较强的p2y14受体抑制活性，还能显著抑制尿酸盐晶体(msu)诱导的thp-1细胞炎性反应，同时有效改善msu关节腔注射诱发的大鼠急性痛风性关节炎，下调滑膜组织种p2y14受体的表达，降低血清和滑膜组织中炎性因子的水平。这些作用表明2,2-(4-羧基辛酰胺基)苯甲酸甲酯具有用于急性痛风性关节炎等炎症性疾病治疗的潜力，有望制备作用于p2y14受体的抗炎药物。

技术效果：相对于现有技术，本发明首次发现了化合物2,2-(4-羧基辛酰胺基)苯甲酸甲酯具备p2y14受体抑制剂的功能，对p2y14受体相关炎症具有明显的抑制作用，可以用作制备作用于p2y14受体的抗炎药物。

附图说明

图1为2,2-(4-羧基辛酰胺基)苯甲酸甲酯对msu诱导的thp-1细胞中p2y14受体蛋白过表达的影响，其中数据是thp-1细胞p2y14受体蛋白相对表达的平均值±标准差(n＝4)，用one-wayanova进行方差分析(###代表与正常组比较p＜0.001，*代表与模型对照组比较p＜0.05，**代表与模型对照组比较p＜0.01，***代表与模型对照组比较p＜0.001)；

图2为2,2-(4-羧基辛酰胺基)苯甲酸甲酯对msu诱导的thp-1细胞过量释放il-1β的影响，其中数据是thp-1细胞培养基上清液中il-1β水平的平均值±标准差，用one-wayanova进行方差分析(###代表与正常组比较p＜0.001，*代表与模型对照组比较p＜0.05，**代表与模型对照组比较p＜0.01，***代表与模型对照组比较p＜0.001)；

图3为2,2-(4-羧基辛酰胺基)苯甲酸甲酯对急性痛风性关节炎大鼠滑膜组织中p2y14受体蛋白过表达的影响，其中数据是4只大鼠滑膜组织p2y14受体蛋白相对表达的平均值±标准差，用one-wayanova进行方差分析(###代表与正常组比较p＜0.001，**代表与模型对照组比较p＜0.01，***代表与模型对照组比较p＜0.001)；

图4为2,2-(4-羧基辛酰胺基)苯甲酸甲酯对急性痛风性关节炎大鼠血清il-1β水平增加的影响，其中数据是10只大鼠血清il-1β水平的平均值±标准差，用one-wayanova进行方差分析(###代表与正常组比较p＜0.001，*代表与模型对照组比较p＜0.05，**代表与模型对照组比较p＜0.01，***代表与模型对照组比较p＜0.001)；

图5为2,2-(4-羧基辛酰胺基)苯甲酸甲酯对急性痛风性关节炎大鼠滑膜组织il-1β水平增加的影响，其中数据是10只大鼠滑膜组织il-1β水平的平均值±标准差，用one-wayanova进行方差分析(###代表与正常组比较p＜0.001，*代表与模型对照组比较p＜0.05，**代表与模型对照组比较p＜0.01，***代表与模型对照组比较p＜0.001)

具体实施方式

实施例1

化合物作为p2y14受体抑制剂的抑制活性评价实验方法：

稳转p2y14受体的hek293细胞株培养于dmem培养基中(含10％胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素)，实验前接种至培养板，改用无血清培养基，接种密度为1×10⁵个细胞/孔，细胞于37℃、95％o2、5％co2条件下培养。加入ibmx抑制pdes活性，以保证camp在一个较高的水平上。采用腺苷酸环化酶(ac)激动剂forskolin(30μm)刺激细胞camp的产生，预先加入不同浓度的受试化合物(0.01、0.1、1、10、100nm)，以pptn作为阳性对照。随后加入1μm的p2y14受体激动剂udpg，4h后采用campglo^tmassay试剂盒(promegaco.ltd，美国)检测细胞内camp的含量。根据对camp含量的抑制率计算ic50值。

实施例2

受试化合物抑制尿酸盐晶体诱导的巨噬细胞炎性反应的药理研究实验方法：

人thp-1细胞培养于rpmi-1640培养基中(含10％胎牛血清，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素)，实验前接种至培养板，接种密度为1×10⁵个细胞/孔，细胞于37℃、95％o2、5％co2湿度条件下培养。实验前每孔加入100ng/mlpma孵育24h诱导thp-1细胞分化为巨噬细胞。预先向培养基中加入受试化合物(2.5、5、10μm)、pptn(5μm)和地塞米松(5μm)进行干预，1h后向细胞中加入终浓度为500μg/ml的尿酸盐晶体(msu)，6h后测定如下指标：westernblot法检测细胞中p2y14受体的蛋白表达；按elisa试剂盒(深圳欣博盛)方法检测细胞培养基上清液中il-1β的水平。

实施例3

受试化合物在整体动物水平对急性痛风性关节炎的治疗作用的药理实验研究方法：

雄性清洁级sd大鼠，体重200±20g，自由水食，每天12h照明，环境温度为25±2℃。动物分为若干组：正常对照组、模型对照组、给药组(受试化合物、pptn和地塞米松)，采用一次性关节腔注射msu诱导急性痛风性关节炎模型，而正常对照组和正常给药各组采用等量的生理盐水注射入关节腔。各给药组通过关节腔注射给予受试化合物(5、10、20mg/kg)、pptn(10mg/kg)和地塞米松(10mg/kg)。采用缚线法检测大鼠关节周径，测定时间点选择0h、2h、4h、8h、12h、24h，24h后，24h后大鼠眼球后静脉丛取血，在10000×g离心条件下离心5min，取血清，置于4℃保存备用。然后断颈处死动物，在冰台上快速分取关节滑膜组织，检测如下指标：westernblot法检测滑膜组织中p2y14受体的蛋白表达；按elisa试剂盒(深圳欣博盛)方法检测血清、滑膜组织中il-1β的水平。

实验结果

不同浓度的化合物进行p2y14受体的抑制活性实验，发现该化合物有很好的抑制活性，其半数抑制浓度ic50为2.46nm。

图1中数据是thp-1细胞p2y14受体蛋白相对表达的平均值±标准差(n＝4)，用one-wayanova进行方差分析(###代表与正常组比较p＜0.001，*代表与模型对照组比较p＜0.05，**代表与模型对照组比较p＜0.01，***代表与模型对照组比较p＜0.001)。由图可知：msu造成thp-1细胞p2y14受体蛋白表达显著升高，提示造模成功；不同剂量受试组合物能够不同程度的下调p2y14受体蛋白表达，与模型对照组比较均体现出显著性差异；pptn也体现出了预期的效果，表明实验结果真实可信。地塞米松并未显示出对p2y14受体表达的调控作用。

图2中数据是thp-1细胞培养基上清液中il-1β水平的平均值±标准差，用one-wayanova进行方差分析(###代表与正常组比较p＜0.001，*代表与模型对照组比较p＜0.05，**代表与模型对照组比较p＜0.01，***代表与模型对照组比较p＜0.001)。由图可知：msu造成thp-1细胞培养基上清液中il-1β水平显著升高，提示造模成功；不同剂量受试组合物能够不同程度的下调细胞培养基上清液中il-1β水平，与模型对照组比较均体现出显著性差异；pptn和地塞米松也体现出了预期的效果，表明实验结果真实可信。

表1中数据是10只大鼠不同时间点关节周径的平均值±标准差，用one-wayanova进行方差分析(#代表与正常组比较p＜0.05，###代表与正常组比较p＜0.001，*代表与模型对照组比较p＜0.05，**代表与模型对照组比较p＜0.01，***代表与模型对照组比较p＜0.001)。由图可知：msu造成大鼠关节肿胀，在4h、8h、12h、24h呈现出显著性差异，提示造模成功；不同剂量受试组合物能够不同程度的缓解msu造成的大鼠关节周径增大，与模型对照组比较均体现出显著性差异；pptn和地塞米松也体现出了预期的效果，表明实验结果真实可信。

表1：化合物对急性痛风性关节炎大鼠关节周径的影响(cm)

图3中数据是4只大鼠滑膜组织p2y14受体蛋白相对表达的平均值±标准差，用one-wayanova进行方差分析(###代表与正常组比较p＜0.001，**代表与模型对照组比较p＜0.01，***代表与模型对照组比较p＜0.001)。由图可知：msu造成大鼠滑膜p2y14受体蛋白表达显著升高，提示造模成功；不同剂量受试组合物能够不同程度的下调滑膜p2y14受体蛋白表达，与模型对照组比较均体现出显著性差异；pptn也体现出了预期的效果，表明实验结果真实可信。地塞米松并未显示出对p2y14受体表达的调控作用。

图4中数据是10只大鼠血清il-1β水平的平均值±标准差，用one-wayanova进行方差分析(###代表与正常组比较p＜0.001，*代表与模型对照组比较p＜0.05，**代表与模型对照组比较p＜0.01，***代表与模型对照组比较p＜0.001)。由图可知：msu造成大鼠血清il-1β水平显著升高，提示造模成功；不同剂量受试组合物能够不同程度的下调血清il-1β水平，与模型对照组比较均体现出显著性差异；pptn和地塞米松也体现出了预期的效果，表明实验结果真实可信。

图5中数据是10只大鼠滑膜组织il-1β水平的平均值±标准差，用one-wayanova进行方差分析(###代表与正常组比较p＜0.001，*代表与模型对照组比较p＜0.05，**代表与模型对照组比较p＜0.01，***代表与模型对照组比较p＜0.001)。由图可知：msu造成大鼠滑膜组织il-1β水平显著升高，提示造模成功；不同剂量受试组合物能够不同程度的下调滑膜组织il-1β水平，与模型对照组比较均体现出显著性差异；pptn和地塞米松也体现出了预期的效果，表明实验结果真实可信。