本发明涉及生物制药
技术领域：
：，尤其涉及曲札茋苷或其衍生物的用途。
背景技术：
：：运动神经元病(mnd)是一组病因未明的选择性侵犯脊髓前角细胞、脑干运动神经元、皮层锥体细胞及锥体束的慢性进行性神经变性疾病。根据临床表现的不同，运动神经元病一般可以分为以下四种类型：肌萎缩侧索硬化症(als)；进行性肌肉萎缩(pma)；进行性延髓麻痹(pbp)；原发性侧索硬化(pls)。其危害性在于选择性逆行损害运动神经元，表现为神经元所支配的肌肉活动障碍、萎缩，如累及咽喉部、呼吸肌将导致生命终止。再者累及运动神经元导致所支配的肌肉活动不能或不协调，导致容易摔跤甚至出现生命危险，给患者及其家庭生活质量、心身和经济水平都带来严重的伤害和影响。als是一种病因未明的选择性侵犯脊髓前角细胞、脑干运动神经核及锥体束的慢性进行性变性疾病，临床表现为上下运动神经元合并受损的体征，是慢性运动神经元疾病中最常见的类型。其症状有肌力减退、肌肉萎缩，并逐渐发展为饮食呛咳、吞咽困难、呼吸困难，直到死亡，90％的als为散发性(sals)，10％的als为家族性(fals)。als的发病机制尚不明确，可能涉及兴奋性氨基酸毒性作用、神经营养因子的缺失和异常、氧化应激、蛋白质错误折叠和异常聚集、线粒体功能障碍、凋亡、神经炎性反应、非运动神经元参与等方面。炎症和氧化应激在sod1介导的运动神经元变性中的作用成为近来研究热点。该病目前缺乏有效的治疗方法，病人的存活期一般为3-5年。尽管多年来有许多药物被研究，利鲁唑(riluzoletablets，其化学名称为：2-氨基-6-三氟甲氧基苯并噻唑)仍是惟一被fda批准应用于治疗als的药物，但其也只能有限的延长病人的生存期，而且该药极其昂贵，绝大多数患者家庭难以承受，该药还会导致肝肾功能损害，因此急需开发更为安全、经济和有效的药物。近年来，科学家们根据可能的发病机制如兴奋性氨基酸毒性作用、氧化应激和线粒体功能障碍、凋亡、免疫和神经炎症反应、神经营养因子的缺失和异常、基因突变、环境因素等假说进行了大量研究，试图寻找出有效的治疗方法。曲札茋苷((e)-1-(3，5-二羟苯基)-2-(3-羟基-4-o-β-d-吡喃葡萄糖苯基)乙烯或3，5，3'，4'-四羟基茋-3'-o-β-葡萄糖苷)，其植物来源为拉萨大黄根茎，白皮杉醇为曲札茋苷的苷元。中国专利(申请号：201010116358.2)《曲札茋苷在制备防治心脑缺血基本制剂中的应用及其制备方法》；中国专利(申请号：2011110371198.0)《一种测定拉萨大黄中曲札茋苷含量的高效液相色谱方法》；中国专利(申请号：201110253242.8)《一种制备白皮杉醇的方法》公开了曲札茋苷的提取工艺、检测方法及制备曲札茋苷的苷元白皮杉醇的方法。现有技术表明曲札茋苷及其衍生物具有治疗缺血性心脑血管疾病方面的活性，但未见在治疗和预防als药物中的用途报道。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供本发明公开了曲札茋苷或其衍生物的医药用途，本发明通过实验发现曲札茋苷或其衍生物具有抑制兴奋性氨基酸毒性、提高神经细胞活性、降低神经细胞中mda水平，促进神经细胞增殖等作用，且曲札茋苷或其衍生物对als细胞模型存在显著的保护作用。本发明提供了曲札茋苷或其衍生物在制备保护神经细胞的制剂中的应用。本发明实施例中，所述保护为降低神经细胞中mda水平。所述神经细胞为神经元细胞；一些实施例中，所述神经元细胞为正常神经元细胞，另一些实施例中，所述神经元细胞为转染hsodlg93a的神经元细胞。所述的正常神经元细胞为nsc34细胞或转染hsodlwt质粒的nsc34细胞。此实施例中，在nsc34细胞内转入hsodlg93a和hsodlwt质粒，以建立als细胞模型及对照细胞模型。此模型的构建为本领域认可的als疾病细胞模型构建方法。在转染的nsc34细胞内分别给予10、20、40μmol·l-1的曲札茋苷、白皮杉醇或白藜芦醇培养48h后，发现细胞形态均没有明显变化。与正常培养的nsc34细胞相比，hsodlg93ansc34细胞中mda含量明显升高(p<0.001)，而在给予20、40μmol·l-1曲札茋苷、白皮杉醇给药后，mda含量明显降低(p<0.01)，并且呈现一定的剂量相关性；而白藜芦醇对mda含量的降低无统计学差异，本发明实施例中，所述保护为提高神经细胞活力。所述神经细胞为神经元细胞；一些实施例中，所述神经元细胞为正常神经元细胞，另一些实施例中，所述神经元细胞为转染hsodlg93a的神经元细胞。所述的正常神经元细胞为nsc34细胞或转染hsodlwt质粒的nsc34细胞。此实施例中，在转染的nsc34细胞内分别给予10、20、40μmol·l-1的曲札茋苷、白皮杉醇或白藜芦醇培养48h后，在给予20、40μmol·l-1曲札茋苷、白皮杉醇干预后的细胞数目较未给药组的细胞数目有所增加(p<0.05)；白藜芦醇有增加趋势，但无统计学差异。本发明实施例中，所述保护为抑制神经兴奋毒性、抑制神经细胞的凋亡和/或促进神经细胞的增殖。一些实施例中，所述神经兴奋毒性为谷氨酸诱导的神经兴奋毒性。本发明试验表明，谷氨酸在100mm剂量下引起神经细胞(人神经母细胞瘤细胞)的兴奋毒性损伤，对于谷氨酸诱导的sh-sy5y细胞神经兴奋毒性，曲札茋苷和白皮杉醇在300μm剂量下均能显著对抗神经毒性作用，白藜芦醇作用不明显。本发明中，与假手术组比较，模型组大鼠脑缺血-再灌后24h，脑内tunel法染色标记的凋亡细胞以及cleavedcaspase-3免疫阳性(cleavedcaspase-3-ir)细胞均出现增多(p<0.01)，曲札茋苷4mg/kg组均可以明显减少脑内tunel法染色标记的凋亡细胞以及cleavedcaspase-3免疫阳性(cleavedcaspase-3-ir)细胞另一些实施例中，与假手术组相比，模型组动物脑缺血-再灌24h后，脑内ki67的水平显著增多(p<0.01)，曲札茋苷4mg/kg给药后ki67有减少的趋势，但无显著性差异(与模型组比较，p>0.05)。在缺血-再灌的同时，腹腔注射brdu，再灌后24h，在缺血侧脑区可以观测到brdu的水平显著增多(p<0.01vs假手术组)，这种作用可以被静脉给予曲札茋苷4mg/kg所对抗(p<0.01vs模型组)。连续两周给予brdu，模型组动物缺血侧脑区brdu的水平则显著减少，而给予曲札茋苷组大鼠缺血侧脑区brdu的水平则明显增多(p<0.05vs模型组)。这一结果说明，曲札茋苷具有促进细胞增殖的作用。研究表明，曲札茋苷或其衍生物具有体外抗氧化的作用。实验表明，白皮杉醇与依达拉奉对o2－·的清除能力相近，ic50分别为5.81、13.85μm；曲札茋苷、白藜芦醇有一定清除作用，而vc未能测出ic50。白皮杉醇对oh·清除能力最强，ic50为9.29μm；vc、曲札茋苷次之，白藜芦醇最弱，ic50分别为27.2μm、36.82μm、50.24μm。曲札茋苷对abts.+具有较强清除能力，ic50为4.28μm；白藜芦醇、白皮杉醇与vc次之，ic50分别为4.47、11.12和15.52μm。白皮杉醇还原能力最强，其ec50为38.22μm；曲札茋苷与vc、依达拉奉作用相当，白藜芦醇最弱，ec50分别为127.1、80.18、94.55、136.09μm。基于以上结果，本发明提供了曲札茋苷或其衍生物在制备防治运动神经元病的药物中应用。具体的，所述运动神经元病为肌萎缩侧索硬化症。曲札茋苷及其衍生物具有抑制兴奋性氨基酸毒性、提高神经细胞活性、降低神经细胞中mda水平，促进神经细胞增殖等神经保护作用，根据als可能的发病机制，曲札茋苷及其衍生物能针对以上发病机制进行干预，对als起到预防和治疗作用。本发明中，所述曲札茋苷的衍生物为白皮杉醇。本发明还提供了一种防治运动神经元病的药物，其包括曲札茋苷或其衍生物中的至少一种。本发明所述药物的剂型为片剂、胶囊、口服液、混悬剂、注射剂等。本发明还提供了一种防治运动神经元病的方法，其为给予本发明所述的药物。所述运动神经元病为肌萎缩侧索硬化症。所述给予的剂量为4mg/kg。本发明研究表明，曲札茋苷或其衍生物具有抑制兴奋性氨基酸毒性、抗神经细胞凋亡、提高神经细胞活性、降低神经细胞中mda水平，促进神经细胞增殖等作用，且曲札茋苷或其衍生物对als细胞模型存在显著的保护作用。实验结果显示：(1)曲札茋苷、白皮杉醇能明显促进转染hsodlg93a质粒后的nsc34细胞存活，活力明显增加(p<0.001)；并具有降低mda的作用(p<0.01)。(2)曲札茋苷体外对abts·+的清除作用最强，白皮杉醇次之；在清除o2－·、oh·及总还原能力方面白皮杉醇作用最强，曲札茋苷次之。(3)对于谷氨酸诱导的神经兴奋毒性，曲札茋苷和白皮杉醇在300μm剂量下均能显著对抗神经毒性作用。(4)曲札茋苷4mg/kg可以明显减少线栓法诱导局灶性脑缺血大鼠脑内tunel法染色标记的凋亡细胞以及cleavedcaspase-3免疫阳性(cleavedcaspase-3-ir)细胞，提示曲札茋苷4mg/kg具有抗神经元凋亡作用；同时可使慢性脑缺血大鼠缺血侧脑区brdu水平明显增多，提示曲札茋苷对神经细胞具有明显修复作用。附图说明图1示曲札茋苷对nsc34细胞活力的影响；图2示曲札茋苷对hsodlg93a和hsodlwtnsc34细胞活力的影响；图3示曲札茋苷对hsodlg93a和hsodlwtnsc34细胞中mda的影响；图4示feso4反应浓度与吸光度值之间关系。具体实施方式本发明提供了曲札茋苷及其衍生物的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1对肌萎缩侧索硬化症细胞模型的作用1供试品曲札茋苷，分子量406，白色结晶或结晶性粉末，纯度99.6％，批号20120402；白皮杉醇，分子量244，红棕色粉末，纯度99.8％，批号906099a；白藜芦醇，分子量228，白色粉末，纯度99.8％，批号cy120325。2实验细胞及质粒nsc34鼠神经元细胞，购自广州吉妮欧生物科技有限公司。细胞培养选用含10％fbs的dmem培养基，置于37℃，5％co2的培养箱内培养。pf141pacgfplsod1wt和pf145pacgfplsod1g93a质粒由普如汀生物技术(北京)有限公司构建并测序。3试剂及仪器dmem培养基、多聚赖氨酸、dmso(gibco，usa)；lipofectamine2000(invtrogen，usa)；胎牛血清(fbs，hycolne,usa)；青霉素—链霉素(sigma)；过硫酸铵、temed、噻唑蓝(mtt)(sigma，usa)；丙烯酰胺、n',n’一亚甲基双丙烯酰胺(amersco，usa)；sds(biomol，usa)；pvdf膜(millipore，usa)；bca蛋自定量试剂盒(碧云天)；lipofectaminetm2000(invitrogen公司)；5×loadingbuffer(fermentas，usa)；mda试剂盒(南京建成生物工程研究所)；其余各种试剂均为进口或者国产分析纯的试剂。主要仪器：thermoforma3121型二氧化碳培养箱(thermo，usa)；biofuge台式冷冻离心机(thermo，usa))；xse型电子分析天平(梅特勒，瑞士)；milli-qintegral5超纯水系统(millipore，usa)；超低温冰箱(thermo，usa)；synergy2酶标仪(biotek，usa)；v-ges电泳仪(wealteccrop)；sts-3型脱色摇床(上海琪特分析仪器有限公司)；chemidoc-itimager型化学发光成像分析系统(uvp)。4试验方法4.1细胞培养：从液氮中取出一支冻存的nsc34细胞，加入含10％fbs血清的dmem培养基进行培养，每隔2天更换一次培养基。置于含5％co2的37℃培养箱培养。4.2细胞转染：转染前一天将nsc34细胞用含有0.25％edta胰酶消化接种在6孔板中，培养细胞生长至90％汇合度，用lipofectamine2000按说明书操作转染hsodlwt和hsodlg93a质粒各10μg，转染6h后更换为正常培养基，继续培养并用g418400mg·l-1进行细胞筛选。4.3药物干预：在已包被的96孔板内加人5×104个·ml-1细胞悬液100μl，或在已包被的6孔板内加入2×105个·ml-1的细胞悬液2ml，培养48h后进行药物干预处理。预先用含10％fbs的dmem培养基稀释曲札茋苷、白皮杉醇、白藜芦醇至10、20、40μmol·l-1。96孔板加人100μl或6孔板加人2ml含药(实验组)或不含药(对照组)的dmem完全培养基，置于细胞培养箱内培养，48h后观察细胞形态和活力。4.4mtt检测：药物干预48h后，在96孔板内每孔加人10μl的mtt(50mg·ml-1),4h后加人三联液37℃过夜孵育，酶标仪测定570nm条件下od值，分析细胞的活力。4.5蛋白印迹：将待处理的细胞吸出上清培养基，用pbs洗两次后吸净，加人细胞裂解液后置于冰上超声破碎，于40℃，12000r·min-1离心30min，取上清。用bca蛋白定量试剂盒按操作说明进行定量后，每组调整至蛋白浓度一致，加人1/4体积的5×loadingbuffer，混匀后煮沸5min使蛋白变性，-70℃保存。采用蛋自sds-page蛋白印迹方法配制10％的分离胶，等量上样，进行电泳、转膜、封闭后加抗体，采用ecl显色，观察细胞内sod1蛋白的表达。4.6mda试剂盒检测：取出细胞培养6孔板，用4℃的pbs洗两次，再加人1mlpbs并用细胞刮刀将细胞刮下，转移至1.5mlep管内，1000r·min-1，离心5min，小心吸出上清后，再加人200μl细胞裂解液，冰水浴匀浆，2500r·min-1，离心10min，取上清液按mda试剂盒说明检测。4.7统计学处理方法实验数据采用graphpadprism7.0软件进行分析，数据以表示，应用单因素方差分析(anova)和newman-keulspost-hoc进行组间显著性检验。5试验结果5.1对nsc34细胞的影响为探究曲札茋苷、白皮杉醇、白藜芦醇对正常培养的nsc34细胞是否存在促存活及细胞毒性作用，实验给予nsc34细胞以10、20、40μmol·l-1的曲札茋苷、白皮杉醇、白藜芦醇培养48h，并采用显微镜观察和mtt检测nsc34的细胞形态及活力变化。与正常培养的nsc34细胞相比，给药各组与对照组之间在细胞形态及活力无明显差异(p>0.05)，见图1。结果表明，在正常培养的nsc34细胞中，曲札茋苷、白皮杉醇没有明显促存活或细胞毒性作用。5.2建立als细胞模型本实验在nsc34细胞内转入hsodlg93a和质粒，以建立als实验及对照细胞模型。结果显示，在转染hsodlg93a和hsodlwt质粒后，检验正常培养的nsc34和hsodlg93ansc34细胞内sod1蛋白表达水平，以进一步验证hsodlg93ansc34细胞内sod1蛋白表达水平。结果表明，hsodlg93ansc34细胞内sod1水平明显增加，als模型建立成功。5.3对hsodlg93ansc34细胞有保护作用为探讨曲札茋苷、白皮杉醇、白藜芦醇对als细胞模型的的影响，在hsodlg93a和hsodlwtnsc34细胞上采用不同浓度的曲札茋苷、白皮杉醇、白藜芦醇进行干预处理，观察细胞形态及mtt活力变化。在转染的nsc34细胞内给予10、20、40μmol·l-1的曲札茋苷、白皮杉醇、白藜芦醇培养48h后，发现细胞形态均没有明显变化，但20、40μmol·l-1曲札茋苷、白皮杉醇干预后的细胞数目较未给药组的细胞数目有所增加(p<0.05)；白藜芦醇有增加趋势，但无统计学差异，见图2。5.4曲札茋苷降低mda水平鉴于曲札茋苷、白皮杉醇对als的作用机制仍不清楚，本次实验测定了正常培养nsc34细胞和hsodlg93ansc34细胞各组的脂质过氧化物丙二醛(malonaldehyde，mda)的水平变化。实验结果发现与正常培养的nsc34细胞相比，hsodlg93ansc34细胞中mda含量明显升高(p<0.001)，而在给予20、40μmol·l-1曲札茋苷、白皮杉醇给药后，mda含量明显降低(p<0.01)，并且呈现一定的剂量相关性；而白藜芦醇对mda含量的降低无统计学差异，见图3。实施例2体外抗氧化作用1供试品曲札茋苷，分子量406，白色结晶或结晶性粉末，纯度99.6％，批号20120402；白皮杉醇，分子量244，红棕色粉末，纯度99.8％，批号906099a；白藜芦醇，分子量228，白色粉末，纯度99.8％，批号cy120325。以上样品均由昆药集团药物研究院提供，常温密封、避光保存。试验时，以1/10万电子分析天平称取，用dmso溶解、配制和稀释，并使各检测体系中dmso的浓度控制在1％。2对照品维生素c，纯度99.5％，石药集团维生药业(石家庄)有限公司，批号1130172056；依达拉奉注射液，30mg/20ml，昆明积大制药股份有限公司，批号131202。3试剂焦性没食子酸(邻苯三酚)，国药集团上海化学试剂有限公司(批号：20140320)；吩嗪硫酸甲酯(pms)，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，genview分装，lot：3ae10130；还原型辅酶ⅰ(nadh)，1g，biosharp，exp：2017/11；硝基四唑氮蓝(nbt)，100mg，biosharp，exp：2016/11；二苯代苦味肼自由基(dpph)，lot：wa0808ea14，上海源叶生物科技有限公司；abts，lot：slbh2992v，sigma；苯酚，lot：lj0607s10010j，生工生物工程(上海)有限公司；4-氨基安替比林(4-aa)，lot：yk0709b1013j，生工生物工程(上海)有限公司；辣根过氧化物酶(pod)，lot：lj0731ya14,activity≥300u/mg，上海源叶生物科技有限公司。浓hcl(20090420)、naoh(20091001)、koh(20110223)，云南杨林工业开发区汕滇药业有限公司；kh2po4(20090304)，汕头市达濠精细化学品有限公司；feso4·7h2o(20110223)，国药集团化学试剂有限公司；na2hpo4·12h2o(20131120)天津市瑞金特化学品有限公司，ar；三氯乙酸(tca)(20131105)，广东光华科技股份有限公司；k2po4.3h2o(0100722)、铁氰化钾[k3fe(cn)6](20140510)、fecl3·6h2o(20131020)、nah2po4·2h2o(20120202)、过硫酸钾(k2s2o8)、30％h2o2(20140210)，天津市风船化学试剂科技有限公司。成套ph校准缓冲剂，上海市爱建试剂厂，批号0920515；tris-base，purity≥99.9％，amresco，exp2015/12；dmso，gc99.5％，083k0135，sigma。4仪器及耗材powerwavexs2全波长酶标仪，biotek；ub-7型ph计，丹佛仪器(北京)有限公司；elix纯水机、milii-q超纯水机，millipore；ac211s电子分析天平，sartorius；dhg—9245a型电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；sk-8200h超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；0.5～10μl、10～100μl、200～1000μl单道微量移液器，eppendorf；50～300μl8道微量移液器，bioscience；0.2～10μl、5～120μl单道电动移液器及10～300μl8道电动移液器，biohit；其它玻璃仪器及耗材，国产。5试验方法和结果5.1对o2－·清除能力的影响本试验采用pms-nadh-nbt体系[10-11]，按表1依次加入各反应试剂，混匀后置室温避光反应5min，以空白孔调零，于560nm处测定od值，每浓度设置3孔重复，结果取均值，计算o2－·清除率及ic50。结果见表2。表1pms-nadh-nbt反应体系反应试剂空白孔(μl)标准孔(μl)测定孔(μl)供试液－－50溶媒(10％dmso)5050－50mmtris－hcl，ph8.01601601601mmnadh2020200.5mmnbt20202010μmpms－5050h2o50－－表2系列样品对o2－·的清除能力名称ic50(μm)白皮杉醇5.81曲札茋苷419.00白藜芦醇250vc/依达拉奉13.85由表2可见，白皮杉醇与依达拉奉对o2－·的清除能力相近，ic50分别为5.81、13.85μm；曲札茋苷、白藜芦醇有一定清除作用，而vc未能测出ic50。5.2对oh·清除能力的影响本试验根据pod与h2o2反应过程中产生oh·的原理，采用pod-aa-phenol显色法体系[12-13]，按表3依次加入各反应试剂，混匀后37℃反应10min，以空白孔调零，于505nm处测定od值，每浓度测定3孔，结果取均值。结果见表4。表3pod-aa-phenol显色法反应体系反应试剂空白孔(μl)标准孔(μl)测定孔(μl)供试品－－50溶媒(10％dmso)5050－50mmtris－hcl，ph7.41551551552％4-aa1515150.94％phenol1515150.1u/mlpod1515152mmh2o2－5050h2o50－－表4系列样品对oh·的清除能力名称ic50(μm)白皮杉醇9.29曲札茋苷36.82白藜芦醇50.24vc27.17由表4可见，白皮杉醇对oh·清除能力最强，ic50为9.29μm；vc、曲札茋苷次之，白藜芦醇最弱，ic50分别为27.2μm、36.82μm、50.24μm。5.3对abts.+清除能力的影响参照文献采用teac法，按表5依次加入各反应试剂，混匀后室温避光反应10min，以空白孔调零，于734nm处测定od值，每浓度测定3孔，结果取均值。结果见表6。表5abts反应体系反应试剂空白孔(μl)标准孔(μl)测定孔(μl)供试品－－50溶媒(10％dmso)5050－abts反应液－25025095％etoh250－－表6系列样品对abts.+的清除能力名称ic50(μm)白皮杉醇11.12曲札茋苷4.28白藜芦醇4.47vc15.52由表6可见，曲札茋苷对abts.+具有较强清除能力，ic50为4.28μm；白藜芦醇、白皮杉醇与vc次之，ic50分别为4.47、11.12和15.52μm。5.4对总还原能力的影响本试验采用fecl3还原法，按表7依次加入各反应试剂，以空白孔调零，于700nm处测定od值，每浓度测定3孔，结果取均值。另取0.06、0.12…3.7mm浓度的feso4溶液30μl制作标准曲线(见表8和图4)，将使反应体系中1μmfe3+还原为fe2+的能力定义为1个还原单位，计算各受试物使反应体系中168.2μmfe3+半数还原为fe2+的ec50。结果见表9。表7toc测定反应体系表8不同浓度feso4在反应体系中生成物与吸光度值表9系列样品对总还原能力(toc)的影响名称ec50(μm)白皮杉醇38.22曲札茋苷127.10白藜芦醇136.09vc80.18依达拉奉94.55由表9可见，白皮杉醇还原能力最强，其ec50为38.22μm；曲札茋苷与vc、依达拉奉作用相当，白藜芦醇最弱，ec50分别为127.1、80.18、94.55、136.09μm,。综上，曲札茋苷体外对abts·+的清除作用最强，白皮杉醇次之；在清除o2－·、oh·及总还原能力方面白皮杉醇作用最强，曲札茋苷次之。实施例3对谷氨酸诱导神经兴奋毒性的作用1实验材料1.1受试样品曲札茋苷，分子量406，白色结晶或结晶性粉末，纯度99.6％，批号20120402；白皮杉醇，分子量244，红棕色粉末，纯度99.8％，批号906099a；白藜芦醇，分子量228，白色粉末，纯度99.8％，批号cy120325。配制方法：受试物先以dmso配制成10mm母液，再以生理盐水稀释至所需浓度。1.2阴性对照品氯化钠注射液(0.9％生理盐水)，青州尧王制药有限公司，批号：2215110901，规格：500ml/瓶。1.3阳性对照品依达拉奉注射液，南京先声东元制药有限公司，批号：80-170102，规格：5ml:10mg。1.4sh-sy5y人神经母细胞瘤细胞人脑神经母细胞瘤，转移部位骨髓，生长特征：贴壁生长，上海复祥生物科技有限公司。1.5实验仪器全自动酶标仪，labsystemdragon公司生产；co2培养箱，德国heaeus公司生产；倒置相差显微镜，metrio公司生产。1.6其它试剂四氮唑蓝(mtt)：sigma公司生产，批号：67r338v；dmem培养液：bi公司生产，批号：0035316；d-hanks缓冲液：bi公司生产，批号：0022016；胎牛血清：panbiotech生产，批号：p140107；青-链霉素：hyclone生产，批号：j140055；胰酶：corining生产，批号：12616003；谷氨酸：sigma公司生产，批号：bcbg7324v。2实验方法及结果细胞分为正常培养组，模型组，给药组和阳性对照组。细胞经药物处理后，除正常组和模型组外，各给药组先给予不同浓度受试物预处理0.5h后，再与100mm谷氨酸孵育24h。24h后作mtt分析，以测定细胞存活率。具体地，每孔加入5mg/mlmtt溶液，使其终浓度为0.5mg/ml，在培养箱内继续培养4h，然后弃培液，每孔加入200μldmso，在酶标仪上读取光密度od值(测定波长570nm)。根据公式计算结果：所有数据以均值±标准差表示。统计学比较应用anova分析，组间差异采用fisherlsd检验进行。结果如表10所示，谷氨酸可剂量依赖性的损伤神经细胞。结合文献选用100mm剂量作为后续研究的兴奋毒性损伤剂量。如表11所示，谷氨酸在100mm剂量下引起神经细胞的兴奋毒性损伤，这种作用可为阳性药依达拉奉(100μm)所对抗。曲札茋苷和白皮杉醇在300μm剂量下具有显著对抗神经毒性作用；白藜芦醇作用不明显。表10谷氨酸对sy5y神经细胞的兴奋毒性**p<0.01vs阴性对照表11.不同受试物对谷氨酸诱导sy5y神经细胞兴奋毒性的作用**,p<0.01vs阴性对照组；##,p<0.01vs模型组3结论结果表明，对于谷氨酸诱导的sy5y细胞神经兴奋毒性，曲札茋苷和白皮杉醇在300μm剂量下均能显著对抗神经毒性作用，白藜芦醇作用不明显。实施例4、对局灶性脑缺血大鼠神经元凋亡及再生的影响1实验材料1.1受试样品注射用曲札茋苷，昆药集团股份有限公司，规格：20mg/支(每支含曲札茋苷20mg，辅料羟丙基-β环糊精100mg)，批号：20121031-01配制：取一支，用0.9％氯化钠注射液溶解至2ml，得10mg/ml溶液，并稀释得2mg/ml溶液，备用。1.2试剂tunel试剂盒，roche，批号10348000；brdu：sigma，批号hmbd2252v；抗brdu抗体：biorad，批号0413；抗大鼠ki-67570抗体：ebioscience，批号e16297-102；抗bcl-2抗体：cellsignalingtechnology，批号16；抗bax抗体：cellsignalingtechnology，批号14；抗cleavedcaspase-3抗体：cellsignalingtechnology,批号19；alexafluor568驴抗兔igg(h+l)：molecularprobes，批号1134929；alexafluor568羊抗大鼠igg(h+l)：molecularprobes，批号1259374；iba-1：wako，批号019-19741；tritonx-100：sigma，批号031m0301v；β-actin(c4)-hrp：santacruztechnology，批号f2614；goatanti-rabbitigg-hrp：santacruztechnology，批号j2414；goatanti-mouseigg-hrp：santacruztechnology，批号g3114；bca蛋白定量试剂盒：上海威奥生物科技有限公司，批号wb0123；trizmabase：sigma，批号wxbb23800；glycerol：生工生物，批号0830sj80；dtt：上海威奥生物科技有限公司，批号wb0145；丙烯酰胺：生工生物，批号10798524；bis-acralamide：生工生物，批号10796524；sds：amresco，批号0227；甘氨酸：amresco，批号0176；aps：上海威奥生物科技有限公司，批号wb0142；temed：上海威奥生物科技有限公司，批号wb0150；tween-20：生工生物，批号0710sj100；pvdf膜：millipore，批号k2pa0943dk；bsa：上海威奥生物科技有限公司，批号wh1044；ecl超敏显色液：上海威奥生物科技有限公司，批号wb0164；1.3实验动物sd大鼠，雄性，体重：230～250克；上海斯莱克实验动物有限公司，动物生产许可证号：scxk(沪)2012-0002。饲养：动物饲养于正压净化通风动物房内，室温24±1℃，湿度40～70％，人工照明模拟昼夜变化，自由进食与饮水。1.4实验仪器western电泳电源：bg-power600k，北京百晶生物技术有限公司；fluorcheme成像系统：proteinsimple,santaclara,ca,usa；荧光显微镜：smz800，nikon。2实验方法及结果2.1实验分组健康雄性sd大鼠60只分成3组，每组20只，分别为假手术组(0.9％氯化钠注射液)、模型组(0.9％氯化钠注射液)、曲札茋苷组(4mg/kg)。给药途径及给药时间：各组均于再灌注时静脉注射给药，给药体积2ml/kg。2.2模型复制2.2.1神经细胞凋亡实验将大鼠麻醉，手术阻断右侧mca的所有血流来源。扎紧备线，2小时后，舌下静脉给予各组药物后拔出尼龙线，使其血流再通，结扎备线并缝合皮肤，将手术大鼠放回笼内饲养。再灌后24h，部分动物(每组10只)腹腔注射12％水合氯醛麻醉后，以0.9％氯化钠注射液经升主动脉全身灌流，右心房剪口，至流出液无色，再灌以4％多聚甲醛；灌流固定后取大脑，并在同样的固定液里后固定12-16h。固定好的脑进行冰冻切片，置于冻存保护液中，-20℃保存备用，以进行cleavedcaspase-3和ki-67免疫组织化学染色，tunel染色。另外部分动物(每组10只)直接取大脑，-80℃保存备用，以进行bax和bcl免疫印迹实验。2.2.2神经细胞再生实验急性期实验：大鼠按2.2.1方法进行模型复制，在缺血的同时给予brdu(10mg/kg,1ml/kg)，再灌后24h，动物经多聚甲醛灌流固定，取大脑行冰冻切片，以进行brdu免疫组化染色。慢性实验：大鼠按2.2.1方法进行模型复制，在缺血的同时给予brdu(10mg/kg,1ml/kg)，每天一次，共14天。最后一次给予brdu24h后，进行灌流固定，取大脑行冰冻切片，以进行brdu免疫组化染色。2.3评价指标2.3.1对神经元凋亡的影响在本研究中检测了凋亡细胞(tune法)以及与凋亡相关的信号分子(如caspase-3和bax等)。表12所示：与假手术组比较，模型组大鼠脑缺血-再灌后24h，脑内tunel法染色标记的凋亡细胞以及cleavedcaspase-3免疫阳性(cleavedcaspase-3-ir)细胞均出现增多(p<0.01)，曲札茋苷4mg/kg组均可以明显减少脑内tunel法染色标记的凋亡细胞以及cleavedcaspase-3免疫阳性(cleavedcaspase-3-ir)细胞(与模型组比较，p<0.05或p<0.01)。表12.对脑细胞凋亡的影响*p<0.05,**p<0.01vs假手术+ns；#p<0.05,##p<0.01vs模型+ns2.3.2对神经元存活的影响如表13所示：与假手术组相比，模型组动物脑缺血-再灌24h后，脑内ki67的水平显著增多(p<0.01)，曲札茋苷4mg/kg给药后ki67有减少的趋势，但无显著性差异(与模型组比较，p>0.05)。在缺血-再灌的同时，腹腔注射brdu，再灌后24h，在缺血侧脑区可以观测到brdu的水平显著增多(p<0.01vs假手术组)，这种作用可以被静脉给予曲札茋苷4mg/kg所对抗(p<0.01vs模型组)。如表14所示：连续两周给予brdu，模型组动物缺血侧脑区brdu的水平则显著减少，而给予曲札茋苷组大鼠缺血侧脑区brdu的水平则明显增多(p<0.05vs模型组)。这一结果说明，曲札茋苷具有促进细胞增殖的作用。表13对脑细胞增殖的影响组别剂量(mg/kg)nki67(急性)brdu(急性)假手术+ns--429.2±20.115.6±14.5模型+ns--659.2±30.2**43.2±24.8**曲札茋苷4643.1±17.124.7±17.7##*p<0.05,**p<0.01vs假手术+ns；#p<0.05,##p<0.01vs模型+ns表14对大鼠缺血再灌2周后脑细胞增殖的影响组别剂量(mg/kg)nbrdu(慢性)假手术+ns--559.4±57.7模型+ns--716.3±15.4*曲札茋苷4553.2±49.7#*p<0.05，**p<0.01vs假手术+ns；#p<0.05，##p<0.01vs模型+ns2.4小结曲札茋苷4mg/kg可以明显减少线栓法诱导局灶性脑缺血大鼠脑内tunel法染色标记的凋亡细胞以及cleavedcaspase-3免疫阳性(cleavedcaspase-3-ir)细胞，提示曲札茋苷4mg/kg具有抗神经元凋亡的作用；同时可使慢性脑缺血大鼠缺血侧脑区brdu水平明显增多，提示曲札茋苷对神经细胞具有明显修复作用。综上，曲札茋苷及其衍生物具有抑制兴奋性氨基酸毒性、抗氧化、抗神经细胞凋亡、促进神经细胞存活、增殖等神经保护作用，根据als可能的发病机制，曲札茋苷及其衍生物能针对以上发病机制进行干预，对als起到预防和治疗作用。具有很好的临床应用前景。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
：的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12当前第1页12