本发明属于医药领域，涉及一种负载药物的骨修复材料、其制备方法。
背景技术：
理想的骨组织工程细胞外基质材料一般要求具有良好的生物相容性，良好的生物降解性，具有三维立体多孔结构，可塑性和一定的机械强度，骨引导活性及易消毒性。目前的骨修复材料一般分为三大类，主要有天然高分子材料，如甲壳素及其衍生物、胶原、纤维蛋白胶；人工合成高分子，如聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸聚乙醇酸共聚物；无机材料，如生物降解类陶瓷、羟基磷灰石、珊瑚及乌贼骨。
为使骨填充材料既能满足机械强度的需求，同时也具有较高的生物活性并发挥一定的局部治疗作用，复合人工骨修复材料一直以来是近年来的研究重点，壳聚糖作为一种生物大分子材料具有较强的吸附作用，可以作为生长因子的载体，有利于新生组织的结构重塑和构建，因此在骨组织工程方面有巨大的应用潜力，现已有诸多对于壳聚糖-羟基磷灰石复合材料的报道显示壳聚糖含量为30％时，复合材料的抗压强度最高，达120mpa左右([j].材料导报,2012,26(15):102-106)；虽然目前的骨修复材料可满足骨组织修复与替代材料的要求，但尚不能满足持续和稳定释放药物的能力。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种效果更优的载药骨修复材料，并提供其制备方法。本发明提供的载药骨修复材料在具有良好机械强度与生物相容性的同时，可根据组织内部炎症情况，局部释放药物，达到长效稳定释放的效果。
本发明优选的实施例方案中，所述的骨修复材料包含海藻酸钠、壳聚糖、多矿物质磷酸钙微球、透明质酸、聚山梨醇酯20、ph调节剂、负载药物的聚合物。
本发明另外优选的实施例方案中，所述的骨修复材料由海藻酸钠、壳聚糖、磷酸钙多孔微球、透明质酸、ph调节剂、负载药物的聚合物、细胞培养液、去离子水组成，所述各组分按质量百分比计算，海藻酸钠含量为0.3～0.8％，壳聚糖含量为0.1～0.5％，多矿物质磷酸钙多孔微球含量为30～50％、透明质酸含量为0.1～1％、ph调节剂含量为0.01～0.05％、聚山梨醇酯20含量为1～5％，负载药物的聚合物含量为1～4％，细胞培养液含量为10～20％，水含量为10～20％，上述组分之和为100％。
本发明优选的实施例方案中，所述聚合物选自ph敏感性聚合物。
本发明优选的实施例方案中，所述聚合物选自由聚乙二醇和聚酯组成的嵌段共聚物。
本发明优选的实施例方案中，所述聚乙二醇和聚酯的质量比选自1:1～1:3，优选1:1、1:1.5、1:2、1:3。
本发明优选的实施例方案中，所述聚酯选自丙交酯、乙交酯的一种或两种；所述聚乙二醇选自双羟基聚乙二醇、单甲氧基聚乙二醇的一种或两种。
本发明优选的实施例方案中，所述聚乙二醇的分子量选自1000～10000。
本发明优选的实施例方案中，所述ph调节剂选自磷酸钠、磷酸二氢钠、柠檬酸钠。
本发明优选的实施例方案中，所述多矿物质磷酸钙多孔微球平均粒径选自1000～2000nm，优选1500nm。
本发明优选的上述实施例方案中，所述药物选自局麻药物，所述局麻药物选自布比卡因、利多卡因、普鲁卡因、丁卡因和罗哌卡因。
本发明优选的上述实施例方案中，所述药物选自抗生素类药物，所述抗生素类药物选自万古霉素、四环素、庆大霉素、妥布霉素、安塞福、头孢他啶、头孢噻肟和头孢羟氨苄。
本发明优选的上述实施例方案中，所述药物选自促骨形成药物，所述促骨形成药物选自甲状旁腺激素或生长激素。
本发明优选的实施例方案中，所述骨修复材料通过如下三步制备得到：
s1、制备得到骨修复材料；
s2、制备得到负载药物的聚合物；
s3、通过将步骤1和步骤2获得的产物与透明质酸、ph调节剂、细胞培养液，去离子水、聚山梨醇酯20进一步混合制备得到载药骨修复材料。
本发明优选具体实施例方案中，所述s1的具体方法为：
(1)将至少两种含磷酸离子无机盐和含硅酸离子无机盐加入聚丙烯酸钠或聚天冬氨酸钠水溶液中得磷酸钠浓度为10％(w/v)的混合溶液，维持温度在30～50℃和ph范围在5.0～8.0；将含有至少两种无机离子的溶液滴加到磷酸钠混合溶液中；滴加完毕后维持溶液体系温度，连续搅拌10分钟～3小时陈化固体沉淀；过滤析出固体沉淀，洗涤过滤，并真空干燥，制备得到多矿物质磷酸钙微球。
(2)室温下称量适量海藻酸钠溶于含ca2+、sr2+的水溶液中，充分搅拌，制备得到约50～100g/l的海藻酸钠水凝胶。
(3)室温下称量适量壳聚糖粉末溶于乙酸溶液中，充分搅拌，制备得到约20～30g/l的壳聚糖溶液。
(4)将按(1)制备得到的多矿物质磷酸钙微球、加入到按(2)制备得到的海藻酸钠水凝胶中，搅拌均匀后再将按(3)制备得到的壳聚糖溶液缓慢滴入，搅拌均匀，制备得到骨修复材料。
本发明更优选的实施例方案中，所述(1)中的含磷酸离子无机盐选自na3po4或k3po4，所述含硅酸离子无机盐选自na2sio3、casio3、k2sio3或k3sio3；所述无机盐与聚丙烯酸钠或聚天冬氨酸钠的摩尔比选自1:7～1:15，优选1:12、1:10；
ph范围进一步优选5.8～7.5；所述无机离子选自ca2+、sr2+、zn2+、mg2+的一种或多种；
本发明进一步优选的实施例方案中，所述(1)中无机离子的总摩尔数与无机盐的总摩尔数之比为5:4～4:3。
本发明进一步优选的实施例方案中，所述(1)中洗涤过滤溶剂选自离子水或无水乙醇。
本发明优选具体实施例方案中，所述s2的具体方法为：
将聚合物与纯水、生理盐水、盐酸盐缓冲溶液或细胞培养液等水相混合搅拌数天(如3～6天)，在水中自发水化形成胶束；或者将聚合物与药物共溶于有机溶剂，旋干成膜，再加入纯水、生理盐水、pbs、或者组织培养液等水化，形成载药胶束。
本发明优选具体实施例方案中，所述s3的具体方法为：
(1)将适量透明质酸粉末溶于去离子水中，充分搅拌，制备得到透明质酸溶液，加入适当柠檬酸钠溶液调节ph至7～8，加入聚山梨醇酯20、步骤1制备得到的骨修复材料、步骤2制备得到的载药胶束、细胞培养液，去离子水充分搅拌得到最终载药骨修复材料。
本发明优选的实施例方案中，发现聚山梨醇酯20对于载药胶束能够均匀分散于骨修复材料中起到了关键作用，使载药胶束不聚集、不沉积，保证释药的连贯性和稳定性。
本发明优选实施例方案中，聚山梨醇酯20占载药骨修复材料的质量比选自1～5％，优选1％。
本发明优选的上述实施例方案中，所述载药骨修复材料通过注射给药，优选局部组织注射，所述局部组织注射选自骨腔。
本发明优选的上述实施例方案中，所述的载药骨修复材料的骨修复材料和负载药物的聚合物在在应用之前优选分开保存，在临用前，通过附带的药用溶剂现配现用。
本发明的有益效果在于：
本发明的载药骨修复材料，制作工艺相对简单，各组分比例适用于微创注射的应用，其良好的流动性可适应不同形状的骨折断面和骨缺损空隙填充；另外本发明的骨修复材料，引入了载药胶束，与传统的通过无机材料制备的多孔微球载药相比，载药量更大，释药更稳定；综上本发明的载药骨修复材料为成骨性细胞迁移、粘附、增殖分化提供了良好的微环境，同时稳定的释药特点可减少局部炎症反应，缓解疼痛，提高患者生活质量，具有非常高的医用价值。
发明详述
在本申请的说明书和权利要求书中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。
具体实施方式
实施例1、骨修复材料的制备
试剂：盐酸、无水乙醇、醋酸、nasio3、na3po3、一水醋酸钙、srcl2、zncl2、mgcl2购买自国药集团化学试剂有限公司；
(1)将nasio3和na3po3按摩尔比为1:12加入聚天冬氨酸钠水溶液中，保持磷酸钠浓度为10％(w/v)，控制混合溶液温度维持在37℃，加入盐酸调节ph至7.0，连续搅拌形成均匀溶液；再将一水醋酸钙、srcl2、zncl2、mgcl2溶液滴入到磷酸钠混合溶液中，使ca2+、sr2+、zn2+、mg2+的总摩尔数与sio32-、po43-的总摩尔数比值为5:4，滴加完毕后维持溶液温度并连续搅拌使之陈化30分钟；停止搅拌并过滤析出沉淀；用去离子水和无水乙醇依次洗涤3次，然后过滤真空干燥，制备得到多矿物质磷酸钙微球。
(2)室温下称量60g海藻酸钠粉末溶于含500ppm的ca2+和50ppm的sr2+的水溶液中，边加入边充分搅拌，使之成为浓度为60g/l的水凝胶。
(3)室温下称量20g壳聚糖粉末，溶于5g/l的乙酸溶液中，充分搅拌使之成为浓度为20g/l的壳聚糖溶液。
(4)称量5g步骤(1)制备得到多矿物质磷酸钙微球，加入3.5ml步骤(2)制备得到的海藻酸钠水凝胶中，充分搅拌均匀后，将步骤(3)制备得到的壳聚糖溶液2.0ml缓慢滴入到水凝胶中，搅拌均匀制备得到可注射骨修复材料约15g。
实施例2、载药胶束的制备
试剂：辛酸亚锡、二氯甲烷、乙醚购买自国药集团化学试剂有限公司；双羟基聚乙二醇、edc·hcl、dmap购买自阿拉丁试剂(上海)有限公司。
(1)在三口烧瓶中加入35g的双羟基聚乙二醇(2000)，130℃真空除水4～5小时，通入氮气冷却至60～70℃，加入丙交酯70g，30mg辛酸亚锡(含少量甲苯)，100℃抽真空30～50分钟，通入氩气保护，升温至130～135℃反应10～14小时。反应完毕后趁热将产物倒出，冷却后把产物溶于二氯甲烷中；采用乙醚进行沉淀，得到bab型嵌段聚合物；去bab型嵌段聚合物15g，加入n-boc-组氨酸3.0g，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)5.2g，4-二甲基氨基嘧啶(dmap)3.7g，二氯甲烷150ml，常温下反应48～54小时，旋蒸除去部分溶剂，用乙醚沉淀，进一步用80℃乙醚洗涤，除去残留的未反应物和催化剂，冷冻干燥。
(2)将10mg万古霉素与三乙胺共溶于甲醇/氯仿(体积比为1:1，下同)中，缓慢滴加至100ml含有上述步骤(1)制备所得聚合物的甲醇/氯仿溶液中(5mg/ml)，旋干成膜，加入磷酸盐缓冲液水化，用0.8μm滤纸过滤，透析除去游离的万古霉素，即可得包载万古霉素的胶束约0.5g，经测定其包封率为95％以上。
实施例3、载药骨修复材料的制备
试剂：聚山梨醇酯20、透明质酸粉末、柠檬酸钠购买自国药集团化学试剂有限公司；细胞培养液购买自南京都莱生物技术有限公司。
将0.05g透明质酸粉末溶于3ml去离子水中，充分搅拌，制备得到透明质酸溶液，加入柠檬酸钠缓冲溶液调节ph至7.2～7.4，加入0.01g聚山梨醇酯20，使之充分混合；向混合溶液中加入实施例1制备得到的可注射骨修复材料5g，再向混合溶液中加入实施例2制备得到的载药胶束0.1g，加入细胞培养液2ml，再加入无菌去离子水定容至10ml，充分混匀，制备得到可注射载药可修复材料10ml。
实施例4、载药骨修复材料在大鼠骨质疏松模型中对股骨骨髓腔骨再生效率测试+
实验动物及生物材料：3月龄sd级健康雌性大鼠，体重(240～270)g，购于苏州大学实验动物中心，饲养环境温度(22±2)℃，相对湿度50％±10％，室内照明以自然采光为主，通风良好，环境较安静；金黄色葡萄球菌(atcc25923)购买自广东环凯微生物科技有限公司。
对照品：对照品1按照实施例1的方法制备，未载药；对照品2按照cn101244275a实施例2记载的方法制备。
实验方法：
(1)造模：将40只大鼠分为5组，每组各8只，分别为sham组、阴性对照组、试验组(本发明实施例3制备得到的载药骨修复材料，万古霉素含量为0.2mg/ml)，阳性对照组1(注射对照品1，未载药)；阳性对照组2(注射对照品2，万古霉素含量为0.2mg/ml)；上述各组中，sham组未摘除卵巢仅去除卵巢处少量脂肪组织，阴性对照组、阳性对照组和各注射组进行摘除卵巢手术。在各组大鼠完成相应手术操作后，饲养至第24周后，测定各组大鼠股骨的骨密度，发现sham组股骨的平均骨密度为0.287±0.006g·cm-2，各手术组的股骨的平均骨密度为0.243±0.007g·cm-2，两组具有显著性差异(p<0.05),提示大鼠骨质疏松模型造模成功。
(2)材料注射：在无菌和麻醉条件下先向阴性对照组、试验组、阳性对照组大鼠股骨的骨腔注射含1×107cfu/100μl菌量的金黄色葡萄球菌悬液，sham组注射等量生理盐水，然后骨蜡封住注射针孔，缝合毛皮；继续饲养2天；采用γ射线对各注射组材料进行辐照灭菌，在无菌和麻醉条件下向试验组、阴性对照组、阳性对照组的大鼠两后腿骨腔分别注射相应的无菌样品1ml，sham组和阴性对照组注射等量生理盐水，然后骨蜡封住注射针孔，缝合毛皮。将试验组和sham组、阴性对照组、阳性对照组继续饲养8周，处死各组大鼠，取出完成股骨，测定各组大鼠股骨的骨密度，其具体情况见表1。
表18周后各组大鼠股骨骨密度变化
数据表达和统计学处理：
实验数据表示为平均数(mean)±标准差(s.d.)。采用excel软件t检验进行统计比较，“**”表示发现阴性对照组与sham组相比，骨密度明显下降(**p<0.01)，具有统计学意义，提示在无相关干预下，骨密度一直下降；“##”表示试验组与阴性对照组相比，骨密度均有明显上升，且试验组相比于阳性对照组2，大鼠的股骨的骨密度的上升的更为显著(##p<0.01vs#p<0.05)；阳性对照组1与阴性对照组相比无明显变化。
实验结果：
在实验期间，阴性对照组和阳性对照组1中，大鼠各死亡1只，其他大鼠出现一般精神状态差，易激惹，后腿活动不便的状况；阳性对照组2大鼠一般精神状况较差，易激惹，后腿活动不便的状况；其他组大鼠未见明显异常。
另外，根据统计学结果显示，在骨腔内存在感染的情况下，本发明制备得到的载药骨修复材料相比于未载药的骨修复材料(对照品1)，对大鼠的成骨恢复起到重要作用，能够明显提高骨密度，同时避免因局部感染激发的全身感染；与目前现有技术中的的载药多孔微球相比(对照品2)，对大鼠股骨密度的提高更加明显，同时因释药稳定，更以利于后期大鼠股骨中成骨性细胞迁移、粘附、增殖分化，加快股骨的修复。