一种人工复合神经导管及制备方法与流程

本发明属于神经导管及复合生物3d打印技术领域，具体涉及一种人工复合神经导管及其制备方法。

背景技术：

随着工业生产机械化程度的提高和交通事业的发展，周围神经损伤的发生率呈大幅度上升趋势。在我国这类神经损伤每年约发生200万例。

现在通常采用显微外科技术对周围神经短距离缺损的离断伤进行端对端的外膜缝合，以恢复神经的作用。这种自体神经移植或其他神经替代物可以解决神经缺损的问题。

但是，这些修复方法都有一定的缺陷，比如神经束的错对、神经断端的卷曲、逃逸及吻合口的结缔组织增生等。自体神经移植必然伴有供区的功能受损，而且可供移植的神经来源有限。

因此，寻找新的修复方法以促进周围神经再生是显微外科医疗中亟待解决的难题。迄今大量文献报道神经导管用于小节段神经缺损修复已取得一定的成功，但神经导管对于较长节段神经缺损的效果较差。尽管已有大量关于神经导管材料学的研究，但尚无一种材料的性能与自体神经移植相当或接近。

此外，大量研究提示，神经导管的设计理念很重要，包括生物相容性、好的柔韧性、机械支撑强度、合适的降解速率、高分子合成导管产生中性降解产物、管壁厚度、管壁孔隙率和孔径大小、管腔内壁微观结构的处理等，以及类似于细胞间物质的形貌特征。单纯神经导管很难修复长节段神经缺损，仅靠物理学引导神经再生远远不够，必须引入神经营养因子甚至干细胞至导管腔内，形成复合的神经导管，既提供神经再生的桥梁管道，又创造很好的神经再生微环境，发挥神经营养因子的趋化作用。

因此，亟需制造出更符合人体生理和生物学的神经导管，改善神经损伤修复效果，从而替代自体神经移植，广泛用于临床周围神经损伤的修复。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种人工神经导管，其符合人体生理和生物学要求，神经损伤修复效果与自体神经移植接近，用于替代自体神经移植。

为达到上述目的，本发明提供了一种人工复合神经导管，其包含：可降解高聚物中空导管，及填充在该中空导管中的ehs(engelbreth-holm-swarmsarcoma，ehs骨肉瘤)水凝胶。

ehs水凝胶是从小鼠ehs组织中提取、纯化得到的可溶性的基底膜基质。其主要成份是层粘连蛋白、iv型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，它还含有转化生长因子、纤维母细胞生长因子、组织纤溶酶原激活物和其他的一些生长因子；ehs水凝胶在4℃左右时为粘稠液体，37℃时水凝胶固化；ehs水凝胶的作用与哺乳动物细胞基底膜类似，对于贴壁细胞特别是一些难养的原代细胞，如人胚胎干细胞、神经细胞、肝细胞、黑色素瘤细胞、血管内皮细胞、毛囊上皮细胞等细胞培养，具有促进细胞粘附生长和分化的作用。

较佳地，所述的可降解高聚物中空导管选择gelma(甲基丙烯酸酯化明胶)导管。

gelma由甲基丙烯酸酐(ma)与明胶(gelatin)制备获得，是一种光敏性的生物水凝胶材料。该材料具有优异的生物相容性，且可由紫外光或可见光激发固化反应，形成适于细胞生长与分化且有一定强度的三维结构。

gelma成型后作为导管，里面填充的ehs水凝胶作为细胞基质，共同引导损伤神经的修复，随着植入时间推移，gelma及ehs水凝胶被降解、吸收。

较佳地，所述的gelma导管由3～10％的gelma、0.3～0.7％的过硫酸铵及0.05～0.2％的四甲基乙二胺，余量为水均匀混合，再填充至神经导管模具中，固化成型制得，以上百分数均以质量分数计。

较佳地，所述的神经导管模具通过3d打印制备。

本发明还提供了上述的ehs水凝胶的用途，该ehs水凝胶用于神经导管，引导损伤神经的修复，特别地，ehs水凝胶可以促进神经突触的生长。

本发明还提供了一种人工复合神经导管的制备方法，该方法包括如下步骤：

步骤1，配制神经导管溶液：将3～10％的gelma、0.3～0.7％的过硫酸铵及0.05～0.2％的四甲基乙二胺，余量为水均匀混合，以上百分数均以质量分数计；

步骤2，将神经导管溶液充满神经导管模具的管状空腔，在-20～-25℃条件下，静置12～24h成型，制备得到中空的神经导管；

步骤3，将成型后的神经导管冻干后，进行灭菌处理；

步骤4，填充ehs水凝胶：在神经导管的空腔中填充ehs水凝胶，冻干保存。

较佳地，步骤2中，所述的神经导管模具的制备方法为：根据软件绘制神经导管的模型，3d打印制备具有管状空腔的神经导管模具。

较佳地，步骤2中，制备的神经导管的长度为0.2～3cm，内径为0.3～1cm，外径为0.4～1.1cm。

较佳地，步骤3中，神经导管冻干条件为：温度-50～-70℃，时间10～24h。

较佳地，步骤3中，采用环氧乙烷进行灭菌处理，环氧乙烷灭菌处理时，环氧乙烷浓度为800～1000mg/l，灭菌温度为55～60℃，灭菌时间为6h。

较佳地，步骤5中，填充ehs水凝胶后放入25～37℃培养箱中静置2～10min以上。

本发明制备方法简单，步骤易于操作，用3d打印的模具制作出来的神经导管高度符合损伤神经的个性化修复要求；用ehs水凝胶进行填充后，获得的神经导管能促进神经细胞的迁移以缩短损伤神经的修复，手术效果与自体反转移植接近，具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1为本发明的人工复合神经导管的结构示意图。

图2为未填充ehs水凝胶的导管、本发明的人工复合神经导管与原位自体神经反转移植物关于复合肌肉动作电位的测试结果柱状图。

图3为未填充ehs水凝胶的导管、本发明的人工复合神经导管与原位自体神经反转移植物关于神经传导速度的测试结果柱状图。

具体实施方式

下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。

如图1所示，为本发明提供的一种人工复合神经导管，其包含：gelma导管10，及填充在gelma导管中的ehs水凝胶20。

所述的ehs水凝胶为本公司(江阴司特易生物技术有限公司)产品，货号为se-ehs-0100。所述的ehs水凝胶可以来自于人源或鼠源，同源使用，如来自人源的ehs用于人的神经修复，来自鼠源的ehs用于鼠神经修复等。

本发明提供的一种人工复合神经导管的制备方法，包括如下步骤：

步骤1，配制神经导管溶液：将3～10％的gelma(主要材料，经化学固化可以成型)、0.3～0.7％的过硫酸铵(用于化学固化的引发)及0.05～0.2％的四甲基乙二胺(用于化学固化的引发)，余量为水均匀混合，以上百分数均以质量分数计；

步骤2，将神经导管溶液充满至神经导管模具的管状空腔中，在-20～-25℃条件下，静置12～24h成型，制备得到中空的神经导管，如图1所示，10为gelma导管，其长度为0.2～3cm，内径为0.3～1cm，外径为0.4～1.1cm；

步骤3，将成型后的神经导管冻干后，进行灭菌处理；冻干条件为：温度-50～-70℃，时间10～24h；灭菌处理采用环氧乙烷，浓度为800～1000mg/l，灭菌温度为55～60℃，灭菌时间为6h；

步骤4，填充ehs水凝胶：在神经导管的空腔中填充ehs水凝胶，如图1所示，20为ehs水凝胶，填充ehs水凝胶后放入25～37℃培养箱中静置2～10min(使得ehs水凝胶凝固)，并且进行冻干处理，得到本发明的人工复合神经导管。

手术前，将填充ehs水凝胶的神经导管复水后，再施行神经导管移植术。

所述的神经导管模具可以采用传统方法制备，或，根据软件绘制神经导管的模型，3d打印制备具有管状空腔的神经导管模具。

本发明的人工复合神经导管的gelma导管10也可以直接3d打印成型，或采用传统方法制备。

本发明中的3d打印机外购于上海联泰三维科技有限公司；ehs水凝胶为本公司(江阴司特易生物技术有限公司)产品，货号为se-ehs-0100，gelma为本公司(江阴司特易生物技术有限公司)产品，货号为se-3dp-0200。

实施例1

1.神经导管模具的制备：根据solidworks软件绘制神经导管的模型，以光敏树脂为原料在3d打印机上打印神经导管的具有管状空腔的模具。

2.配制神经导管溶液：将质量分数为3.5％的gelma、质量分数为0.3％的过硫酸铵，质量分数为0.05％的四甲基乙二胺，余量为水均匀混合；

3.将神经导管溶液加入至神经导管模具的管状空腔内，在-20℃条件下静置24h，成型制备得到神经导管；

4.将成型后的神经导管在-50℃，冻干10h，再进行环氧乙烷灭菌，浓度为800mg/l，灭菌温度为55℃，灭菌时间为6h；

5.ehs水凝胶的填充：在神经导管的空腔中填充ehs水凝胶，在温度为25℃静置10min，即可直接使用或冻干保存。冻干保存的产品在手术前，经复水后，再施行神经导管移植术。所述的复水是指将其置于常规无血清细胞培养基里，使其恢复到凝胶状态。

实施例2

1.神经导管模具的制备：根据软件绘制神经导管的模型，以光敏树脂为原料在3d打印机上打印神经导管的具有管状空腔的模具；

2.配制神经导管溶液：将质量分数为9.5％的gelma、质量分数为0.7％的过硫酸铵、质量分数为0.2％的四甲基乙二胺，余量为水均匀混合；

3.将神经导管溶液加入至神经导管模具的管状空腔中，在-25℃条件下，静置12h成型制备得到神经导管；

4.将成型后的神经导管在-70℃，冻干24h，再进行环氧乙烷灭菌，浓度为1000mg/l，灭菌温度为60℃，灭菌时间为6h；

5.水凝胶的填充：在神经导管的空腔中填充ehs水凝胶，在温度为37℃静置2min，冻干保存。手术前，复水后，再施行神经导管移植术。

实施例3

1.神经导管模具的制备：根据软件绘制神经导管的模型，以光敏树脂为原料在3d打印机上打印神经导管的具有管状空腔的模具；

2.配制神经导管溶液：将质量分数为5.5％的gelma、质量分数为0.5％的过硫酸铵、质量分数为0.1％的四甲基乙二胺，余量为水均匀混合；

3.将神经导管溶液加入至神经导管模具的管状空腔中，在-25℃条件下，静置12h成型制备得到神经导管；

4.将成型后的神经导管在-60℃，冻干18h，再进行环氧乙烷灭菌，浓度为900mg/l，灭菌温度为58℃，灭菌时间为6h；

5.水凝胶的填充：在神经导管的空腔中填充ehs水凝胶，在温度为37℃静置5min，冻干保存。手术前，复水后，再施行神经导管移植术。

采用实施例3制备得到的人工神经导管进行检测，首先建立大鼠的坐骨神经缺损模型：

各组动物均采用右侧坐骨神经作为修复模型，左侧作为假手术对照。将动物头朝上背部面对实验人员，实验人员的右侧即为右侧。动物只数：开始：116只，结束：104只。

(1)麻醉及消毒：大鼠用1％戊巴比妥钠注射麻醉后，剃去臀部及大腿鼠毛，酒精消毒皮肤；

(2)切口处理：大鼠臀部至大腿纵向切口2cm，暴露股二头肌，沿肌肉间隙分离，显露出坐骨神经后，于梨状肌下孔5mm处切除坐骨神经，暴露坐骨神经后切除9mm，因神经回缩造成实际缺损10mm长的缺口；

(3)缝合：在手术显微镜下分别取上述未填充ehs水凝胶的导管、本发明的人工复合神经导管或原位自体神经反转移植物，两端与神经两断端的外膜分别用11/0显微缝合线端端吻合缝合4针，两端神经分别伸入导管内1mm，缝合肌肉及皮肤。

(4)术后处理：术后连续三天肌注青霉素2万单位，定期观察动物的饮食、精神、反应等一般情况。

(5)术后检测：移植后四周开始每两周持续进行电生理检测，分别对1～3组不同移植方式的大鼠的复合肌肉动作电位和神经传导速度进行了测试对比。其中，1组是指仅仅采用导管(未填充ehs水凝胶)，2组是指采用实施例3制备的人工复合神经导管(填充ehs水凝胶)，3组为原位自体反转移植。神经连接刺激电极，腓肠肌连接记录电极，神经近心端肌肉连接参考电极，跟腱连接参考电极，尾巴接地线进行检测。神经近心端肌肉连接的参考电极，用于评估该检测系统是否正常，如果不正常会显示在仪器上。测试数据是由腓肠肌上的记录电极记录的。

本实验的整体目标是2组向3组无限接近；2组优于1组，或者比1组的生长修复速度更快。

如图2所示，复合肌肉动作电位(mv)指大鼠腓肠肌的反应幅度，越强烈越好。14周与16周检测数据表明：1组与2组之间有显著差异，2组与3组之间无显著差异。表明本发明所述复合神经导管在第14及16周时，与原位自体反转移植效果无差异，且优于单纯空管修复效果。

如图3所示，神经传导速度测试结果：第6周三组之间均有显著性差异；第14周时1、3组之间有显著性差异，2、3组之间无显著性差异。表明本发明所述复合神经导管在第14周时，与原位自体反转移植效果无差异，且优于单纯空管修复效果。

综上所述，本发明提供的人工复合神经导管的制备方法，通过向导管模具的空腔中填充gelma制成中空的生物材料导管，再填充ehs水凝胶，制备人工复合神经导管。该方法操作简便，用3d打印的模具制作出来的神经导管一致性很好，用ehs水凝胶进行填充后，由于ehs水凝胶可以促进神经突触的生长，本发明提供的人工复合神经导管能促进神经细胞的迁移并缩短损伤神经的修复时间，手术效果与自体反转移植相当，优于空管(gelma导管)。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。