一种聚乳酸和壳聚糖复合神经导管及其制备方法
【专利摘要】本发明属于医用生物材料【技术领域】，具体涉及一种聚乳酸和壳聚糖复合神经导管，该复合神经导管是由取向聚乳酸电纺纤维和包裹在纤维外部的壳聚糖层组成的。本发明还提供了上述聚乳酸/壳聚糖复合神经导管的制备方法，以及该神经导管在制备周围神经缺损修复材料中的应用。本发明所制备的聚乳酸和壳聚糖复合神经导管具有优异的生物力学性能和极佳的亲水性，同时生物组织相容性良好、能显著促进雪旺细胞的贴附、迁移和增殖，易于剪裁和保存且临床使用操作简单，在周围神经的损伤修复领域具有良好的临床应用前景。
【专利说明】一种聚乳酸和壳聚糖复合神经导管及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医用生物材料【技术领域】，具体涉及到一种聚乳酸/壳聚糖复合神经导管及其制备方法与应用，该导管材料具有良好的生物力学强度、亲水性和促雪旺细胞增殖作用，可用作周围神经缺损的再生修复。
【背景技术】
[0002]周围神经损伤是临床常见的四肢严重创伤，平时、战时均较多见。据《科学时报》报道，在全球每年新增创伤病例中，周围神经损伤病例约占1.5%~4.0%。我国周围神经损伤病例每年新增60万~90万例，其中需要通过神经移植来修复神经的病例约为30万~45万例。周围神经缺损的修复，尤其是长距离缺损的修复，一直是临床上较为棘手的难题。目前最常用的方法是利用自体次要神经移植来桥接修复损伤的主要神经断端，促进受损的神经再生，从而达到一定程度的功能恢复，自体神经移植目前仍然是周围神经外科领域神经修复的金标准。然而自体神经移植的修复方法存在一定的缺点，诸如:需要手术切取移植的神经，神经来源有限，牺牲了次要神经的功能，供区神经瘤、疤痕的形成及感染的风险等，这些缺点限制了其临床应用。同种异体神经和异种异体神经移植由于存在一定的免疫反应和传染疾病的风险，而免疫抑制剂的应用会造成机体免疫力低下，导致患者继发肿瘤和感染性疾病的发生，临床应用有一定的困难。
[0003]近年来， 随着生物医用材料和组织工程学的迅速发展，人们将研究的重点转向使用神经导管来促进周围神经再生以代替自体神经移植。从神经导管的结构角度来说，理想的神经导管应该要有多孔且连通性好的管壁，内表面要有与天然细胞外基质相似的微结构，同时要有良好的柔韧性和抗塌缩能力。传统的神经导管制备工艺如溶剂浇铸法可以比较简便的制备具有一定厚度的管材，并且在与冷冻干燥等手段结合后可以控制管壁的孔隙率和连通性；但缺点在于不具有与周围神经的天然细胞外基质相类似的微结构。静电纺丝技术是近年来发展起来的一种制备聚合物纳米纤维的纺丝工艺，其最大的特点是所得到的支架材料具有孔隙率高、纤维直径小、比表面积大、均一性好等优点，更重要的是，所制得的纳米纤维能够从微观尺度上模仿天然细胞外基质，这使得静电纺丝在神经导管制备方面有着得天独厚的优势。已有研究证实，与溶剂浇铸法得到的膜材料相比，电纺丝制备的纤维材料能更好的促进雪旺细胞贴附和增殖。同时，通过特定收集装置可以很容易地得到取向排列的电纺丝纤维，这种各向异性的物理信号已被证实可以有效的引导和促进轴突再生。
[0004]由于具有良好的可加工性和生物可降解性，聚酯类高分子(包括聚己内酯、聚乳酸、聚羟基乙醇酸等)成为一类得到广泛应用的人工合成高分子材料。Yoo等通过电纺丝技术制备了聚己内酯(PCL)和I型胶原混纺的复合神经导管，对大鼠的腓侧神经缺损进行了修复，术后8周发现轴突的连续性和肌肉功能得到了重建(Yoo et.al.，End-to-sideneurorrhaphy using an electrospun PCL/collagen nerve conduit for complexperipheral motor nerve regeneration, Biomaterials, 2012，33，9027-9036)。但由于电纺丝纤维膜的高孔隙率和比表面积，使得纤维膜质地较为柔软，通过卷制或直接收集得到的神经导管的力学强度较低，几乎不耐外界抗压载荷，在植入体内后极易发生塌缩现象，从而导致轴突外延生长困难。Ramakrishna等所制备的纯聚乳酸(PLA)神经导管在植入大鼠坐骨神经缺损处后，发现有50%的导管发生了塌缩，从而严重影响了缺损神经的再生修复(Ramakrishna et.al., In vivo study of novel nanofibrous intra-luminal guidancechannels to promote nerve regeneration, J.Neural Eng.，2010，7，046003)。此外，聚酯类高分子纤维膜的亲水性较差，有文献报道最高可达138.2°，导致其细胞亲和性差，细胞很难在其表面贴附和增殖，不利于对轴突损伤的再生修复。
[0005]因此，临床上长期亟盼一种制备过程简单、抗塌缩和亲水性能好、促雪旺细胞增殖能力强、微观结构与天然细胞外基质类似、且方便、安全、有效的周围神经修补材料的出现。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是克服现有神经导管的不足，为临床提供一种具有良好的抗塌缩能力和亲水性、可在微观尺度上模拟天然细胞外基质结构、可显著促进雪旺细胞的贴附和增殖、易于剪裁和保存且临床使用操作简单的聚乳酸/壳聚糖复合神经导管。本发明的另一目的是提供所述的聚乳酸/壳聚糖复合神经导管的制备方法与应用。
[0007]壳聚糖是一种天然多糖类物质，具有无毒、组织相容性好、生物可降解等优点，还可明显抑制疤痕组织的形成，在临床已得到广泛应用。壳聚糖分子链中含有大量的羟基和氨基等亲水性基团，可赋予材料良好的润湿性，有利于细胞在其表面粘附。此外研究表明，壳聚糖的体内降解产物壳寡糖具有明显的促进雪旺细胞增殖的作用。
[0008]本发明尝试将聚乳酸和壳聚糖这两种材料通过特定的方式结合制备复合材料，使之具备两者的优点，从而为临床提供一种性能优异的神经导管，以更好地用作周围神经损伤的再生修复。
[0009]本发明的第一方面，是提供了一种聚乳酸和壳聚糖复合神经导管，该神经导管是由聚乳酸纤维和壳聚糖组成的，所述的聚乳酸纤维，选用分子量为5万到50万的聚乳酸，呈高度取向排列，直径为100-2000nm，纤维间孔径尺寸为100_5000nm ;
[0010]所述的壳聚糖，包裹在聚乳酸纤维的外部以及和聚乳酸纤维的纤维之间，其复合量在1-40%之间；
[0011]所述的聚乳酸纤维的高度取向排列，是指沿同一方向排列的纤维数量占纤维总数量的95%以上。
[0012]所述的壳聚糖的复合量，是指壳聚糖的重量占聚乳酸纤维和壳聚糖重量之和的百分比。
[0013]本发明的神经导管的壁厚在0.05-0.5mm之间，管径在0.5_5mm之间，孔隙率在50-90% 之间。
[0014]较佳的，本发明的聚乳酸/壳聚糖复合神经导管，聚乳酸纤维的直径在630 ± lOOnm，纤维间孔径尺寸为1000±100nm ；
[0015]较佳的，本发明的聚乳酸/壳聚糖复合神经导管，壳聚糖的复合量为20-30% ;最佳复合量为26.2%。
[0016]较佳的，本发明的聚乳酸/壳聚糖复合神经导管，神经导管的壁厚在0.2mm，管径为2mm,孔隙率为80%。[0017]较佳的，所述的聚乳酸纤维，选用左旋聚乳酸，重均分子量为10-40万，最佳为30万。
[0018]较佳的，所述的壳聚糖，数均分子量为10-100万，脱乙酰度大于70%，最佳为数均分子量为50万,脱乙酰度为90%以上。
[0019]本发明的第二方面，是提供上述的聚乳酸和壳聚糖复合神经导管的制备方法，该方法包括以下步骤:
[0020](A)配制聚乳酸的纺丝溶液:将聚乳酸加入溶剂中得到纺丝溶液，纺丝溶液中聚乳酸的浓度为1-30%(克/毫升)，其中溶剂可选用六氟异丙醇、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氯甲烷、丙酮、三氯甲烷、三氟乙酸中的一种或两种以上；
[0021](B)将步骤A制得的聚乳酸的纺丝溶液装入电纺丝液供给装置，通过流量泵调控电纺丝液的供给流量为0.l-20ml/h ；
[0022](C)将转速为2000-4000转/分、直径为2_20cm的滚筒与接地端相连，作为电纺丝过程的收集基板；
[0023](D)通过高压发生器给电纺丝过程提供高压，在0.l-40kv之间调控调节，高压发生端同收集基板之间的距离设定为3cm-30cm ；
[0024](E)在滚筒上收集获得厚度为0.05-0.5毫米的聚乳酸纤维膜；
[0025]( F)将步骤E所得到的聚乳酸纤维膜浸入浓度为0.1-10%的壳聚糖稀醋酸溶液中，取出后自然干燥即得聚乳酸和壳聚糖复合纤维膜，其中壳聚糖复合量为1-40%;
[0026](G)将步骤F中所得到的聚乳酸和壳聚糖复合纤维膜沿垂直于聚乳酸纤维取向方向卷曲成直径为0.5-5mm的聚乳酸和壳聚糖复合神经导管，并利用1_10%的壳聚糖稀醋酸溶液对结合处进行粘结。
[0027]上述方法制得的聚乳酸和壳聚糖复合神经导管，先在室温下放置一晚，并继续放入37-100度下的真空烘箱中放置12小时以上以除去残余溶剂。
[0028]上述方法制得的聚乳酸和壳聚糖复合神经导管，临床使用前，可裁剪成手术所需的长度，在75%酒精中浸泡一晚后备用。
[0029]所述的电纺丝液供给装置，可以为市售的浙江史密斯医学仪器有限公司的WZ-50C66T和WZ-50C6⑴型微量注射泵，以及保定兰格恒流泵有限公司LSP01-1A和LSPO1-2A型微量注射泵等。
[0030]上述方法中，优选的实施方式是:
[0031]步骤(A)中，选用六氟异丙醇作为溶剂，溶液浓度是8% (克/毫升)；
[0032]步骤(B)中，供给流量为5ml/h ；
[0033]步骤(C)中，所使用的滚筒转速为3000转/分，直径为8厘米；
[0034]步骤(D)中，电压设定为15kv，距离设定为15cm ；
[0035]步骤(E)中，在旋转滚筒上的收集时间为4小时，纤维膜厚度为0.2mm ；
[0036]步骤(F)中，壳聚糖稀醋酸溶液的浓度为0.6%，壳聚糖复合量为26.2% ；
[0037]步骤(G)中，聚乳酸/壳聚糖复合神经导管的直径为2_，壳聚糖稀醋酸溶液的浓度为1.5%。
[0038]本发明的第三方面，是提供上述的聚乳酸和壳聚糖复合神经导管在制备周围神经缺损修复材料中的应用。[0039]本发明所得到的聚乳酸/壳聚糖复合神经导管用作周围神经缺损修补材料，具有以下有益效果:
[0040]1、具有较高的拉伸强度，在外科手术中进行缝合时不撕裂、不脱边；在手术后可承受一定的体内抗压载荷，抗塌缩能力优异，能保持轴突再生通道时钟贯通。
[0041]2、具有良好的亲水性，神经再生所需要的雪旺细胞等可在导管表面进行良好的贴附和增殖。
[0042]3、复合神经导管中的壳聚糖组分的降解产物壳寡糖具有明显的促进雪旺细胞增殖的功能；同时壳聚糖可有效抑制成纤维细胞的粘附，避免手术部位疤痕组织的形成。
[0043]4、具有与天然细胞外基质类似的微结构，有利于雪旺细胞的迁移和增殖，对轴突再生具有促进作用。
[0044]5、具有良好的生物相容性，植入体内后不引发炎症反应；同时不含活细胞成分，不使用外源性蛋白，避免了由此而带来的免疫排斥反应和感染疾病的风险。
[0045]6、能很好地修补周围神经缺损，促进轴突再生。
[0046]7、材料来源丰富、成分较低，同时制备工艺和产品组成简单，产品质量易于控制，能实现高效率低成本的产业化生产。 [0047]因此本发明所介绍的聚乳酸/壳聚糖复合神经导管是一种新型医用生物材料，在周围神经缺损的再生修复等领域具有良好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0048]图1是聚乳酸/壳聚糖复合神经导管的数码照片；
[0049]图2是纯聚乳酸和聚乳酸/壳聚糖复合神经导管表面和断面的扫描电镜照片，其中a是纯聚乳酸纳米纤维；b，c，d分别是浸溃在0.2%, 0.4%和0.6%壳聚糖溶液中所得到的聚乳酸/壳聚糖复合神经导管表面和断面的扫描电镜照片(图中标尺为5 μ m)；
[0050]图3是不同壳聚糖复合量的聚乳酸/壳聚糖复合神经导管的拉伸应力-应变曲线.[0051]图4是不同壳聚糖复合量的聚乳酸/壳聚糖复合神经导管的抗压应力-应变曲线.[0052]图5是不同壳聚糖复合量的聚乳酸/壳聚糖复合神经导管的水接触角与时间的关系曲线，其中a是水滴在纯聚乳酸和复合神经导管表面的形态随时间变化的光学照片，b是纯聚乳酸和复合神经导管的水接触角随时间变化的关系曲线；
[0053]图6是雪旺细胞在不同壳聚糖复合量的聚乳酸/壳聚糖复合神经导管培养1、3和7天后的增殖实验结果。
【具体实施方式】
[0054]现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
[0055]下述实施例如无特殊说明所用方法均为常规方法。
[0056]实施例中用到的聚乳酸，为左旋聚乳酸，重均分子量为30万，购自济南岱罡生物工程有限公司。
[0057]实施例中用到的壳聚糖，数均分子量为50万，脱乙酰度90%，购自上海其胜生物制剂有限公司。
[0058]实施例1:聚乳酸/壳聚糖复合神经导管的制备
[0059](I)将0.8克聚乳酸溶解于10毫升六氟异丙醇中，在室温下搅拌一晚形成均一稳定的溶液。
[0060]( 2 )将聚乳酸溶液放入注射器中，注射器针头处连接高压电源。溶液供给流量通过微流泵控制在5ml/h，施加的电压为15kv，高压端同接地端的距离为15cm，所使用滚筒的直径为8cm,旋转速度为3000rpm。通过此过程,可收集到直径为630nm左右、厚度在0.2mm左右的聚乳酸纳米纤维膜。
[0061](3)将聚乳酸纳米纤维膜分别浸入浓度为0.2%, 0.4%和0.6%的壳聚糖稀醋酸溶液(壳聚糖数均分子量为50万，脱乙酰度90%，溶液中醋酸含量为1%)中，取出后自然干燥可得到聚乳酸/壳聚糖复合纤维膜，其中壳聚糖复合量分别为5.4%, 12.5%和26.2%左右(代号分别为 PLLA/CS-1, PLLA/CS-2, PLLA/CS-3)。
[0062](4)将得到的聚乳酸/壳聚糖复合膜沿垂直于纤维取向方向卷曲成直径为2mm的神经导管，并利用1.5%的壳聚糖稀醋酸溶液对结合处进行粘结。
[0063]上述方法制得的聚乳酸/壳聚糖复合神经导管，先在室温下放置一晚，并继续放入37度下的真空烘箱中放置12小时以上以除去残余溶剂。最终得到的聚乳酸/壳聚糖复合神经导管外观形貌如图1所示。
[0064]实施例 2:聚乳酸/壳聚糖复合神经导管的微观形貌观察
[0065]采用场发射扫描电镜(JSM-6700F，JEOL, Japan)对不同壳聚糖复合量的聚乳酸/壳聚糖复合神经导管的表面和断面形貌进行分析，加速电压为10kV。
[0066]结果如图2所示，可以看到，纯聚乳酸(图2a)及聚乳酸/壳聚糖复合纤维(图2b, c, d)均为高度取向排列；纯聚乳酸纤维表面未见壳聚糖包裹，孔径尺寸大，孔隙率高；随着壳聚糖复合量的增加，可以明显观察到壳聚糖包裹在聚乳酸纤维表面和纤维之间的空隙内，孔隙率逐渐下降。从断面形貌可以看出，纯聚乳酸纤维呈单根有序排列，而聚乳酸/壳聚糖复合纤维则呈现出纤维束形貌，壳聚糖将几根聚乳酸纤维包裹成束，且随着壳聚糖复合量增加，纤维束逐渐变粗(d)。
[0067]实施例3:聚乳酸/壳聚糖复合神经导管的生物力学性能研究
[0068]将聚乳酸/壳聚糖复合纤维膜裁成长和宽为40X4mm的样品，并将样品两条边修剪平整，防止出现裂纹，然后采用螺旋测微仪测量每个样品的厚度，选取不同部位测量三次取平均值。然后通过万能力学测试机进行拉伸力学性能测定，十字头的上升速度为2_/min。将聚乳酸/壳聚糖复合神经导管水平放置在试验台上，通过万能力学测试机进行抗压力学性能测定，十字头的下降速度为0.5mm/min。
[0069]结果显示，聚乳酸/壳聚糖复合纤维膜的拉伸力学强度明显高于纯聚乳酸纤维，且随着壳聚糖复合量的增大而逐渐提高。当壳聚糖复合量为26.2%时，复合纤维膜的拉伸强度为23MPa，比纯聚乳酸纤维的拉伸强度(IlMPa)提高了一倍以上(图3)。纯聚乳酸神经导管几乎不耐受外部抗压载荷，当变形量为50%时，外部抗压应力仍为O。随着壳聚糖复合量的增加，聚乳酸/壳聚糖复合神经导管的抗压能力增强。当复合量为26.2%时，复合导管在达到50%的变形量后，其外部抗压应力可提高至5牛顿，这表明复合神经导管的抗塌缩能力有很大提闻(图4)。[0070]实施例4:聚乳酸/壳聚糖复合神经导管的表面润湿性研究
[0071]将聚乳酸/壳聚糖复合纤维膜放置在平整的载玻片表面，采用滴液法，使用接触角测定仪测定表面静态水接触角。
[0072]结果显示，纯聚乳酸纤维的水接触角为128度，且不随时间变化。而在复合壳聚糖后，复合纤维膜的水接触角随时间延长逐渐降低。当复合量为26.2%时，复合纤维膜的水接触角在2.5秒内迅速降为0，表现出优异的亲水性(图5)。
[0073]实施例5:聚乳酸/壳聚糖复合神经导管的体外生物相容性研究
[0074]将聚乳酸/壳聚糖复合纤维膜剪为直径Icm的圆片，用75%的酒精浸泡消毒15分钟，再用无菌PBS磷酸缓冲液冲洗材料并用细胞培养液预湿。随后将复合膜置于48孔培养板，将第二代大鼠雪旺细胞胞按照1.5X104cells/well的密度种植于复合膜上面。培养过程中每两天换一次细胞培养液。细胞在材料上培养1，3，7天后，采用MTT法测试材料表面细胞光密度。
[0075]结果显示，在培养3天后，含有5.4wt%和12.6wt%壳聚糖的聚乳酸/壳聚糖复合纤维膜表面的细胞数量与纯PLLA相当，而含有26.2wt%纳米线的聚乳酸/壳聚糖复合纤维膜表面的细胞数量明显高于纯PLLA材料(p〈0.05)。在相同培养条件下，随着培养时间的延长，复合材料上细胞增殖的数量都不断增加，培养7天后的细胞数量要明显高于培养3d的细胞数量。当培养7天后，含有26.2wt%的复合材料上的细胞数量也明显高于纯PLLA材料(p〈0.05)。此外，这些结果表明，与纯聚乳酸材料相比，复合了壳聚糖的聚乳酸/壳聚糖复合纤维膜更能促进雪旺细胞的贴附和增殖。 [0076]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
【权利要求】
1.一种聚乳酸和壳聚糖复合神经导管，其特征在于，该神经导管是由聚乳酸纤维和壳聚糖组成的，所述的聚乳酸纤维，选用分子量为5万到50万的聚乳酸，呈高度取向排列，直径为100-2000nm，纤维间孔径尺寸为100-5000nm ; 所述的壳聚糖，包裹在聚乳酸纤维的外部以及和聚乳酸纤维的纤维之间，其复合量在1-40%之间。
2.根据权利要求1所述的一种聚乳酸和壳聚糖复合神经导管，其特征在于，该神经导管的壁厚为0.05-0.5mm，管径为0.5_5mm，孔隙率为50_90%。
3.根据权利要求1所述的一种聚乳酸和壳聚糖复合神经导管，其特征在于，所述的聚乳酸纤维的直径在630± lOOnm，纤维间孔径尺寸为1000± lOOnm。
4.根据权利要求1所述的一种聚乳酸和壳聚糖复合神经导管，其特征在于，壳聚糖的复合量为20-30%。
5.根据权利要求1所述的一种聚乳酸和壳聚糖复合神经导管，其特征在于，该神经导管的壁厚在0.2mm,管径为2mm，孔隙率为80%。
6.根据权利要求1所述的一种聚乳酸和壳聚糖复合神经导管，其特征在于，所述的聚乳酸纤维，为左旋聚乳酸，重均分子量为10-40万。
7.根据权利要求1所述的一种聚乳酸和壳聚糖复合神经导管，其特征在于，所述的壳聚糖，数均分子量为10-100万，脱乙酰度大于70%。
8.—种如权利要求1所述的聚乳酸和壳聚糖复合神经导管的制备方法，该方法包括以下步骤: (A)配制聚乳酸的纺丝溶液:将聚乳酸加入溶剂中得到纺丝溶液，纺丝溶液中聚乳酸的浓度为1-30%克/毫升，其中溶剂可选用六氟异丙醇、N, N- 二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氯甲烷、丙酮、三氯甲烷、三氟乙酸中的一种或两种以上； (B)将步骤A制得的聚乳酸的纺丝溶液装入电纺丝液供给装置，通过流量泵调控电纺丝液的供给流量为0.l-20ml/h ； (C)将转速为2000-4000转/分、直径为2-20cm的滚筒与接地端相连，作为电纺丝过程的收集基板； (D)通过高压发生器给电纺丝过程提供高压，在0.l-40kv之间调控调节，高压发生端同收集基板之间的距离设定为3cm-30cm ； (E)在滚筒上收集获得厚度为0.05-0.5毫米的聚乳酸纤维膜； (F)将步骤E所得到的聚乳酸纤维膜浸入浓度为0.1-10%的壳聚糖稀醋酸溶液中，取出后自然干燥即得聚乳酸和壳聚糖复合纤维膜，其中壳聚糖复合量为1-40% ； (G)将步骤F中所得到的聚乳酸和壳聚糖复合纤维膜沿垂直于聚乳酸纤维取向方向卷曲成直径为0.5-5mm的聚乳酸和壳聚糖复合神经导管，并利用1_10%的壳聚糖稀醋酸溶液对结合处进行粘结。
9.根据如权利要求8所述的聚乳酸和壳聚糖复合神经导管的制备方法，其特征在于， 步骤(A)中，选用六氟异丙醇作为溶剂，溶液浓度是8%克/毫升； 步骤(B)中，供给流量为5ml/h ； 步骤(C)中，所使用的滚筒转速为3000转/分，直径为8厘米； 步骤(D)中，电压设定为15kv,距离设定为15cm ；步骤(E)中，在旋转滚筒上的收集时间为4小时，纤维膜厚度为`0.2mm ； 步骤(F)中，壳聚糖稀醋酸溶液的浓度为0.6%，壳聚糖复合量为`26.2% ； 步骤(G)中，聚乳酸/壳聚糖复合神经导管的直径为2_，壳聚糖稀醋酸溶液的浓度为`1.5%。
10.一种如权利要求1-7任一所述的聚乳酸和壳聚糖复合神经导管在制备周围神经缺损修复材料中的应用。`
【文档编号】D06M15/03GK103751839SQ201310693634
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月17日 优先权日:2013年12月17日
【发明者】侯春林, 窦源东, 林浩东, 魏长征 申请人:中国人民解放军第二军医大学