神经再生诱导管的制作方法

专利名称：神经再生诱导管的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于利用神经细胞的延长重新连接因事故、手术等被切断或切除的末梢神经的神经再生诱导管。更详细而言，本发明涉及利用用于固定被切断或被切除的神经组织的延长方向，且不妨碍周围组织地使切断部位彼此接合的，使用胶原蛋白作为神经再生基础的神经再生诱导管。
背景技术：
由于事故等的末梢神经的损伤不能被完全修复的例子有很多。另外，伴随一般的手术，不得不切除末梢神经的临床例子也很多。末梢神经的损伤除直接吻合以外，自己神经移植为唯一的对策。但是，其成绩并不让人满意，知觉，运动能力的恢复较差，还可见因错误引导的后遗症。另外，不仅疼痛、知觉欠损等后遗症，有很多患者还烦恼于患部的知觉异常， 尤其是疼痛。使用人工材料的接合管连接末梢神经的裂缝使神经再生的尝试从1980年代初开始逐渐盛行。但是，由非吸收性的合成人工材料的接合管道的研究全都以失败告终。为了解決该问题，必须考虑在神经束再生期间，防止来自外部的结缔组织的侵入，需要管道内外的物质交流或管道壁上毛细血管的新生，需要适于管道内的神经轴突、神经鞘细胞的增殖的基础的物质，再生后，使用材料可被分解吸收等条件。考虑这些条件后，开始进行了利用生物体内分解吸收性材料的人工神经接合管的研究。关于末梢神经的再生，从1982年硅树脂管模型的发表以来，开始进行了用硅树脂管延长再生可能的断端间距离的尝试。但是，由于硅树脂管壁不能透过营养成分，存在不能向神经轴突充分补给营养成分等问题点，且在硅树脂内不能生成毛细血管，即使使用硅树脂管也不能获得满意的神经再生。此外，假设可以神经再生，存在总归是异物的硅树脂管必须再通过手术等除去的问题点。与此相对，代替硅树脂管，开始尝试用包含生物分解性聚合物的管的末梢神经的再生。若使用含生物分解性聚合物的神经再生管，由于神经再生后可在生物体内通过加水分解或酶的作用逐渐将神经再生管分解，吸收，不需要再通过手术等的手段取出。作为这样的含生物分解性聚合物的神经再生管，例如，在专利文献1中公开了，含昆布氨酸和纤连蛋白被覆的胶原蛋白纤维束的神经再生袖助材料。在专利文献2中公开了一种人工神经管，其含有生物体分解吸收性材料的管，和在其内腔中具有沿该管的轴线几乎平行地贯通该管的空隙的胶原蛋白体，该空隙以含胶原蛋白，昆布氨酸等的基质凝胶进行充填。在专利文献3中公开了一种人工神经管，其含生物体分解吸收性材料的管，在其内腔中与该管的轴线几乎平行地插入被覆了昆布氨酸的胶原蛋白纤维束。在专利文献4中公开了，具有由生物体内吸收性材料构成的纤维束的结构的神经再建用基材。在专利文献5 中公开了含胶原蛋白的海绵体，管，线圈等的支持体。在专利文献6中公开了，由含生物体分解性材料或生物体吸收性材料海绵体状的微细基质，和直线状的生物体组织诱导路径或器官诱导路径构成的支持体。此外，在专利文献7中公开了，含由生物体分解性聚合物材料
3构成的海绵体，和由比该海绵体分解吸收期间更长的生物分解性聚合物构成的强化材，且其内面为含海绵体的神经再生管。 这些神经再生管都使用胶原蛋白作为神经再生的基础，但胶原蛋白的神经细胞附着性，细胞增殖性以及分化诱导能力并不充分。专利文献1 日本特开平5-237139号公报专利文献2 :W098/22155号公报专利文献3 :W099/63908号公报专利文献4 日本特开2000-325463号公报专利文献5 日本特开2001-70436号公报专利文献6 日本特开2002-320630号公报专利文献7 日本特开2003-19196号公报

发明内容
本发明为鉴于以往技术的现状而首创，其目的在于提供一种使用神经细胞附着性，细胞增殖性以及分化诱导能力优良的胶原蛋白作为神经再生的基础的神经再生诱导管。本发明者为了达成所述目的，对作为神经再生的基础使用的胶原蛋白的制造方法进行研究的结果，发现在从猪皮等的原料制造胶原蛋白时的洗涤、盐析时必然混入的氯化钠对神经细胞的再生产生不良影响，且通过使用使该氯化钠的含有浓度降低的胶原蛋白， 可提高神经细胞的增殖以及神经突起的延长，从而完成了本发明。S卩，本发明为一种神经再生诱导管，其特征在于，在使用胶原蛋白作为神经再生的基础的神经再生诱导管中，使用精制后氯化钠含有浓度在干燥状态下为2. 0重量％以下， 优选为0. 1 1. 5重量％的胶原蛋白。在本发明的神经再生诱导管的优选的形态中，胶原蛋白的精制以在pH6.0以上， 低于10.0的等电点沉淀进行，神经再生诱导管在含有生物分解性聚合物的管状体上被覆胶原蛋白，再在管状体的内部填充胶原蛋白而形成，生物分解性聚合物选自聚乙醇酸，聚乳酸，乳酸-己内酯共聚合物，管状体的内径为0. 1 20mm，外径为0. 15 25mm，长度为 1. 0 150mm。本发明通过使用将胶原蛋白的制造工序中必然混入的氯化钠的含有浓度降低至2 重量％以下的精制胶原蛋白，可提供一种神经细胞附着性，细胞增殖性以及分化诱导能力优良的神经再生诱导管。


图1是显示本发明实施例的胶原蛋白凝胶内的细胞情况的显微镜照片。图2是显示比较例的胶原蛋白凝胶内的细胞情况的显微镜照片。图3是实验1中测定的吸光度(相对值)的图。图4是实验2中测定的吸光度(相对值)的图。图5是实验3中使用的胶原蛋白涂层1 6的详细内容。图6是实验3中测定的吸光度(相对值)的图。
图7是实验3中测定的吸光度(相对值)的8是显示用实验4的胶原蛋白(pH5. 5)涂层板培养的细胞的细胞分化情况的显微镜照片。图9是显示用实验4的胶原蛋白(pH8. 5)涂层板培养的细胞的细胞分化情况的显微镜照片。图10是显示用实验4的胶原蛋白(ρΗΙΟ. 2)涂层板培养的细胞的细胞分化情况的显微镜照片。图11是实验4中测定的4天培养后的细胞分化率的图。图12是实验4中测定的11天培养后的细胞分化率的图。
具体实施例方式本发明的神经再生诱导管特征在于，使用精制后胶原蛋白的制造工序中混入的氯化钠含有浓度在干燥状态下为2重量％以下的胶原蛋白作为神经再生的基础。胶原蛋白因为起着各种细胞的基质的作用，在作为医用材料应用于生物体时，与组织的亲和性良好，作为神经细胞的生长基础从以往一直被使用。作为神经再生的基础使用的以往的胶原蛋白，一般而言，以在食肉检查场中收集冷冻的猪皮作为出发原料，向其中添加中性蛋白酶进行加温处理，以氯化钠溶液反复洗涤， 脱水后，再用异丙醇，丙酮洗涤，减压干燥脱脂后做成薄片，将该脱脂后薄片添加至醋酸溶液中，用盐酸调整PH，添加胃蛋白酶进行分解，用氢氧化钠溶液调整至高pH(病毒去活性化工序1)，再用盐酸调整至低PH (病毒去活性化工序2、，用氢氧化钠调整至pH2 3后过滤， 加入氯化钠溶液进行盐析，通过离心分离浓缩，将该浓缩物添加入精制水中进行溶解，再加入氯化钠溶液进行盐析，以离心分离浓缩，通过冷冻干燥进行制造。这样，以往使用的胶原蛋白，在其制造工序中由于含有通过氯化钠溶液的洗涤、通过氯化钠溶液的盐析，因此包括市售品在内，使用的胶原蛋白的氯化钠浓度为4重量％以上。本发明者认为胶原蛋白中的氯化钠含有浓度影响神经细胞的生存·发育，若其浓度过高，由于渗透压细胞膜被破坏。因此，在神经再生诱导管中使用精制后减低了氯化钠含有浓度的胶原蛋白时，发现相对于使用以往的胶原蛋白的产品，该神经再生诱导管发挥了非常优良的细胞附着性，细胞增殖性。本发明基于所述见解，使用处理后干燥状态的氯化钠含有浓度减低至2. 0重量％以下，优选为0. 1 1. 5重量％的胶原蛋白作为神经再生诱导管的基础。该氯化钠浓度通过原子吸收分光光度法(灰化)进行测定。为了防止由于渗透压的降低导致的细胞膜破裂，虽然氯化钠浓度越低越好，但从技术方面、胶原蛋白的稳定性方面出发，0. 1重量％左右应当为下限。作为用于降低盐浓度的处理，除了后述的等电点沉淀 (浓缩)之外，还有通过透析的方法等，在本发明中还可利用公知的任何方法。需要说明的是，通过原子吸收分光光度法的氯化钠浓度的测定如下所示，用石英杯取样品1 4g，在电热器上缓慢升高温度使之碳化后，最终用马弗炉进行6 8小时灰化(500°C )。残渣以10重量％盐酸水溶液再溶解后，稀释成最终浓度1重量％，用根据乙炔-空气的火焰原子吸收分光光度法进行测定。此时的测定波长为589. 6nm。本发明的神经再生诱导管中使用的胶原蛋白可用以往公知的任何方法制造，例如可将上述的医疗用市售的以往的胶原蛋白作为出发原料，在2 10°C冷却下，将该胶原蛋
5白溶解在注射用蒸馏水中，用氢氧化钠溶液调整pH至6. 0以上，低于10. 0进行等电点沉淀，进行离心分离，舍弃上清液，将沉淀物冷冻干燥进行制造。通过使用这样的等电点范围的胶原蛋白，发现发挥了非常优良的细胞分化诱导能力，从而完成本发明。虽然通过使用具有PH6.0以上，低于10.0的等电点的胶原蛋白作为神经再生的基础，提高细胞的分化诱导能力的理由还未详细地被解明，但可认为低于pH6. 0以及10. 0以上沉淀的部分中含有与细胞的亲和性低的因子，相反PH6. 0以上，低于10. 0下沉淀的胶原蛋白尤其与细胞的亲和性较高。或者，未精制的胶原蛋白为I型胶原蛋白和III型胶原蛋白以大约7 3的比例构成， 还可认为是通过变化该I型和III型的构成比例而产生的影响。在本发明中，更优选的等电点范围为pH7. 0以上9. 5以下，尤其优选为pHg. 0以上9. 0以下。本发明的神经再生诱导管可依照以往公知的方法进行制造，例如，可通过在含生物分解性聚合物的管状体上被覆胶原蛋白，再在其管状体的内部填充胶原蛋白而形成。 管状体大小随再生的神经部位、所需要的强度而不同，但一般内径为0. 1 20mm，外径为 0. 15 25mm，长度为1. 0 150mm。实际上，考虑到受时间的制约和生产成本，优选预先准备好含多个种类的大小的管状体的神经再生诱导管。作为构成管状体的生物分解性聚合物，可举出聚乙醇酸，聚乳酸，乳酸-己内酯聚合物，乙醇酸-己内酯共聚合物，聚二恶烷，乙醇酸-三亚甲基羧酸等。从得到的容易性以及操作性能方面出发，优选使用聚乙醇酸，聚乳酸，乳酸-己内酯共聚合物，尤其优选使用聚乙醇酸。生物分解性聚合物可单独一种使用，也可2种以上混合使用。作为管状体，可使用将所述生物分解性聚合物成型为多孔质化的管状体，还可使用将所述生物分解性聚合物的极细纤维多根捆扎的材料编成管状的管状体。多孔质体、编孔(网孔)的细孔径或空隙率随着作为目的的用途、强度可进行适当调整。另外，含生物分解性聚合物的极细纤维的直径优选为1 50 μ m。若纤维直径过小，由于纤维间隙过密，有时胶原蛋白不容易浸透，管状体的柔软性降低。相反，若纤维直径过大，有时胶原蛋白的保持量变少，神经成长速度不能提高，管状体的强度不足。更优选地， 极细纤维的直径为3 40 μ m，尤其优选为6 30 μ m。在管状体成形中，优选地将含有具有所述纤维直径的生物分解性聚合物的极细纤维5 60根进行捆扎，作为经线以及纬线相互编织。若极细纤维捆扎根数过少，有时管状体的强度不足，不能确保足够的胶原蛋白的保持量。相反，若极细纤维捆扎根数过多，有时不能制作细径的管状体，不能确保管状体的柔软性。更优选地，极细纤维为10 50根，尤其优选为20 40根。在将所述极细纤维束相互编织成形为管状体时，网孔的孔径优选为约5 300 μ m，更优选为10 200 μ m。若网孔的孔径过小，有时由于毛细血管的侵入或水透过性的低下阻碍细胞或组织的增殖。若超过约300 μ m则组织过度进入，有时阻碍细胞或组织的增殖。在本发明中，管状体的外部表面通过本领域普通技术人员用公知的方法多次涂布胶原蛋白溶液进行被覆，管状体的内部(内腔)通过填充胶原蛋白而被充满。此时，胶原蛋白溶液还可含有昆布氨酸，硫酸乙酰肝素蛋白多糖，巢蛋白(工々f 4 >)以及生长因子。作为生长因子，可举出EGF (上皮增殖因子)，β FGF (成纤维细胞增殖因子)，NGF (神经生长因子)，PDGF(血小板由来增殖因子)，IGF-I (胰岛素样增殖因子)，TGF-β (转化生长因子)等。另外，优选地胶原蛋白溶液以盐酸溶液的形式用刷毛或毛笔每涂布1次完全干燥后再进行下一次塗布的方式进行多次涂布。优选地，被胶原蛋白被覆以及充填的管状体，实施冷冻，冷冻干燥，交联处理使胶原蛋白交联。冷冻优选地以-10 196°C，更优选地以-20 -80°c、3 48小时的条件进行。 通过进行冷冻，在胶原蛋白分子间形成微细的冰粒，使胶原蛋白溶液发生相分离，进行海绵体化。然后，将所述冷冻的胶原蛋白溶液在真空下，进行初期温度-40 -80°C，约12 48 小时的冷冻干燥。通过进行冷冻干燥，在胶原蛋白分子间的微细冰粒气化的同时，胶原蛋白海绵体微细化。作为交联方法，可举出Y线交联，紫外线交联，电子线交联，热脱水交联，戊二醛交联，环氧交联，以及水溶性碳二亚胺交联，但优选为容易控制交联程度，即使进行交联处理也对生物体无影响的热脱水交联。热脱水交联处理在真空下，例如约105 150°C， 更优选为约120 150°C，尤其优选为约140°C的温度下，例如约6 M小时，更优选为约 6 12小时，尤其优选为约12小时进行。若交联温度过高，可能降低生物体内分解吸收性材料的强度。另外，若交联温度过低有可能不发生足够的交联反应。实施例以下示出证实本发明的胶原蛋白的効果优越性的实验。(氯化钠浓度的测定)根据原子吸收分光光度法的氯化钠浓度测定如下所示，用石英杯取样品1 4g， 在电热器上缓慢升高温度使之碳化后，最终用马弗炉进行6 8小时灰化(500°C )。残渣以10重量％盐酸水溶液再溶解后，稀释成最终浓度1重量％，用根据乙炔-空气的火焰原子吸收分光光度法进行测定。需要说明的是，测定波长为589. 6nm。实验1 胶原蛋白凝胶培养实验1.本实验的目的通常，细胞培养实验以在孔板底面的二维培养为基本。但是，一般认为在进行三维培养时，与二维培养时的细胞行动差异较大，既然评价神经再生能力，一般认为三维培养为更加接近实际的体系。因此，在本实验中用胶原蛋白凝胶进行三维培养，目的在于确认随胶原蛋白种类不同培养细胞的行动是否不同。2.本实验使用的胶原蛋白(1)比较例的胶原蛋白使用了日本〃 K (株)制的“NMP胶原蛋白PS”作为比较例的胶原蛋白。该比较例的胶原蛋白为用猪皮作为出发原料通过进行脱脂处理以及精制处理而制造，在脱脂处理中包含用氯化钠溶液反复洗涤工序，在精制处理中包含根据氯化钠的盐析工序。该比较例的胶原蛋白用原子吸收分光光度法(灰化)进行测定后，在干燥状态含有4. 0重量％的氯化钠。(2)本发明实施例的胶原蛋白利用上述比较例的胶原蛋白的一部分作为出发原料，通过在pH8以上且低于9的等电点沉淀将其进行精制，制造了本发明实施例的胶原蛋白。该本发明实施例的胶原蛋白用原子吸收分光光度法(灰化)进行测定后，在干燥状态含有1. 0重量％的氯化钠。3.胶原蛋白凝胶培养基的制作将上述准备的2种胶原蛋白分别依照常规方法溶解于盐酸中，调制了 0. 5重量％胶原蛋白-盐酸溶液。其中，在对微孔板(IWAKI制)的8个孔中加入各300 μ 1本发明实施例的胶原蛋白溶液，在相同板的其他8个孔中加入各300μ 1比较例的胶原蛋白溶液。然后，将板在培养箱内37°C下静置30分钟。4. PC12细胞的胶原蛋白凝胶培养(1)预先将PC12细胞(大日本制药Laboratory Products制的大鼠副肾褐色细胞肿由来的细胞)用DMEM培养基培养至传代数6，通过离心分离回收细胞后，在DMEM培养基 15ml中调整细胞数为IX IO6个进行悬浊，加入15μ 1的50 μ g/mlNGF (细胞增殖因子，R&D systems Inc.制，磷酸缓冲溶液)，调制成培养液。需要说明的是，DMEM培养基是指，在500ml RPMI 1640液体培养基(大日本制药 Laboratory Products制，不含有谷氨酸，含有碳酸氢钠)中添加25ml的胎牛血清(大日本制药 Laboratory Products 制)，50ml 的马血清(大日本制药 Laboratory Products 制)， 5ml的200mM谷氨酸液(大日本制药Laboratory Products制，29. 23mg/ml)混合而成的物质。(2)向预先制作的胶原蛋白凝胶培养基的孔中滴下各300 μ 1制备的培养液。(3)在培养箱内(37 °C，CO2浓度5. 0% )培养孔板4天。5.细胞情况的观察4天培养后，用显微镜观察胶原蛋白凝胶内的细胞的情况，对代表例进行了照片拍照。其结果在图1以及图2中示出。6.生存细胞数的测定(1)为了测定4天培养后的生存细胞数，向孔中各滴下50 μ 1的1重量％胶原蛋白酶溶液，一边轻轻搅拌每个孔，一边在37°C，30分钟下使胶原蛋白凝胶溶解。(2)胶原蛋白凝胶溶解后，向各孔中加入50μ 1 MTT分析溶液，在培养箱内静置30 分钟。(3)30分钟静置后，测定450nm下的吸光度，对各胶原蛋白凝胶从8个孔的吸光度值求出平均值以及标准偏差，在图3以图表示。需要说明的是，在图3的图中，本发明实施例的胶原蛋白的吸光度是以比较例的胶原蛋白凝胶的平均吸光度为100作为相对值进行表示。另外，吸光度与生存细胞数成正比例。7.本实验的考察(1)细胞情况的观察从图1以及图2的对比可知，使用了本发明实施例的胶原蛋白的培养(图1)比使用了比较例的胶原蛋白的培养(图2)，细胞更加良好增殖，神经突起的延长也非常显著。(2)生存细胞数的测定如图3所示，使用了本发明实施例的胶原蛋白的培养的吸光度比使用了比较例的胶原蛋白的培养的吸光度平均高39%，该差为统计学上有意义的差(ρ <0.01)。因此，从图 3的结果可知，相对于比较例的胶原蛋白，本发明实施例的胶原蛋白具有有意义地高细胞增殖能力。(3)从以上的结果可以认为，相对于以往的比较例的胶原蛋白，本发明实施例的胶原蛋白细胞在增殖能力以及分化诱导能力上非常优良。实验2 胶原蛋白涂层的附着性实验
1.本实验的目的为了进行本发明实施例的胶原蛋白和以往的胶原蛋白的细胞附着性的比较，在以两种胶原蛋白培养后，用吸引器对浮游的细胞进行吸引除去，仅测定附着于板的细胞，目的在于通过比较其数量，确认随胶原蛋白种类不同是否在细胞附着性上存在有意义的差别。2.胶原蛋白涂层的制作(1)将实验1中使用的本发明实施例的胶原蛋白和比较例的胶原蛋白用盐酸稀释成0. 05重量％，在M微孔板(IWAKI制)的各8个孔中加入这些胶原蛋白溶液各300 μ 1， 在冰箱中静置1小时。(2)静置1小时后，用吸引器吸引各孔的胶原蛋白溶液，在净化台内对孔中付着的胶原蛋白涂层自然干燥1小时。3. PC12细胞的胶原蛋白涂层培养(1)预先将PC12细胞(大日本制药Laboratory Products制的大鼠副肾褐色细胞肿由来的细胞)用DMEM培养基培养至传代数6，通过离心分离回收细胞后，在DMEM培养基 25ml中调整细胞数为5 X IO6个进行悬浊，加入25 μ 1的50 μ g/mlNGF (细胞增殖因子，R&D systems Inc.制，磷酸缓冲溶液)，调制成培养液。(2)向预先制作的胶原蛋白涂层孔板的各孔中加入制备的培养液各300 μ 1。(3)在培养箱内(37 °C，CO2浓度5. 0% )对孔板进行5天培养。4.附着细胞数的测定(1)为了去除浮游细胞以及未牢固附着的细胞，一边将孔板倾斜85度，一边吸引全部的培养基。此时，注意不要吸引附着细胞。(2)然后，向各孔中加入300 μ 1 DMEM培养基和30 μ 1 MTT分析溶液，在培养箱内
静置30分钟。(3)30分钟静置后，测定450nm下的吸光度，对各胶原蛋白涂层从8个孔的吸光度值求出平均值以及标准偏差，图4中以图进行表示。需要说明的是，在图4的图中，本发明实施例的胶原蛋白涂层的吸光度是以比较例的胶原蛋白涂层的平均吸光度为100作为相对值进行表示。5.本实验的考察如图4所示，相对于比较例的胶原蛋白涂层的吸光度，表示本发明实施例的胶原蛋白涂层的附着细胞数的吸光度平均高49%，该差为在统计学上有意义的差(0.01 < ρ < 0. 05)。再生医疗的基础的细胞附着性为非常重要的要素，从图4的结果可知，与以往的胶原蛋白相比，本发明的胶原蛋白更适于作为神经再生的基础使用。实验3 变化氯化钠浓度的胶原蛋白涂层培养实验1.本实验的目的目的在于研究胶原蛋白中的氯化钠含有浓度的不同对细胞的生存和增殖有多大影响。2.胶原蛋白涂层的制作(1)准备了实验1中使用的本发明实施例的胶原蛋白，向其中加入氯化钠并将氯化钠浓度调整为5重量％，10重量％的样品，实验1中使用的比较例的胶原蛋白，向其中添加氯化钠并调整氯化钠浓度为5重量％，10重量％的样品(参考图5的胶原蛋白涂层1 6)。将各胶原蛋白调整为0. 01重量％盐酸溶液，使用2枚M微孔板(IWAKI制)，在4个孔中滴下各胶原蛋白各300μ 1，静置于冰箱中1小时。小时静置后，将各孔的胶原蛋白溶液用吸引器进行吸引，在净化台内对附着于孔中的胶原蛋白涂层进行1小时自然干燥。3. PC12细胞的胶原蛋白涂层培养(1)预先将PC12细胞(大日本制药Laboratory Products制的大鼠副肾褐色细胞肿由来的细胞)用DMEM培养基培养至传代数6，通过离心分离回收细胞后，在DMEM培养基 15ml中调整细胞数为IX IO6个进行悬浊，加入15μ 1的50 μ g/mlNGF (细胞增殖因子，R&D systems Inc.制，磷酸缓冲溶液)，调制成培养液。(2)向预先制作的胶原蛋白涂层孔板的各孔中滴下制备的培养液各300 μ 1。(3)在培养箱内(37 °C，CO2浓度5. 0% )对孔板进行5天培养。4.生存细胞数的测定(1)向各孔中加入MTT分析溶液各30μ1，在培养箱内静置30分钟。(2)30分钟静置后，测定450nm下的吸光度，对各胶原蛋白涂层从8个孔的吸光度值求出平均值以及标准偏差，图6，7中以图表进行表示。需要说明的是，在图6，7的图中，本发明实施例的胶原蛋白涂层的吸光度是以比较例的胶原蛋白涂层的平均吸光度为100作为相对值进行表示。5.本实验的考察如图6以及7所示，具有胶原蛋白的氯化钠浓度越低，吸光度越大的倾向，相对于使用了比较例的胶原蛋白(胶原蛋白涂层6 (氯化钠浓度10重量％))的培养的吸光度，使用了本发明实施例的胶原蛋白(胶原蛋白涂层1(氯化钠浓度1重量％))的培养的吸光度平均高27%，该差为统计学上有意义的差(p<0.01)。从图6以及7的结果可知，与比较例的胶原蛋白相比，氯化钠浓度低的本发明实施例的胶原蛋白在细胞增殖能力上非常优良。实验4 通过使用等电点不同的胶原蛋白的神经冠细胞培养的细胞分化评价实验1.本实验的目的目的在于研究胶原蛋白等电点的不同对细胞分化有何种程度的影响。2.等电点浓缩胶原蛋白粉末的制备(1)向6g的NMP胶原蛋白PS中加入MilliQ水，制备了总量IOOOml的0.6重量％
胶原蛋白溶液。(2)在冰上搅拌1 3天，使胶原蛋白完全溶解在水中。(3)滴下IN NaOH，在其他容器中回收了 pH5. 5的状态下含沉淀的200ml胶原蛋白溶液。(4)继续滴下IN NaOH,在pH8. 5的状态，以及ρΗΙΟ. 2的状态下同样地在其他容器中回收了各200ml。(5)将得到的3个样品移至离心管中，3，OOOrpm下进行了 45分离心分离。(6)废弃各离心管的上清液，将沉淀在_40°C进行整夜冷冻后，用冷冻干燥机处理 2天。(7)将所述得到的样品依次为，样品1 (ρΗ5· 5)，样品2(ρΗ8. 5)，样品3(ρΗ10. 2)。需要说明的是，在各胶原蛋白样品中，氯化钠浓度为1.2重量％。
10
3.胶原蛋白溶液的制备(1)向各300mg的所述样品1，2，3中加入0. OOlM HC1，制备了总量IOml的0. 3重
量％胶原蛋白溶液。(2)用Voltex混合后，4°C下整夜放置使胶原蛋白完全溶解。(3)向0. 3重量％浓度的各样品Iml中加入9ml的0. OOlM HCl充分混合，制备了
0. 03重量％胶原蛋白溶液。(4)向对微孔板(IWAKI制)的各孔中，分别注入所述0. 03重量％胶原蛋白溶液各200 μ 1，室温(20°C )下放置10分钟。(5)吸引胶原蛋白溶液，添加Iml PBS(-)后进行吸引洗涤，再反复进行再度洗涤。(6)保持原状地在净化台内静置干燥。4.细胞培养(1)将神经冠由来色素细胞(夕，#々制，Code No. KM-4009MP)用专用培养基(夕 7 々制，Code No. M-254-500+Code No. S-002-5)稀释为 3. 75X l(Mcells/ml，在各孔播种各 500 μ 1。(2)在 37°C，5.0% CO2 浓度中培养 4 天。(3)吸引培养基后，重新添加500μ1专用培养基，继续在37°C，5.0%C02浓度中培养3天。(4)吸引培养基后，重新添加500 μ 1专用培养基，在37 °C，5.0% CO2浓度中进一步培养4天后，观察了各孔细胞分化的程度。5.本实验的考察如图8 10所示，由于胶原蛋白等电点的不同，在细胞分化的水平上可见显著差异，从细胞形态的观察可确认样品2 (pH8. 5)显著地促进了分化。此外，从图11，12可确认，在算出生存的全部细胞中的分化细胞比例时，与pH5. 5， ρΗΙΟ. 2相比，在pH8. 5下细胞分化率)较高。细胞分化率(％ )=分化细胞数/生存的全部细胞数一般而言，考虑到胶原蛋白在生物体内约2周被代谢·吸收，若培养11日后具有 40%以上的细胞分化率，在实际的神经再生情况中可认为可得到良好的结果。更优选细胞分化率为50%以上，还更优选为60%以上，尤其优选为70%以上。本发明的神经再生诱导管由于细胞附着性，细胞增殖能力，细胞分化诱导能力优良，在神经再生医疗中的适用非常广泛，非常有用。
权利要求
1.一种神经再生诱导管，其特征在于，在使用胶原蛋白作为神经再生的基础的神经再生诱导管中，使用处理后氯化钠含有浓度在干燥状态下为2. 0重量％以下的胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的神经再生诱导管，其特征在于，使用处理后氯化钠含有浓度在干燥状态下为0. 1 1.5重量％的胶原蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的神经再生诱导管，其特征在于，胶原蛋白为通过在pH6.0 以上，低于10. 0的等电点沉淀进行精制处理的胶原蛋白。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的神经再生诱导管，其特征在于，在含有生物分解性聚合物的管状体上被覆胶原蛋白，再在管状体的内部填充胶原蛋白而形成。
全文摘要
本发明提供一种使用细胞附着性，细胞增殖能力以及细胞分化诱导能力优良的胶原蛋白作为神经再生的基础的神经再生诱导管。一种使用胶原蛋白作为神经再生的基础的神经再生诱导管，其特征在于，使用处理后氯化钠含有浓度在干燥状态下为2.0重量％以下，优选为0.1～1.5重量％的胶原蛋白。胶原蛋白的精制通过pH6.0以上，低于10.0的等电点沉淀进行。
文档编号A61L27/00GK102387821SQ20098015862
公开日2012年3月21日 申请日期2009年2月2日 优先权日2009年2月2日
发明者柏原进, 梶井文彦, 田中秀典, 铃木道子 申请人:东洋纺织株式会社