专利名称：用于神经桥接的导管填充材料及其制备方法
技术领域：
本发明是属于一种用于神经缺损后修复与再生的新型组织工程填充材料，特别涉及用于神经桥接术导管内作为促神经生长的细胞、各种因子载体的填充材料及其制备方法。
背景技术：
目前，临床工作中对于神经缺损的修复大多仍采取自体神经移植的方法，取相对次要的神经作为供体来修补缺损神经。该方法除存在牺牲供区神经功能的弊病外，还存在着无法对较长段神经缺损进行有效治疗的严重不足。随着组织工程学的迅猛发展，导管桥接术的问世一定程度上解决了这一长期困扰临床工作者的难题。然而，临床上神经缺损的桥接虽应用了静脉、硅胶管及壳聚糖等多种生物材料，但仍存在着诸多不足，例如桥接物仅起到缺损断端连接作用，对神经再生没有促进作用，由于注入的各种促神经生长成分处于液体状态，在导管内局部不宜存留；导管因自身结构特点容易塌陷，影响其功能、作用的发挥；以及瘢痕组织的形成。这些问题都影响着缺损神经的修复与再生，所以制约了临床的应用与推广。
理想的人工神经是以具有良好生物相容性的可降解高分子聚合物为载体，与有活性的细胞及因子结合而形成的具有特定三维结构和生物活性的复合体，允许再生神经纤维生长到远侧神经残端，抑制神经瘤的形成和纤维瘢痕组织长入，能够为神经的修复与再生营造有利微环境等特点。
透明质酸是由(1→4)-D-葡萄糖醛酸-β(1→3)-N-乙酰氨基葡萄糖的双糖构成的线性多糖类大分子物质，广泛存在于人及各种动物结缔组织中。由于其分子间作用形成复杂的三级网状结构，从而获得了诸多特性，如维持组织形态，润滑，扩散屏障和缓冲应力等机械功能和重要的生理功能，同时又具有显著的粘弹性。透明质酸也是构成细胞间质和细胞外基质的主要成分，细胞外基质在维持组织器官的正常生理功能、支持细胞的生长分化以及损伤组织的修复过程中均扮演了关键的角色。在创伤愈合过程中，细胞外基质影响了细胞的行为表现，而细胞也反之通过多种途径对细胞外基质进行调节，从而形成了一个贯穿整个愈合过程而又不断变化的支持细胞生长发育的微环境。组织的修复与再生过程是一个牵涉到多种细胞和生物大分子进行细胞增殖、分化和基质重建的过程。在创伤发生的早期，局部的成纤维细胞、举噬细胞等在生长因子的作用下，合成透明质酸的数量明显增高。在对比胚胎和出生后的研究中表明，在胚胎皮肤创伤的修复过程中，透明质酸保持了很高的浓度，从而抑制了胶原纤维组织的挛缩，直至组织得到再生性修复而不留下瘢痕。出生后，透明质酸在早期保持了较高的浓度，但随后在透明质酸酶的作用下逐步被降解，同时胶原纤维的合成却在不断增加，最终形成了瘢痕性修复。另外，透明质酸还具有促进血管生长、改善损伤局部微循环、促进生长因子表达的作用。透明质酸分子中含有大量的羧基和羟基，在水溶液中形成分子内和分子间氢键。这使其具有强大的保水作用，可结合多于本身1000倍的水。现有技术中已有以透明质酸钠为主要成分，同其他辅料和药理活性物质如壳聚糖、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、表皮生长因子、杀菌剂等配成复方制剂应用于临床，主要用于治疗烧烫伤的粉末剂(专利号CN1335135)；另外，透明质酸钠在应用于外科手术中的防粘连医用制剂里也发挥了重要作用(专利号CN1295838)。以透明质酸钠为主要成分作为神经桥接的导管填充材料，目前检索尚未见到。
发明内容
为了补充和完善现有技术对神经桥接物仅起到缺损断端连接引导、屏壁作用，而对神经再生缺乏促进作用，以及在导管内注入的各种促神经生长成分处于液体状态，在导管内局部不宜存留，以及导管因自身结构特点容易塌陷，影响其功能、作用发挥的问题，本发明提供了一种用于神经桥接导管的填充材料及其制备方法。
本发明用于神经桥接的导管填充材料所采用的技术方案是所说的导管填充材料包括有透明质酸钠精制干粉(A)、生理平衡液(B)，促神经生长细胞生长因子(C)或促神经生长的各种细胞(D)。
所指的促神经生长细胞生长因子(C)可以是神经生长因子、脑源性神经生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成肌细胞生长因子、睫状神经生长因子、胶质源性神经营养因子的一种或多种。
所说的促神经生长细胞(D)可以是雪旺氏细胞、肌肉干细胞、骨髓基质干细胞的一种或多种。
本发明所说的用于神经桥接的导管填充材料的制备方法包括如下步骤(1)将透明质酸钠干粉(青岛盛洋生物公司)加入去离子水，配成0.01～0.2％的透明质酸钠溶液，通过0.22μm醋酸纤维素膜进行除菌过滤，收集除菌滤液，加入1-5倍量的无菌丙酮或乙醇溶液，收集沉淀，真空干燥后得到无菌透明质酸钠精制干粉(A)；(2)取1～10％透明质酸钠精制干粉(A)，溶于90％～99％生理平衡液(B)，调节其PH值为7.0～7.4，充分搅拌配制成1～10mg/ml浓度的透明质酸钠凝胶，静止脱泡，1～10℃冷藏备用；(3)加入1％～10％促神经生长因子(C)或有促神经生长作用的细胞(D)。
该导管的填充材料经上述制备方法，制成一种凝胶状，不仅可以支撑导管，解决导管塌陷的问题，还可以因其自身生物学特性在导管内营造有利于神经生长的微环境，促进、引导神经再生。另外还可以作为加入导管中的各种外源性物质(如药物因子、细胞、基因等)的载体，发挥对细胞及营养因子控释或细胞外基质载体的作用。
本发明的有益效果是在神经桥接术中对神经导管壁起到有效的支撑作用，能防止管壁塌陷，同时为神经缺损的修复与再生过程中发挥促进组织引导作用并营造了有利于神经缺损修复与再生的微环境。在作为加入导管中的各种促神经修复与再生物质的载体时还能发挥生物控释或细胞外基质载体的作用。本发明采用的填充材料在人体可吸收降解，无毒无害，无须二次手术，应用操作简单，可以大大提高导管修复神经缺损的疗效。
目前，在大鼠体内已经进行了实验，并取得了显著效果。选取健康成年清洁级SD雄性大鼠30只(军事医学科学院动物中心提供)，体重200～250g，平均223g。1％戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔内注射麻醉。消毒后，取股后斜切口，暴露右侧坐骨神经，并在梨状肌出口下方5mm处将坐骨神经切除约8mm，任其回缩，造成10mm缺损，用无损伤显微缝合线将神经远、近断端与桥接导管缝合固定2针，缝合方法采用两定点套接法分别在神经干周径180°两相对位置各缝合1针，使得再生神经断端套入桥接管内1mm。动物数量平均分为5组A组不加入任何导管填充物。
B组用一次性无菌注射器(套接特制大孔径针头)吸取适量透明质酸钠凝胶由导管一侧注入，使导管充分充盈。
C组用一次性无菌注射器(套接特制大孔径针头)吸取适量已经加入促神经生长因子(睫状神经生长因子)的透明质酸钠凝胶由导管一侧注入，使导管充分充盈。
D组用一次性无菌注射器(套接特制大孔径针头)吸取适量已经加入促神经生长细胞(肌源性干细胞)的透明质酸钠凝胶由导管一侧注入，使导管充分充盈。
E组。用一次性无菌注射器(套接特制大孔径针头)吸取适量已经加入促神经生长因子(睫状神经生长因子)和促神经生长细胞(肌源性干细胞)的透明质酸钠凝胶由导管一侧注入，使导管充分充盈。
而后逐层缝合股后肌肉及皮肤切口，按常规标准统一分笼饲养。待4、8和12周后分别取各组实验动物进行检测。
一、肢体观察术后即发现大鼠右后肢、足趾弯曲，无法伸展，拖曳行走，针刺不能引发收缩；术后1周时发现各组大鼠右侧足跟负重区皮肤均有不同程度红肿，2周时A、组中出现足底轻度溃疡，随后趋于愈合。术后3周全部出现局部肌肉萎缩；术后4周肌肉萎缩有不同程度恢复，肌肉僵直有所减轻，行走时拖曳程度降低，A、B组中各有1和3只(各组总数均6只)有针刺反应，但不明显；C、D、E各组中分别有5、5和6只(各组总数均6只)有针刺反应；8周时共有25只大鼠，其中A、B组各有2和3只，C、D、E组各有5、4、5只(各组总数均5只)右后肢肌肉僵直度明显降低，外力可使之伸展，足趾有较大握力，存在明显针刺反应，足趾观察拖曳程度明显降低。
二、解剖学观察术后12周各组取1只大鼠，1％戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔内注射麻醉后再次切开并暴露坐骨神经，可见植入的导管及两端的神经均包绕着由纤维结缔组织形成的包壳，与周围组织无明显粘连。剪开并取出导管后，除A外，各组均可见再生神经，远、近端与正常神经连接处光滑无断裂，无瘢痕组织、神经瘤形成，表面可见微小血管网形成，外形似正常神经，直径较正常的神经干细，C、D、E组略粗于B组。A组导管内充满淡黄色的液体，无再生神经通过。
三、坐骨神经指数(SFI)Bain公式计算SFI＝-38.3[(EPL-NPL)/NPL]+109.5[(ETS-NTS)/NTS]]+13.3[(EIT-NIT)/NIT]-8.8SFI值0％～±11％表示神经功能完全正常，-100％表示神经功能完全丧失，-11％～-100％之间表示部分神经功能恢复。
见表1，A组术后各时间点均不及其他各组，差异有统计学意义(P＜0.01)。术后4周B、C、D组SFI相比较，无显著性差别(p＞0.05)；术后8周、12周，C、D、E组SFI恢复情况明显优于B组，同时，E组SFI优于C、D组，差别有统计学意义(p＜0.01)。
表1 术后4、8、12周时各组坐骨神经指数(SFI)比较(n＝6，x±s)
四、电生理检查术后12周，清醒状态下，用肌电图仪检测患肢小腿三头肌的肌电图。麻醉状态下，暴露术侧坐骨神经，检测坐骨神经传导速度、复合肌肉动作电位的波幅。
见表2，A组为纤颤电位，可见正尖波，表现为完全失神经电位；B、C、D、E组腓肠肌肌电图为混合相电位，呈部分失神经电位表现；E组的运动神经传导速度及波幅略高于C、D组，但明显高于B组(P＜0.01)。
表2 术后12周神经电生理检测(n＝6，x±s)
五、完整的取下双侧的腓肠肌，ER-182A电子天平(1/2000g)测量其湿重，计算腓肠肌湿重恢复率。观其表3结果可见C、D、E组腓肠肌湿重恢复率好于A组和B组。其中E组指标最佳。
表3 术后12周腓肠肌湿重恢复率(％)(n＝6，x±s)
六、组织学检查1、光学显微镜观察HE纵切片染色显示，C、D组与E组桥接处神经结构连续性良好，再生神经全部长入远端，再生神经纤维排列整齐，周围可见大量新生血管，未见有变性坏死及瘢痕化等情况。B组桥接处神经结构连续性不良，仅有少量神经纤维通过，长入远端，再生神经纤维排列紊乱，新生血管较少。
HE横切片染色显示，C、D组与E组均可见大量的再生神经纤维，排列紧密。而B组再生神经纤维数量较少，排列疏松。而且再生神经纤维的直径较细小。
S-100免疫组织化学染色显示，C、D与E组可见S-100免疫反应阳性的雪旺氏细胞沿神经纤维分布成条带状。而B组S-100免疫反应阳性的雪旺氏细胞数量较少，且未呈明显的条带状分布。
2、透射电镜观察E组再生神经纤维轴突形态接近正常，大量有髓和无髓神经纤维，形状比较规则，有髓纤维髓鞘厚度较正常薄。而B组的再生神经纤维细小，形状不规则，各条神经纤维大小不一，排列疏松，髓鞘厚度较薄，轴突结构不完整。
3、再生神经纤维图像分析图像分析结果见表4，术后12周，B、C、D、E组再生有髓纤维密度均高于正常组(P＜0.01)；同时比较B、C、D、E组，有髓神经纤维密度、神经纤维有效面积、有髓神经纤维数量、直径及髓鞘厚度等指标上C、D、E组均优于B组(P＜0.05或P＜0.01)。其中以E组最为明显。
表4 术后12周再生神经形态图像分析结果(n＝6，x±s)
具体实施方式
一、(1)将透明质酸钠干粉加入去离子水，配成0.1％的透明质酸钠溶液，通过0.22μm醋酸纤维素膜进行除菌过滤，收集除菌滤液，加入4倍量的无菌丙酮液，收集沉淀，真空干燥后得到无菌透明质酸钠精制干粉(A)；(2)取6mg透明质酸钠精制干粉(A)，溶于1ml生理平衡液(B)[77％ DMEM(GIBCO公司)，20％FBS(SIGMA公司)]，2％Glutamine(SIGMA公司)和1％青链霉素(大连美罗)，氢氧化钠液调节其PH值为7.0～7.4，加入适量(C)[神经生长因子(20ng/μl)]，使其浓度达到5％，充分搅拌配制成透明质酸钠凝胶。1～10℃冷藏备用。
手术前将冷藏备用的透明质酸钠凝胶取出室温放置，术中将神经缺损处两侧断端修整后应用导管行端-端外膜缝合，再用一次性无菌注射器(套接特制大孔径针头)吸取适量透明质酸钠凝胶由导管一侧或穿刺导管注入，使其导管充分充盈，从而形成了一个以导管为外壁，透明质酸钠凝胶为内容物，富含促神经修复与再生的因子的有利微环境。同时，因为透明质酸钠凝胶的物理性状，对管壁也起到了有力的支持作用。
二、(1)将透明质酸钠干粉加入去离子水，配成0.1％的透明质酸钠溶液，通过0.22μm醋酸纤维素膜进行除菌过滤，收集除菌滤液，加入4倍量的无菌丙酮液，收集沉淀，真空干燥后得到无菌透明质酸钠精制干粉(A)；(2)取6mg透明质酸钠精制干粉(A)，溶于1ml生理平衡液(B)[77％DMEM(GIBCO公司)，20％FBS(SIGMA公司)]，2％Glutamine(SIGMA公司)和1％青链霉素(大连美罗)，氢氧化钠液调节其PH值为7.0～7.4，加入适量(C)[睫状神经生长因子(60ng/μl)]，使其浓度达到5％，充分搅拌配制成透明质酸钠凝胶。1～10℃冷藏备用。
手术前将冷藏备用的透明质酸钠凝胶取出室温放置，术中将神经缺损处两侧断端修整后应用导管行端-端外膜缝合，再用一次性无菌注射器(套接特制大孔径针头)吸取适量透明质酸钠凝胶由导管一侧或穿刺导管注入，使其导管充分充盈。
三、(1)将透明质酸钠干粉加入去离子水，配成0.1％的透明质酸钠溶液，通过0.22μm醋酸纤维素膜进行除菌过滤，收集除菌滤液，加入4倍量的无菌丙酮液，收集沉淀，真空干燥后得到无菌透明质酸钠精制干粉(A)；(2)取6mg透明质酸钠精制干粉(A)，溶于1ml生理平衡液(B)[77％ DMEM(GIBCO公司)，20％FBS(SIGMA公司)]，2％Glutamine(SIGMA公司)和1％青链霉素(大连美罗)，氢氧化钠液调节其PH值为7.0～7.4，加入适量(C)[睫状神经生长因子(60ng/μl)]，使其浓度达到5％，充分搅拌配制成透明质酸钠凝胶。1～10℃冷藏备用。
将所取肌肉标本(1cm×1cm×1cm左右或更大)用高糖无血清无双抗DMEM液(GIBCO公司)冲洗2次，洗去血液及脂肪等，剔除筋膜，剪成1mm3的碎片(肉泥)加入混合酶(SIGMA公司)(1g/1.5ml)后用吸管吹打5min后在37℃(孵箱中即可)条件下消化45min，每15min用吸管吹打1次。45分钟后，肌肉组织应呈糊状，目视无明显杂质，此时即可加入培养液(82％DMEM(GIBCO公司)，15％FBS(SIGMA公司)，2％Glutamine(SIGMA公司)和1％青链霉素(大连美罗)终止消化，培养液量为加入混合酶的2～3倍。经200目筛网过滤后，用培养液重悬细胞，每分钟1000转离心5min，弃上清，加入培养液重悬细胞后，接种于25cm2培养瓶(CORNING公司)中并标记为P1。放入37℃、5％CO2孵箱中培养，2小时后将培养瓶中的培养基以及悬浮的细胞一起转移到新的培养瓶中(P2)。24h后取出P2的上清液移置到离心管中，以每分钟1000转的速度离心10分钟。离心结束后去除上清，此时便可得到纯度较高的P3。
手术前将冷藏备用的透明质酸钠凝胶取出室温放置，并用微量移液器将准备好的(D)均匀搅拌在透明质酸钠凝胶中。术中将神经缺损处两侧断端修整后应用导管行端-端外膜缝合，再用一次性无菌注射器(套接特制大孔径针头)吸取适量透明质酸钠凝胶由导管一侧或穿刺导管注入，使其导管充分充盈。从而形成了一个以导管为外壁，透明质酸钠凝胶为内容物，富含促神经修复与再生的细胞与因子的有利微环境。对管壁起到有力支持作用的同时，将更好的发挥其疗效。
权利要求
1.一种用于神经桥接的导管填充材料，包括有透明质酸钠精制干粉(A)、生理平衡液(B)，其特征在于还含有促神经生长细胞生长因子(C)或促神经生长的各种细胞(D)组成。
2.根据权利要求1所说的用于神经桥接的新型导管填充材料，其特征在于所说的透明质酸钠精制干粉(A)、生理平衡液(B)、促神经生长细胞生长因子(C)的构成是(A)1～10％；(B)80％～99％；(C)1～10％。
3.根据权利要求1所说的用于神经桥接的新型导管填充材料，其特征在于所说的透明质酸钠精制干粉(A)、生理平衡液(B)、促神经生长的各种细胞(D)的构成可以是(A)1～10％；(B)80％～99％；(D)微量。
4.根据权利要求1所说的用于神经桥接的导管填充材料，其特征在于所说的透明质酸钠精制干粉(A)、生理平衡液(B)、促神经生长细胞生长因子(C)、促神经生长的各种细胞(D)的构成可以是(A)1～10％；(B)80％～99％；(C)1～10％；(D)微量。
5.根据权利要求2所说的用于神经桥接的导管填充材料，其特征在于，所说的促神经生长因子(C)可以是成纤维生长因子、睫状神经生长因子、神经营养因子的一种或多种。
6.根据权利要求3所说的用于神经桥接的导管填充材料，其特征在于，所说的促神经生长的细胞(D)可以是雪旺氏细胞、肌肉干细胞、骨髓基质干细胞的一种或多种。
7.根据权利要求4所说的用于神经桥接的导管填充材料，其特征在于所说的促神经生长细胞生长因子(C)可以是神经生长因子、脑源性神经生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成肌细胞生长因子、睫状神经生长因子、胶质源性神经营养因子、胰岛素样生长因子的一种或多种；所说的促神经生长细胞(D)可以是雪旺氏细胞、骨髓基质干细胞、肌肉干细胞的一种或多种。
8.一种如权利要求1或2所说的用于神经桥接的导管填充材料的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)将透明质酸钠干粉加入去离子水，配成0.01～0.2％的透明质酸钠溶液，通过0.22μm醋酸纤维素膜进行除菌过滤，收集除菌滤液，加入1-5倍量的无菌丙酮或乙醇溶液，收集沉淀，真空干燥后得到无菌透明质酸钠精制干粉(A)；(2)取1～10％透明质酸钠精制干粉(A)，溶于90％～99％生理平衡液(B)，调节其PH值为7.0-7.4，充分搅拌配制成1～10mg/ml浓度的透明质酸钠凝胶，静止脱泡，1-10℃冷藏备用；(3)加入微量促神经生长细胞生长因子(C)制备成用于神经桥接的导管填充材料。
9.一种如权利要求1或3所说的用于神经桥接的导管填充材料的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)将透明质酸钠干粉加入去离子水，配成0.01～0.2％的透明质酸钠溶液，通过0.22μm醋酸纤维素膜进行除菌过滤，收集除菌滤液，加入1-5倍量的无菌丙酮或乙醇溶液，收集沉淀，真空干燥后得到无菌透明质酸钠精制干粉(A)；(2)取1～10％透明质酸钠精制干粉(A)，溶于90％～99％生理平衡液(B)，调节其PH值为7.0-7.4，充分搅拌配制成1～10mg/ml浓度的透明质酸钠凝胶，静止脱泡，1-10℃冷藏备用；(3)加入微量促神经生长的细胞(D)制备成用于神经桥接的导管填充材料。
10.一种如权利要求1或4所说的用于神经桥接的导管填充材料的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)将透明质酸钠干粉加入去离子水，配成0.01～0.2％的透明质酸钠溶液，通过0.22μm醋酸纤维素膜进行除菌过滤，收集除菌滤液，加入1-5倍量的无菌丙酮或乙醇溶液，收集沉淀，真空干燥后得到无菌透明质酸钠精制干粉(A)；(2)取1～10％透明质酸钠精制干粉(A)，溶于90％～99％生理平衡液(B)，调节其PH值为7.0-7.4，充分搅拌配制成1～10mg/ml浓度的透明质酸钠凝胶，静止脱泡，1-10℃冷藏备用；(3)加入微量促神经生长细胞生长因子(C)和促神经生长的细胞(D)制备成用于神经桥接的导管填充材料。
全文摘要
本发明公开一种用于神经桥接的导管填充材料及其制备方法。该材料是由过滤法提纯的高纯度透明质酸钠与生理平衡液按一定比例配制而成凝胶状导管填充材料，生物相容性好，亲/疏水平衡性可调，在人体可吸收降解，无毒无害，价格低廉，适用于作为神经桥接的导管填充材料，在凝胶中加入促神经修复与再生的细胞或因子即可营造出有利的微环境，能有效避免神经桥接后导管塌陷的副作用。在作为加入导管中的各种促神经修复与再生物质的载体时还能发挥生物控释或细胞外基质载体的作用。
文档编号A61L31/00GK1872354SQ20061006643
公开日2006年12月6日 申请日期2006年3月31日 优先权日2006年3月31日
发明者王伟, 范明, 徐艳, 孙亮, 刘淑红 申请人:锦州医学院附属第一医院, 王伟