笼目海带褐藻聚糖硫酸酯复方免疫增强剂的制作方法

本发明涉及一种免疫增强剂，尤其是一种可显著提高免疫力的笼目海带褐藻聚糖硫酸酯复方免疫增强剂。

背景技术：

褐藻聚糖硫酸酯（fucoidan）是一种水溶性结合有硫酸基团的活性杂多糖，主要成分为岩藻糖和硫酸基。褐藻聚糖硫酸酯具有广泛的生理和生物活性，研究表明，不同的提取方法、不同的藻类中提取的褐藻聚糖硫酸酯，其组成成分和结构等存在较大差异。褐藻聚糖硫酸酯的生物活性不但取决于其组成成分、结构、硫酸基团的含量及其位置，还取决于可能与多糖链接的多酚含量。笼目海带（kjellmaniellacrassifoliamiyabe）为褐藻优势种质资源，它在系统分类上属于海带目（laminariales），海带科（laminariaceae），kjellmaniella属，是近几年研究团队培育栽培的优质褐藻。笼目海带一方面富含褐藻聚糖硫酸酯，另一方面因低温的生长环境使其富含以u-fucoidan为主的优质褐藻聚糖硫酸酯，具有抗肿瘤、降血脂、保肝护肝等多种生物活性。

黄芪多糖和党参多糖分别是以黄芪和党参为原料，经提取、浓缩、纯化而成的水溶性杂多糖，可作为免疫促进剂或调节剂。

尽管笼目海带褐藻聚糖硫酸酯、黄芪多糖和党参多糖均具有提高免疫力的作用，但迄今为止并没有将三者合理复配以显著提高免疫力的相关报道。

技术实现要素：

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可显著提高免疫力的笼目海带褐藻聚糖硫酸酯复方免疫增强剂。

本发明的技术解决方案是：一种笼目海带褐藻聚糖硫酸酯复方免疫增强剂，其特征在于由笼目海带褐藻聚糖硫酸酯、黄芪多糖和党参多糖按质量比为1：2：1混合而成；

所述笼目海带褐藻聚糖硫酸酯依次按照如下步骤制备：以清洗后的笼目海带为原料，向原料中加入复合酶，在ph4.0～ph5.5和温度40～60℃条件下酶解40~70分钟，所述复合酶添加量为原料质量的0.70～0.90%，然后在96～100℃水浴加热3～4小时，降至室温，离心得上清液a，所述复合酶由纤维素酶、果胶酶和蛋白酶按质量比为5：5～6：0.3～0.5混合而成；在上清液a中加入乙醇至乙醇质量浓度为20%产生沉淀，离心得上清液b；在上清液b中加入乙醇至乙醇质量浓度为60%产生沉淀，离心得沉淀；将沉淀溶于水中，加入乙醇至乙醇质量浓度为30%产生沉淀，离心去沉淀得上清液c；在上清液c中继续添加乙醇至乙醇质量浓度为70%产生沉淀，离心得沉淀；冷冻干燥沉淀得白色粉末；

所述黄芪多糖和党参多糖按如下方法提取：称取60目黄芪粉末或党参粉末5.00g，加8倍体积去离子水，100℃水浴加热90min；4500r/min离心，保留滤液，重复三次；合并滤液，真空旋蒸浓缩至20ml；加入三倍体积质量浓度95%乙醇，4℃过夜醇沉，4500r/min离心保留沉淀，真空冷冻干燥，分别得到黄芪多糖或党参多糖。

本发明是将笼目海带褐藻聚糖硫酸酯、黄芪多糖和党参多糖进行合理复配，可显著提高机体免疫力。

附图说明

图1是本发明实施例与对照组碳廓清指数示意图。

图2是本发明实施例与对照组血清溶血素hc50的影响示意图。

具体实施方式

实施例1：

本发明的笼目海带褐藻聚糖硫酸酯复方免疫增强剂，是由笼目海带褐藻聚糖硫酸酯、黄芪多糖和党参多糖按质量比为1：2：1混合而成；

所述笼目海带褐藻聚糖硫酸酯依次按照如下步骤制备：以清洗后的笼目海带为原料，向原料中加入复合酶，在ph5.5和温度60℃条件下酶解40分钟，所述复合酶添加量为原料质量的0.90%，然后在100℃水浴加热3小时，降至室温，离心得上清液a，所述复合酶是取5.0g纤维素酶，5.0g果胶酶和0.3g蛋白酶混合配制而成，纤维素酶、果胶酶和蛋白酶的酶活分别为80,000u/g、80,000u/g和1,000,000u/g；在上清液a中加入乙醇至乙醇质量浓度为20%产生沉淀，离心得上清液b；在上清液b中加入乙醇至乙醇质量浓度为60%产生沉淀，离心得沉淀；将沉淀溶于水中，加入乙醇至乙醇质量浓度为30%产生沉淀，离心去沉淀得上清液c；在上清液c中继续添加乙醇至乙醇质量浓度为70%产生沉淀，离心得沉淀；冷冻干燥沉淀得白色粉末；

所述黄芪多糖和党参多糖按如下方法提取：称取60目黄芪粉末或党参粉末5.00g，加8倍体积去离子水，100℃水浴加热90min；4500r/min离心，保留滤液，重复三次；合并滤液，真空旋蒸浓缩至20ml；加入三倍体积质量浓度95%乙醇，4℃过夜醇沉，4500r/min离心保留沉淀，真空冷冻干燥，分别得到黄芪多糖或党参多糖。

实施例2：

本发明的笼目海带褐藻聚糖硫酸酯复方免疫增强剂，是由笼目海带褐藻聚糖硫酸酯、黄芪多糖和党参多糖按质量比为1：2：1混合而成；

所述笼目海带褐藻聚糖硫酸酯依次按照如下步骤制备：以清洗后的笼目海带为原料，向原料中加入复合酶，在ph4.0和温度40℃条件下酶解70分钟，所述复合酶添加量为原料质量的0.70%，然后在96℃水浴加热4小时，降至室温，离心得上清液a，所述复合酶是取5.0g纤维素酶，6.0g果胶酶和0.5g蛋白酶混合配制而成，纤维素酶、果胶酶和蛋白酶的酶活分别为80,000u/g、80,000u/g和1,000,000u/g；在上清液a中加入乙醇至乙醇质量浓度为20%产生沉淀，离心得上清液b；在上清液b中加入乙醇至乙醇质量浓度为60%产生沉淀，离心得沉淀；将沉淀溶于水中，加入乙醇至乙醇质量浓度为30%产生沉淀，离心去沉淀得上清液c；在上清液c中继续添加乙醇至乙醇质量浓度为70%产生沉淀，离心得沉淀；冷冻干燥沉淀得白色粉末；

所述黄芪多糖和党参多糖按如下方法提取：称取60目黄芪粉末或党参粉末5.00g，加8倍体积去离子水，100℃水浴加热90min；4500r/min离心，保留滤液，重复三次；合并滤液，真空旋蒸浓缩至20ml；加入三倍体积质量浓度95%乙醇，4℃过夜醇沉，4500r/min离心保留沉淀，真空冷冻干燥，分别得到黄芪多糖或党参多糖。

实施例3：

本发明的笼目海带褐藻聚糖硫酸酯复方免疫增强剂，是由笼目海带褐藻聚糖硫酸酯、黄芪多糖和党参多糖按质量比为1：2：1混合而成；

所述笼目海带褐藻聚糖硫酸酯依次按照如下步骤制备：以清洗后的笼目海带为原料，向原料中加入复合酶，在ph5.0和温度50℃条件下酶解50分钟，所述复合酶添加量为原料质量的0.80%，然后在98℃水浴加热3.5小时，降至室温，离心得上清液a，所述复合酶是取5.0g纤维素酶，5.5g果胶酶和0.4g蛋白酶混合配制而成，纤维素酶、果胶酶和蛋白酶的酶活分别为80,000u/g、80,000u/g和1,000,000u/g；在上清液a中加入乙醇至乙醇质量浓度为20%产生沉淀，离心得上清液b；在上清液b中加入乙醇至乙醇质量浓度为60%产生沉淀，离心得沉淀；将沉淀溶于水中，加入乙醇至乙醇质量浓度为30%产生沉淀，离心去沉淀得上清液c；在上清液c中继续添加乙醇至乙醇质量浓度为70%产生沉淀，离心得沉淀；冷冻干燥沉淀得白色粉末；

所述黄芪多糖和党参多糖按如下方法提取：称取60目黄芪粉末或党参粉末5.00g，加8倍体积去离子水，100℃水浴加热90min；4500r/min离心，保留滤液，重复三次；合并滤液，真空旋蒸浓缩至20ml；加入三倍体积质量浓度95%乙醇，4℃过夜醇沉，4500r/min离心保留沉淀，真空冷冻干燥，分别得到黄芪多糖或党参多糖。

对实施例1、实施例2、实施例3所得笼目海带褐藻聚糖硫酸酯、黄芪多糖和党参多糖进行分析，笼目海带褐藻聚糖硫酸酯的纯度为80.0%以上，总糖质量为50.0～65.0%，硫酸根质量21.0～35.0%，黄芪多糖纯度和党参多糖纯度分别为78.00%和80.00%以上。

实验：

实验动物分组及给药如表1所示。

表1实验动物分组及给药

阳性组（positive）：黄芪颗粒（ag）；中药组（acm）：按照本发明实施例3的方法制备的黄芪多糖及党参多糖按照质量比为2：1混合而成；褐藻聚糖硫酸酯（kf）：按照本发明实施例3的方法制备的笼目海带褐藻聚糖硫酸酯；复方低剂量组（kca-l）、复方中剂量组（kca-m）及复方高剂量组（kca-h）均为本发明实施例3所得笼目海带褐藻聚糖硫酸酯复方免疫增强剂。

1.本发明实施例3笼目海带褐藻聚糖硫酸酯复方免疫增强剂对balb/c小鼠血清免疫因子分泌影响

按照现有技术的方法，对实验组balb/c小鼠进行血清免疫因子分泌实验，

实验结果如表2。

表2对balb/c小鼠血清免疫因子分泌影响（n=8）

所有数据均以平均值±标准差表示，采用单因素方差（anova）分析，duncan法组间多重比较，*p<0.05，**p<0.01。

表2结果表明，positive组、acm组、kf组对小鼠体内il-10分泌水平无显著影响，但本发明实施例3组（kca）均能显著增加血清中il-10含量。同时，实验对gm-csf、tnf-α也进行了研究，结果表明除positive组外，其余各组都能显著增加小鼠体内gm-csf分泌水平，除空白对照组（control）外，所有药物干预组均能增加小鼠体内tnf-α分泌，但positive组、acm组、kf组与本发明实施例3组（kca）在分泌水平上有差异。

结论：本发明实施例3组（kca）可增加balb/c小鼠体内gm-csf、tnf-α、il-10分泌水平，通过激活核因子-κ（nf-κb）和促分裂原激活蛋白激酶（mapks）途径改善机体免疫活动；本发明实施例3组（kca）能够促进机体非特异性免疫，同时kca对小鼠的吞噬指数α、血清溶血素hc50表现出显著性差异，能够调整机体的特异性细胞免疫及体液免疫。

2．本发明实施例3笼目海带褐藻聚糖硫酸酯复方免疫增强剂对碳廓清指数的影响

单核巨噬细胞的吞噬能力是反映动物非特异性免疫功能的重要指标，早期研究发现在一定范围内小鼠血液中碳颗粒清除速率与碳浓度呈指数函数关系。按照现有技术的方法，对实验1中所列7组balb/c小鼠进行碳廓清指数实验，结果如图1所示。

图1中所有数据均以平均值±标准差表示，采用单因素方差（anova）分析，duncan法进行组间多重比较，*p<0.05，**p<0.01。

由图1结果可知，positive组、kca剂量组（kca-l、kca-m、kca-h）balb/c小鼠的吞噬指数α相较于空白对照组（control）均显著增加，分别为4.67、4.73、5.77、5.23；而acm组、kf组小鼠吞噬指数α相较于空白对照组（control）组无显著性差异。

结论：正常balb/c小鼠的碳廓清指数能被本发明实施例3笼目海带褐藻聚糖硫酸酯复方免疫增强剂显著改善，证明本发明实施例的笼目海带褐藻聚糖硫酸酯复方免疫增强剂能够促进机体非特异性免疫。

3.本发明实施例3笼目海带褐藻聚糖硫酸酯复方免疫增强剂对血清溶血素hc50的影响

血清溶血素hc50直接反映了小鼠特异性b细胞体液免疫水平，按照现有技术的方法，对实验1中所列7组balb/c小鼠进行血清溶血素hc50的影响实验，结果如图2所示。

图2中所有数据均以平均值±标准差表示，采用单因素方差（anova）分析，duncan法进行组间多重比较，*p<0.05，**p<0.01。

图2中各实验组hc50值相较于空白对照组（control）均显著增加。其中positive组、acm组、kf组分别增加8.37%、5.66%、7.51%，而kca各剂量组hc50值显著的增加。

结论：本发明实施例3笼目海带褐藻聚糖硫酸酯复方免疫增强剂对小鼠血清溶血素hc50表现出显著性差异，表明本发明实施例笼目海带褐藻聚糖硫酸酯复方免疫增强剂能够调整机体的特异性细胞免疫及体液免疫。