基于LCAT蛋白硫氢化修饰促进小鼠HDL合成的应用的制作方法

本发明属于生物科学技术领域，具体涉及一种基于lcat蛋白硫氢化修饰促进小鼠hdl合成的应用。

背景技术：

高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein,hdl)具有特定的生理或病理功能，具有抗氧化、抗炎、保护血管内皮和抗血栓作用。临床实验中多种升高hdl药物均未显著减少心血管事件的发生，近年来学界普遍认为将hdl控制在合理范围内，提高hdl功能和活性，成熟的hdl对心血管疾病的意义更大。

hdl的包装成熟过程较复杂：hdl主要由肝脏和小肠合成分泌，新生hdl呈圆盘装，主要含apoa1和磷脂，为hdl的前体形式，hdl前体结合外周细胞泌出的胆固醇，在血浆中经过卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶lcat(lecithincholesterolacyltransferase)酯化，lcat将卵磷脂中的酰基转移至游离胆固醇上，生成胆固醇酯和溶血卵磷脂，疏水的胆固醇酯逐渐向hdl内核转移，最终形成球型成熟hdl。lcat是hdl成熟和代谢过程中起关键作用的酶，催化hdl卵磷脂的第2位酰基向游离胆固醇的第3位羟基转移，使胆固醇酯化，进一步使hdl经过前β1-hdl、hdl3阶段形成成熟的hdl2。冠心病患者lcat浓度较正常对照组降低，与血浆甘油三酯、总胆固醇、apob100/apoaⅰ比值呈负相关，与hdl和apoaⅰ水平呈正相关。因为apoa-i是lcat的主要激活剂，lcat结合载脂蛋白apoaⅰ并被激活，将游离胆固醇的酯化并将胆固醇酯聚集在hdl内核的重要步骤。动脉粥样硬化患者体内apoaⅰ水平降低，lcat功能受到影响，反应性降低，hdl颗粒变小，成熟障碍。所以，若能通过实验增高lcat的活性，hdl包装成熟加速，血浆中hdl对血脂紊乱引起的动脉粥样硬化起保护作用。

硫化氢(hydrogensulfide，h2s)是继co和no之后的第三种气体信号分子。近年来的研究发现h2s能减缓动脉粥样硬化等疾病的发生，在体内胱硫醚β-合成酶(cytathiohineβ-synthase,cbs),胱硫醚γ-裂解酶(cytathiohineγ-lyase,cse)及3-硫基丙酮酸硫基转移酶(3-mercaptopyruvatesulfurtransferase,3-mst)可利用半胱氨酸或者同型半胱氨酸生成h2s。

动物实验方面，mani等发现，cbs^-/-小鼠和wildtype小鼠在致动脉粥样硬化饮食喂养12周后，cbs^-/-组血浆总胆固醇水平较之前升高两倍，而野生型小鼠无明显变化。yang等证实糖尿病大鼠腹腔注射h2s供体nahs30μm/(kg·d)6周后，血浆hdl升高，空腹血糖、总胆固醇、ldl、血压都显著降低；另用nahs60μm/(kg·d)腹腔注射后血浆总胆固醇和血压仍明显降低；观察腹腔注射nahs30μm/(kg·d)6周的wistar对照组大鼠，血浆hdl含量明显增加而tg含量显著降低。

提示h2s在胆固醇代谢，尤其是hdl代谢过程中起重要作用，外源性给予h2s可以升高大鼠血浆hdl含量，并且降低总胆固醇水平。内源性h2s水平与血脂紊乱和高血压呈负相关，apoe^-/-小鼠paigen饮食和wildtype小鼠western饮食，给予h2s供体nahs后血浆hdl都增高。

临床研究方面，陆续有学者也证实了脂代谢紊乱或高血压病人血中h2s水平较正常人低。2012年jainsk观察到正常人血中hdl和血中内源性h2s水平成正比，而甘油三酯和ldl则与h2s水平成反比。kojuri等证实用含大蒜素的临床药物治疗高脂血症患者后，患者体内h2s水平明显升高，血浆总胆固醇和ldl水平与对照组相比明显降低，hdl水平也明显升高，血浆甘油三酯含量略有降低。说明不论在生理状态还是脂代谢紊乱患者中h2s和胆固醇代谢存在密切联系，缓解脂质代谢紊乱。

h2s可使蛋白质发生硫氢化修饰，h2s在体内半衰期只有几十秒，在体内除少量以气体形式经肺排出体外，大多数在线粒体内被氧化生成硫酸盐或硫代硫酸盐经肾脏排出，其余则参与体内蛋白修饰或其他生物化学过程。硫氢化修饰是指蛋白质特定位点的半胱氨酸-sh基团变为-ssh基团，经修饰后的蛋白活性可发生改变。硫氢化修饰的基本条件是蛋白质含有半胱氨酸，体内有多少种蛋白质可以发生硫氢化修饰目前尚不明确。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于lcat蛋白硫氢化修饰促进小鼠hdl合成的应用，为治疗高血脂和动脉粥样硬化的疾病提供了应用。

本发明的第一个技术方案：基于lcat蛋白硫氢化修饰促进小鼠hdl合成在制备治疗血脂紊乱引起的动脉粥样硬化药物中的应用。

本发明的特征还在于，

lcat蛋白硫氢化修饰的供体为：nahs或gyy4137。

lcat蛋白硫氢化修饰的供体nahs注射剂量为80μmol/kg；gyy4137注射剂量为100μmol/kg。

硫氢化修饰能减少动脉粥样硬化斑块。

硫氢化修饰能升高动脉粥样硬化体内的血浆高密度脂蛋白胆固醇含量。

硫氢化修饰促进lcat蛋白活性增强。

本发明的另一个技术方案：

基于lcat蛋白硫氢化修饰促进小鼠hdl合成在制备治疗高血脂药物中的应用。

本发明的有益效果是：本发明证实了在高脂饮食小鼠模型上给予h2s供体，可升高血浆hdl水平，并发现此过程的关键环节是lcat蛋白发生硫氢化修饰；此发明可为胆固醇逆向转运，血脂紊乱提供基础研究支持，并为血脂异常引起的动脉粥样硬化等疾病提供药物研发和治疗的新靶点。

附图说明

图1是本发明各组apoe^-/-小鼠动脉粥样硬化斑块面积图；

图2是本发明各组apoe^-/-小鼠血浆高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)含量柱状图；

图3是本发明各组apoe^-/-小鼠血浆总胆固醇(tc)含量柱状图；

图4是本发明各组c57bl/6小鼠血浆高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)含量柱状图；

图5是本发明各组c57bl/6小鼠血浆甘油三酯(tg)含量柱状图；

图6是本发明各组c57bl/6小鼠肝脏lcatmrna表达柱状图；

图7是本发明各组c57bl/6小鼠肝脏lcat发生硫氢化修饰的改良生物素转换实验图；

图8是本发明各组c57bl/6小鼠lcat活性的柱状图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

一、动物样本采集

6-8周龄雄性apoe^-/-和c57bl/6小鼠(体重约20g)，由北京大学实验医学部实验动物中心提供，均为清洁级健康动物，自由进食和饮水。本发明实验过程完全按照北京大学医学部实验动物管理条例和伦理委员会的相关规定进行。

二、样本处理方法，制作样本模型

(1)将c57bl/6小鼠western饮食(0.25％胆固醇)连续16周；

(2)将apoe^-/-小鼠paigen饮食(1.25％胆固醇)连续12周，小鼠自由进食和饮水。

将western饮食c57bl/6小鼠分为以下四组：正常饮食对照组、高胆固醇饮食腹腔注射生理盐水组、高胆固醇饮食腹腔注射nahs组、高胆固醇饮食腹腔注射gyy4137组。

将paigen饮食apoe^-/-小鼠分为以下三组：高胆固醇饮食腹腔注射生理盐水组、高胆固醇饮食腹腔注射nahs组、高胆固醇饮食腹腔注射gyy4137组。

饲养上述两批小鼠高脂饲喂12周后，取血浆和肝脏用于实验。

三、实验方案

实验1：油红o染色实验

具体配液方案如下：

1)油红o储存液(0.5％)：称取500mg油红o粉末，溶于80ml异丙醇中，于水浴中加热并缓慢搅拌使之充分溶解，溶解后定容至体积100ml；随后装入棕色瓶中，置于阴凉避光处；

2)油红o工作液：油红o储存液与蒸馏水按照体积比3:2混合，充分混匀后过滤。一般为现配现用；

3)封片剂：体积分数为90％甘油+体积分数为10％蒸馏水。

具体实验操作步骤：1)取肝脏左叶用4％多聚甲醛固定10min；2)水化3次，每次3min；3)60％异丙醇浸泡5min；4)油红o工作液染色30min；5)体积分数为60％的异丙醇脱色，水洗3次，洗去多余油红o染液；6)苏木素染色液染色5-10min；7)流水冲洗多余染液，蒸馏水返蓝至细胞核为蓝色；8)封片剂封片，并置于阴凉处阴干。

实验2：血浆高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)测定

使用中生北控生物科技股份有限公司试剂盒，采用磷钨酸-镁沉淀法。具体操作步骤：

1)工作液配制：取一定量r2溶于r1(含酶)中，溶解后制成工作液；

2)上清液制备：将血清与沉淀剂按体积1:1混合，室温放置10min，3000g离心15min，取上清液做胆固醇测定；

3)取25μl上清液或者标准品加入1ml工作液混匀，在温度37℃下反应6min；

4)反应结束后吸取200μl反应液加入96孔板中，将96孔板放入酶标仪中，在520nm波长处读取od值。

实验3：血浆总胆固醇(tc)测定

使用北京普利莱基因技术有限公司试剂盒，采用chod-pap方法测定胆固醇的含量。具体操作步骤：

1)将试剂盒中的r1(含显色剂)和r2(含酶)按体积4:1比例混匀，制成反应液；

2)称取50mg小鼠肝脏，每1mg肝脏加30μl组织裂解液，冰上高速匀浆1min，将肝脏组织裂解液在70℃水浴加热10min，转移至ep管中，室温条件下，2000g离心10min，静止后弃沉淀，取上清置于新ep管中；

3)在96孔板中先加入190μl反应液，再加入10μl标准品或者血浆样品、肝脏裂解液，充分混匀；

4)在温度37℃下反应20min，将96孔板放入酶标仪中，在570nm波长处读取od值。

5)胆固醇酯的含量＝总胆固醇含量-游离胆固醇含量。

6)如果样品浓度超过标准品最大浓度，应将样品按比例稀释后重新测量。

实验4、生物素转换实验

part1.lcat体外硫氢化修饰

(1)hepg2细胞进行lcat硫氢化修饰：hepg2细胞用hen溶液(加入100μm去铁头胺)裂解，采用bca法蛋白定量，将细胞裂解液蛋白浓度调整为1mg/ml，取上述4份300μl细胞裂解液，分为四组，分别为：对照组、nahs组、dtt组、nahs+dtt组。其中分组中所采用的nahs浓度为100μm；dtt浓度为1mm；dtt、nahs与细胞裂解液充分混匀，在37℃孵育30min。

(2)向上述hepg2细胞裂解液中加入4倍体积的blocking溶液，在50℃水浴锅中孵育20min，每5min震荡一次；

(3)加入10倍体积预冷的丙酮，将上样置于-20℃静置20min，沉淀蛋白并去除blocking溶液中的mmts；

(4)随后在4℃，5000g条件下离心10min，弃上清；

(5)加入5ml冷丙酮洗涤蛋白沉淀，在4℃，5000g条件下离心10min，弃上清，然后室温晾干丙酮；

(6)用hens溶液重悬蛋白：取适量蛋白裂解液与等体积2×上样缓冲液混匀，95℃煮3次，每次5min，此部分蛋白裂解液作为input。将剩余蛋白与1/3体积4mmbiotin-hpdp室温孵育3h；

(7)洗涤生物素标记的dynabeads磁珠：取适量磁珠放入1.5mlep管中，将ep管放置在磁珠分离器上，磁珠将吸附在管壁，弃缓冲液，加入hens溶液洗涤3次；

(8)最后加入适量hens溶液制成磁珠悬液：然后在蛋白裂解液中加入20μl磁珠悬液室温孵育4h；

(9)孵育结束后，用1mlhens溶液洗涤磁珠2次、pbs洗涤磁珠2次。加入上样缓冲液制成样品，用sds-page胶电泳。westernblotting检测硫氢化修饰的目的蛋白。

part2.蛋白免疫印迹

(1)电泳：将上样品接通电源，电压强度浓缩胶为4-5v/cm，分离胶为6-7v/cm；

(2)转膜：在电转槽中加入电转液，同时将硝酸纤维素膜和滤纸放入电转液中完全浸湿；将胶卸下，只保留目的片段胶，将胶在电转液中浸泡，按顺序铺好滤纸、胶和膜；将用滤纸和膜夹好的胶平铺于海绵上，封紧后放入电转槽，膜朝向正极，在250ma电转2h；

(3)封闭：将膜从电转槽中取出，使用tbst洗掉膜上残留的电转液，先用丽春红染色观察蛋白条带，再用去离子水和tbst将丽春红洗脱后再浸没于封闭液中，室温缓慢摇动1小时；

(4)孵育一抗：将处理的膜从封闭液中取出，用滤纸吸干液体，放入孵育袋内，加入用封闭液稀释的一抗工作液，室温下轻摇孵育1h或在4℃孵育8-16h，一抗孵育结束后，在摇床上用tbst洗膜3次，每次10分钟；

(5)根据一抗种属选择适当的hrp偶联二抗，用封闭液按比例稀释，室温孵育1h；二抗孵育结束后，在摇床上用tbst洗膜3次，每次10分钟，准备发光；

(6)发光：将膜使用去离子水漂洗，用滤纸吸干水分，正面朝下覆于发光液上，孵育1-5分钟后置于保鲜膜内固定于片盒中，曝光、显影、定影，清水冲净晾干，标定marker，进行分析或扫描。

实验5、lcat活性检测

试剂盒组分：substratereagent0.1ml、readreagent30ml、lcatassaybuffer20ml。

操作步骤：在4ul血清中加0.5ul底物试剂(substratereagent)和95.5ul的lcat检测缓冲液(lcatassaybuffer)，加200ulreadreagent，用枪混匀，共300ul，移200ul反应混合物从聚丙烯板变成黑色荧光微板，将样品放入荧光酶标仪读数，λex＝340/λem＝390或470nm，

计算λex＝340时，当λem＝390和λem＝470nm时的比值。

三、实验结果分析

针对apoe^-/-小鼠的分组进行实验1，实验结果分析：

处死小鼠后迅速剖开胸腔和腹腔，pbs缓冲液心脏灌流清洗残留血液，沿脊柱剥离整条主动脉和心脏，4％多聚甲醛中固定4h用于油红o染色；对各组小鼠主动脉进行形态学分析，分离各组小鼠主动脉作enface油红o染色，如图1所示，nahs组(高胆固醇饮食腹腔注射nahs组)和gyy4137组(高胆固醇饮食腹腔注射gyy4137组)与ns组(高胆固醇饮食腹腔注射生理盐水组)比较，小鼠的主动脉斑块面积均明显减小，说明外源性的h2s对动脉粥样硬化斑块的有减少的作用。

针对apoe^-/-小鼠的分组进行实验2和实验3，实验结果分析：

如图2所示，动脉粥样硬化(apoe^-/-)小鼠模型给予h2s供体后，nahs组(高胆固醇饮食腹腔注射nahs组)和gyy4137组(高胆固醇饮食腹腔注射gyy4137组)的血浆高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)含量，与ns组(高胆固醇饮食腹腔注射生理盐水组)比较相对升高；

如图3所示，动脉粥样硬化小鼠(apoe^-/-)模型给予h2s供体后，nahs组(高胆固醇饮食腹腔注射nahs组)相较于ns组(高胆固醇饮食腹腔注射生理盐水组)，总胆固醇(tc)下降、和gyy4137组(高胆固醇饮食腹腔注射gyy4137组)总胆固醇(tc)与ns组(高胆固醇饮食腹腔注射生理盐水组)无明显变化。

针对高脂饮食c57bl/6小鼠的分组进行实验2和实验3，实验结果分析：

由上可知，wildtypec57bl/6小鼠分四组：正常饮食对照组(normalchow组)、高胆固醇饮食腹腔注射生理盐水组(hfd组)、高胆固醇饮食腹腔注射nahs组(hfd+nahs组)、高胆固醇饮食腹腔注射(hfd+gyy4137组)。

如图4所示，高胆固醇饮食腹腔注射生理盐水组(hfd组)的c57bl/6小鼠的血浆高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)相对降低，而给予h2s供体的高胆固醇饮食腹腔注射nahs组(hfd+nahs组)、高胆固醇饮食腹腔注射(hfd+gyy4137组)小鼠hdl-c明显高于小鼠的血浆高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)组。

如图5所示，给予h2s供体的高胆固醇饮食腹腔注射nahs组(hfd+nahs组)和高胆固醇饮食腹腔注射(hfd+gyy4137组)相对于高胆固醇饮食腹腔注射生理盐水组(hfd组)的c57bl/6小鼠的血浆甘油三酯(tg)相对降低；

由以上实验可知，给予h2s供体能有效缓解apoe^-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块面积，并且apoe^-/-小鼠和c57bl/6小鼠给予nahs组血浆hdl-c浓度增高。

针对高脂饮食c57bl/6小鼠的分组进行实验4和实验5，实验结果分析：

如图6所示，取材c57bl/6小鼠各组的肝脏，提取rna，qrt-pcr检测lcatmrna水平，给予h2s供体高胆固醇饮食腹腔注射nahs组(hfd+nahs组)、和高胆固醇饮食腹腔注射组(hfd+gyy4137组)的mrna水平明显增高。

如图7所示，取材c57bl/6小鼠肝脏，进行硫氢化修饰检测，给予nahs后lcat发生明显硫氢化修饰，给予dtt可以打断二硫键，即可去除硫氢化修饰，该实验证实h2s确实可以修饰lcat。

如图8所示，取c57bl/6小鼠血浆测量lcat活性，高脂饮食c57bl/6小鼠给予h2s供体后小鼠血浆lcat活性增强。

本发明证实了在高脂饮食小鼠模型上给予h2s供体，可升高血浆hdl水平，并发现此过程的关键环节是lcat蛋白发生硫氢化修饰；此发明可为胆固醇逆向转运，纠正血脂紊乱提供基础研究支持，并为血脂异常引起的动脉粥样硬化等疾病提供药物研发和治疗的新靶点。