一种CXCR4修饰的蛇床子素长循环脂质体、制备方法以及其应用与流程

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种cxcr4修饰蛇床子素长循环脂质体、制备方法以及应用。

背景技术：

阿尔茨海默病（alzheimer’disease，ad）是一种进行性发展的中枢神经系统退行性疾病，主要临床表现为逐渐发生的记忆力衰退、学习和保存新知识能力的下降，伴随着思维、行为精神障碍等。ad的病理特征包括β-淀粉样蛋白（aβ）异常沉积、tau蛋白过度磷酸化形成的神经元纤维缠结、神经元丢失、氧化应激及神经炎症等。在过去的几十年中，上市的治疗药物只能缓解症状，并不能从根本上延缓ad的发病进程。

蛇床子素（7-methoxy-8-isopentenoxycoumarin，c15h16o3，osthole，ost）是从伞形科植物独活中提取分离出来的香豆素类脂溶性化合物。药代动力学实验证实其可以透过血脑屏障，并分布于全身各个组织器官；并且发明人实验室前期实验结果已经发现ost在阿尔茨海默病及脑损伤体内外模型中均具有较好的神经保护作用，但是ost存在水溶性及稳定性差、生物利用度低等缺点，制约了其疗效的发挥。脂质体（liposomes）是一种可以和细胞膜融合，将药物送进细胞内部，延长药物在体内的作用时间，增加体内血药浓度，从而提高药物疗效的新型纳米级载药体系。利用脂质体载药系统是改善蛇床子素溶解性、稳定性及生物利用度的有效途径之一，且目前国内外没有应用脂质体包载蛇床子素治疗ad的相关实验研究和报道。

越来越多的学者认为神经炎症是ad的重要病理性特征之一，是由aβ沉积引发的继发性反应，aβ沉积会激活神经胶质细胞并释放细胞因子及趋化因子（chemmokines）。趋化因子是一种低分子蛋白质家族，广泛地表达于中枢神经系统，在神经炎症区域大量表达，能够吸引白细胞向感染部位迁移，是神经炎症效应的重要介质。ad患者脑内病灶区域表达大量的趋化因子sdf-1/cxcr4、mcp-1/ccr2、mip-1α/ccr5、il-8/cxcr1、ip-10/cxcr3等，其中趋化因子基质细胞衍生因子1（stromalcell-derivedfactor-1，sdf-1）首先在淋巴组织和骨髓中被发现，对其特异性受体基质细胞衍生因子受体4（cxcchemokinereceptor4，cxcr4）介导的造血干细胞或淋巴细胞的归巢起至关重要的作用。sdf-1/cxcr4具有改善神经系统退行性疾病小鼠认知功能，减少细胞凋亡和颅内炎症并诱导脑髓鞘再生的作用。有研究表明，cxcr4能够驱动骨髓间充质干细胞、造血干细胞向ad小鼠病灶区域迁移的作用，且ad患者脑内高表达的sdf-1是其唯一的配体，cxcr4具有成为脑靶向分子的潜质。由于普通脂质体稳定性不理想，靶向性不高，目前国内外没有应用脂质体包载靶向载体修饰蛇床子素治疗ad的相关实验研究和报道，因此，寻求新的ad治疗药物及靶点已经成为全世界医学专家亟待解决的问题。

技术实现要素：

鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种cxcr4修饰蛇床子素长循环脂质体、制备方法以及cxcr4修饰蛇床子素长循环脂质体在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。本发明将crcr4重组蛋白修饰于蛇床子素脂质体（ost-lips）表面，利用cxcr4与其特异性配体sdf-1靶向结合的作用，将药物从血液转运至脑部病灶区域，实现靶向药物递释。采用薄膜分散法构建ost-lips与cxcr4修饰蛇床子素脂质体（cxcr4-ost-lips），对其理化性质进行表征并评价其脑靶向作用。本发明提供的cxcr4修饰蛇床子素长循环脂质体利用阿尔兹海默病脑内微环境响应的聚合物组装载体包裹抗阿尔兹海默病药物在体内循环过程中保持稳定，到达阿尔兹海默病脑内后，高效的释放负载药物，提高脑组织和细胞内的药物浓度，从而提高疗效。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案。

一种cxcr4修饰蛇床子素长循环脂质体，所述的cxcr4修饰蛇床子素长循环脂质体是以基质细胞衍生因子受体4基因重组蛋白为靶向载体。

一种cxcr4修饰蛇床子素长循环脂质体，所述的cxcr4修饰蛇床子素长循环脂质体的制备原料按重量计由cxcr4重组蛋白1.5-2.5mg、dspe-peg20003-4mg、dspe-peg2000-mal1-2mg、磷脂22-25mg、胆固醇4-5mg、蛇床子素1-1.4mg组成。

进一步地，所述的cxcr4修饰蛇床子素长循环脂质体的制备原料按重量计由cxcr4重组蛋白2mg、dspe-peg20003.5mg、dspe-peg2000-mal1.5mg、磷脂25mg、胆固醇5mg、蛇床子素1.4mg组成。

一种cxcr4修饰蛇床子素长循环脂质体的制备方法，具体包括下述步骤：

步骤一、精密称取cxcr4重组蛋白溶解于ph=8的磷酸缓冲液中，制成5mg/ml的cxcr4蛋白溶液；精密称取dspe-peg2000-mal溶解于ph=6.5磷酸缓冲液中，制成3.6mg/ml的磷脂溶液；将cxcr4重组蛋白与traut’s试剂按摩尔比1：10比例进行反应1h，将反应后的溶液置于截留分子量3kd的透析袋中除去traut’s试剂。将硫醇化的cxcr4蛋白与dspe-peg2000-mal按摩尔比1：10比例进行反应得到cxcr4-dspe-peg2000。

步骤二、采用薄膜分散法制备ost-lips：按摩尔比100:40:3.8:17.3精密称量磷脂、胆固醇、dspe-peg2000与ost放在同一个圆底烧瓶中，加入5ml甲醇，40khz超声溶解5min，用旋转蒸发器40℃减压去除溶剂，圆底烧瓶底部形成一层均匀的脂质膜，加入5mlph为8.2的tris碱缓冲液水化脂质膜，并于超声粉碎机中300w超声10min使脂质膜完全溶解，然后将得到的脂质膜水化液于超声波细胞粉碎机200w继续破乳10min，然后将脂质体溶液通过0.22μm聚碳酸酯膜挤压3次，即得ost-lips。

步骤三、将步骤二制得的ost-lips与步骤一制得的cxcr4-dspe-peg2000按摩尔比658：1的比例室温孵育2h，即得cxcr4-ost-lips。

一种cxcr4修饰蛇床子素长循环脂质体在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。

与现有技术比，本发明的有益效果如下。

1）本发明提供的cxcr4修饰蛇床子素长循环脂质体利用阿尔兹海默病脑内微环境响应的聚合物组装载体包裹抗阿尔兹海默病药物在体内循环过程中保持稳定，到达阿尔兹海默病脑内后，高效的释放负载药物，提高脑组织和细胞内的药物浓度，从而提高疗效。

2）本发明制备的cxcr4-ost-lips的包封率及连接率分别为94.12±1.8%和77.94±4.8%，增加了ad细胞对药物的摄取并提高了药物在体内的循环时间及脑靶向性。

3）本发明制备的cxcr4-ost-lips的药物释放率为72.93%，且不存在突释现象和药物降解现象，表明脂质体的双分子膜能大大延缓蛇床子素的释放速率，具有缓释作用，不仅可以避免药物直接释放造成的毒性，还可以防止脂质体在血液循环过程中药物的泄露，有利于增加脂质体在脑部的蓄积。

4）本发明公开的cxcr4修饰蛇床子素长循环脂质体制备方法操作简单，所得cxcr4-ost-lips提高细胞摄取，增强脑靶向作用，因此易于推广，可用于制备治疗阿尔茨海默病的药物，具有广阔的临床应用前景和明显的社会经济价值。

附图说明

图1是cxcr4-ost-lips的透射电子显微镜示意图。

图2是cxcr4-ost-lips的体外释放统计图，^*p<0.05，^**p<0.01。

图3是cxcr4-ost-lips的原子力显微镜示意图。

图4是图3的三维结构。

图5是sh-sy5y转染后的荧光图片。

图6是质粒载体信息。

图7是通过rt-pcr及westernblot检测app-sh-sy5y细胞中appmrna和aβ1-42蛋白的表达。

图8是荧光显微镜定性观察app-sh-sy5y细胞对药物的摄取。

图9是流式细胞仪分析app-sh-sy5y细胞对药物的摄取。

图10是定量分析各组细胞的荧光强度，a.blankcontrol，b.epirubicinliposomes，c.cxcr4modifiedepirubicinliposomes；^**p<0.01vs.blankcontrol；^##p<0.01vs.epirubicinliposomes。

图11是ad小鼠体内成像图。

图12是不同时间点脑组织内ost含量的定量分析图，^*p<0.05vs.ost；^#p<0.05vs.ost-lips。

图13是各组小鼠单次水迷宫定位航行实验典型图示。

图14是各组小鼠逃避潜伏期。

图15是各组小鼠穿越平台次数的比较。

图16是各组小鼠在原平台所在象限停留时间百分比；^**p<0.01vs.sham；^#p<0.05，^##p<0.01vs.model；^{^}p<0.05，^{^^}p<0.01vs.freeost；^&p<0.05vs.ost-lips。

图17-19是各组小鼠脑内炎症因子水平的分析图，^**p<0.01vs.sham；^#p<0.05，^##p<0.01vs.model；^{^}p<0.05，^{^^}p<0.01vs.freeost；^&p<0.05vs.ost-lips。

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例一cxcr4修饰蛇床子素长循环脂质体的建立方法和理化性质检测。

1．材料与方法。

1.1材料与仪器。

卵磷脂（epc）、胆固醇（chol）购于美国avantipolarlipses公司；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（dspe-peg2000）和磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺（dspe-peg2000-mal）购于日本nof公司；蛇床子素购于成都普菲德公司；cxcr4重组蛋白购于英国biorbyt公司；traut’s试剂购于北京嘉美妞诺公司；表阿霉素购于大连美仑公司；甲醇为色谱纯，水为双重蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

十万分之一精密电子天平（北京赛多利斯公司）；jy92-iin超声波细胞粉碎机（宁波新芝公司）；圣叶st-2000旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；zetasizernano-90激光粒度仪（英国马尔文仪器公司）；lc-2010aht高效液相色谱（日本岛津公司）；jem-1200ex透射电子显微镜（日本jeol公司）；原子力显微镜（美国asylum公司）。

1.2方法。

1.2.1ost-lips的制备。

采用薄膜分散法制备ost-lips。按摩尔比100:40:3.8:17.3精密称量磷脂、胆固醇、dspe-peg2000与ost放在同一个圆底烧瓶中，加入5ml甲醇，40khz超声溶解5min，用旋转蒸发器在40℃减压去除溶剂，圆底烧瓶底部形成一层均匀的脂质膜，加入5mlph为8.2的tris碱缓冲液水化脂质膜，并置于超声粉碎机中300w超声10min使脂质膜完全溶解，然后将得到的脂质膜水化液于超声波细胞粉碎机（200w）继续破乳10min，然后将脂质体溶液通过0.22μm聚碳酸酯膜挤压3次，即得ost-lips。

1.2.2cxcr4-ost-lips的制备。

精密称取cxcr4蛋白10.00mg溶解于2ml磷酸缓冲液（ph=8）制成5mg/ml的cxcr4蛋白溶液。精密称取9.00mg的dspe-peg2000-mal溶解于2.5ml磷酸缓冲液（ph=6.5）中，制成3.6mg/ml的磷脂溶液，将cxcr4蛋白与traut’s试剂按摩尔比1：10比例进行反应1h，将反应后的溶液置于截留分子量3kd的透析袋中除去traut’s试剂。将硫醇化的cxcr4蛋白与dspe-peg2000-mal按摩尔比1：10比例进行反应得到cxcr4-dspe-peg。将1.2.1项下制得的ost-lips与cxcr4-dspe-peg按摩尔比658：1的比例室温孵育2h，即得cxcr4-ost-lips。用bca蛋白检测试剂盒测定cxcr4-ost-lips中cxcr4的连接率。

1.2.3脂质体包封率的测定。

将用上述方法制得的脂质体取一半过0.22μm微孔滤膜，取过完微孔滤膜的脂质体0.5ml于离心管中，高速离心机10000，离心5min，取上清液0.2ml，加入1.8ml甲醇破乳。再取过膜前的蛇床子素脂质体0.2ml，加1.8ml甲醇破乳。色谱系统采用岛津lc-2010aht型高效液相色谱，色谱柱为agilenttc-c18（4.6mm×250mm，5μm），流动相：甲醇：水=80:20，液相色谱条件：检测波长322nm，流速为1ml/min，每次进样量20μl，柱温25℃。包封率=过膜离心后脂质体中蛇床子素的含量/过膜前脂质体中蛇床子素的含量100%。

1.2.4脂质体理化性质。

1.2.4.1粒径和zeta电位测定。

取200μl脂质体，加蒸馏水稀释至2ml。使用malvern激光粒度仪，以动态光散射法测定不同脂质体的粒径、多分散系数和zeta电位。每种制剂测3次，每次设定循环测10次。

1.2.4.2透射电子显微镜观察脂质体形态。

透射电镜观察cxcr4-ost-lips形态。取适量脂质体稀释至合适浓度，滴一滴在电镜专用铜网上，用2%磷钨酸染色，晾干后采用透射电镜观察其形态。其中透射电镜加速电压设为120kv。

1.2.4.3原子力显微镜观察脂质体形态。

取适量cxcr4-ost-lips稀释至合适浓度，滴在新鲜剥离的云母片上，自然干燥后采用原子力显微镜观察脂质体形态，所有样品测定均选用轻敲模式。

1.2.4.4脂质体体外释放考察。

采用透析法考察脂质体体外释放。分别取1mlost、ost-lips、cxcr4-ost-lips于截留分子量为8000-14000da的透析袋中，置于20ml的pbs（含10%fbs）溶液中。将释放体系放入摇床中，于设定的时间点（6，12，24，48，72h）取样0.5ml，同时补充0.5ml新的pbs。每种制剂重复3次。采用hplc测定各取出样品中ost的浓度，并计算每种制剂在各时间点的累积释放量。

1.2.3统计学处理。

结果以均值±标准差表示，采用spss18.0软件完成统计处理，各组间比较采用t检验。

2.结果。

ost-lips及cxcr4-ost-lips的粒径、多分散指数（pdi）、zeta电位、包封率及靶头连接率如表1所示。ost-lips和cxcr4-ost-lips的平均粒径分别为81.76±2.52nm和93.22±2.02nm，且具有小窄的pdi（约0.2），说明分散性良好；zeta电位-10.5±0.33、-10.2±0.5mv，且包封率均大于90%，说明制备重现性良好。tem和afm图像如图1和图3-图4所示，cxcr4-ost-lips几乎呈球形。体外释放实验结果表明，游离ost在前12h就已经释放了85%左右，ost-lips和cxcr4-ost-lips的释放速率明显慢于游离ost；ost-lips和cxcr4-ost-lips均呈现稳定缓慢的释放状态，在pbs（ph7.4）中透析72小时后，游离ost、ost-lips和cxcr4-ost-lips的药物释放率分别为89.62%，71.14%和72.93%，且不存在突释现象和药物降解现象，表明脂质体的双分子膜能大大延缓蛇床子素的释放速率，具有缓释作用，可以避免药物直接释放造成的毒性，如图2所示。

3.结论。

采用薄膜分散法制备的cxcr4-ost-lips，具有良好的理化性质：平均粒径约100nm，多分散指数窄，zeta电位相对稳定，对cxcr4-ost-lips的包封率均较高（90%以上）。选用透析袋法模拟体内释放环境，发现脂质体在ph7.4的条件下，cxcr4-ost-lips的药物释放率为72.93%，且不存在突释现象和药物降解现象。cxcr4-ost-lips呈现稳定缓慢的释放状态，这种缓慢的释放特点，可以防止脂质体在血液循环过程中药物的泄露，有利于增加脂质体在脑部的蓄积。

实施例二app595/596-sh-sy5y细胞对cxcr4修饰蛇床子素长循环脂质体的摄取。

1.材料与方法。

1.1材料与仪器。

app595/596及辅助质粒由天津医科大学闫亚平教授馈赠；人神经母细胞瘤细胞系sh-sy5y购于中国科学院上海细胞库；dmem/f-12培养基、胎牛血清（fbs）及青霉素/链霉素（p/s）购于gibco公司；其他试剂为分析纯。

ti-s荧光倒置显微镜（日本nikon公司）；bectondickinsonfacscalibur流式细胞仪（美国bectondickinson公司）；infinitef50酶标仪（瑞士tecan公司）；蛋白水平电泳仪（美国bio-rad公司）；mg96grt-pcr仪（杭州朗基公司）。

1.2方法。

1.2.1sh-sy5y细胞与293t细胞的培养。

sh-sy5y细胞与293t细胞分别常规培养于dmem/f12与高糖dmem完全培养基（10%fbs、1%p/s）中，于37℃、5%的co2培养箱中培养，3d换1次液，待细胞达到80%~90%融合度时进行传代，选取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2慢病毒包装转染sh-sy5y细胞建立ad的细胞模型。

将app595/596质粒转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，并接种在ampr抗性平板上，16h后挑取阳性克隆，置于lb液体培养基中37℃振荡培养18h，采用无内毒素质粒小提试剂盒进行提取质粒，再将app595/596质粒/gfp质粒与慢病毒系统plp1、plp2、plp/vsv-g以15μg：6.5μg：2.5μg：3.5μg比例用lipofectamine2000介导转染293t包装细胞，对照组转染gfp。培养293t细胞，24h后荧光显微镜下观察细胞都呈现绿色荧光。分别收集转染后72h的上述293t细胞培养液上清(含病毒)，3000r/min离心20min去除细胞碎片，0.22μm滤膜过滤除菌，100kd超滤管5000r/min离心1h得到浓缩液并检测病毒滴度，用浓缩的病毒上清转染sh-sy5y细胞，转染72h后用westernblot检测app蛋白的表达量。

1.2.3细胞摄取和靶向效应。

1.2.3.1荧光显微镜观察app-sy5y细胞对药物的摄取。

为了评价细胞对脂质体的摄取情况，将epi包封于脂质体中代替ost。将app-sh-sy5y细胞以1×10⁵细胞的密度接种于24孔板中培养过夜使细胞贴壁。分别向各孔中加入用培养液稀释的epi-lips及cxcr4-epi-lips，并使各组的epi终浓度保持一致，均为20μm，且每个样品设置3个复孔。37℃条件下，孵育2h。弃去上清，pbs洗3遍。用4%的多聚甲醛固定15min，每孔加入200μldapi染细胞核5min。用pbs洗3次后，每孔加入200μl的pbs，荧光显微镜观察各组细胞对epi的摄取情况。

1.2.3.2流式细胞仪观察app-sy5y细胞对药物的摄取。

在6孔培养板中以2×10⁵细胞/孔的密度接种app-sh-sy5y细胞，在37°c下培养24h，然后加入含有epi-lips及cxcr4-epi-lips的培养液，并使各组的epi终浓度保持一致，均为20μm，且每个样品设置3个复孔。37℃条件下，孵育2h。弃去上清，pbs洗3遍。每孔加入200μl胰酶消化细胞，待细胞变圆加入1ml培养液终止消化，每管中加入500μlpbs复悬细胞。采用流式细胞仪对细胞内epi的荧光强度进行定量分析。

1.2.4统计学处理。

所有数据以均数±标准差表示，应用spss18.0软件进行单因素方差分析，两组之间比较采用t检验，以p<0.05为具有显著性差异。

2.结果。

2.1app-sh-sy5y细胞模型鉴定。

app595/596目标质粒在构建时含有gfp荧光基因，质粒结构图如6所示，将构建的app595/596质粒转染至293t细胞，并收集病毒液，浓缩后用于转染sh-sy5y细胞。在转染24h后，置于荧光显微镜下可观察到绿色荧光如图5所示，随后筛选稳定过表达app595/596质粒的sh-sy5y细胞株，加入含有嘌呤霉素完全培养培养基sh-sy5y细胞，当细胞生长不受嘌呤霉素培养基影响，收集细胞，重新接种在96孔板中，观察由单一细胞克隆成的细胞团，并进行扩增培养。然后，在光镜下和荧光镜下观察sh-sy5y细胞，并利用rt-pcr和westernblot法分别检测sh-sy5y细胞中appmrna和蛋白表达水平，以空载体（gfp组）作为对照组比较，结果如图7所示，app595/596-sh-sy5y细胞中appmrna和aβ1-42蛋白水平明显升高，说明体外成功构建ad细胞模型。

2.2app-sh-sy5y对药物的摄取。

采用荧光显微镜观察app-sh-sy5y细胞对不同脂质体的摄取情况，结果如图8所示。孵育2h后，cxcr4-epi-lips组的荧光强度大于epi-lips组，说明脂质体经cxcr4修饰后，app-sh-sy5y细胞对药物的摄取增加。同时，为了定量分析app-sh-sy5y细胞对不同脂质体的摄取，采用流式细胞仪进行测定细胞对药物的摄取，结果如图9和10所示，cxcr4-epi-lips的摄取量明显大于epi-lips，差异具有统计学意义（p<0.05），进一步说明脂质体表面修饰cxcr4后可增加app-sh-sy5y细胞对药物的摄取。

3.结论。

利用app595/596质粒转染sh-sy5y细胞可稳定构建ad细胞模型。荧光显微镜和流式细胞仪结果显示，cxcr4的修饰能够增加app-sh-sy5y细胞对药物的摄取，初步证明了cxcr4对ad细胞模型具有一定的靶向作用，但仍需体内实验进一步验证。

实施例三cxcr4修饰蛇床子素长循环脂质体对ad动物模型的脑靶向及治疗作用。

1.材料与方法。

1.1材料与仪器。

昆明种小鼠（辽宁长生生物公司，动物许可证号：scxk（辽）2013-0001）；aβ1-42多肽（北京博奥森公司）；aβ1-42多肽（北京博奥森公司）；il-1β、il-6、tnf-αelisa试剂盒（美国r&d公司）；超氧化物歧化酶（sod）、丙二醛（mda）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），dir荧光染料（南京凯基公司）；其余为分析纯。

mr-96a酶标仪（深圳迈瑞生物医疗公司）；dw-86l386超低温冰箱（青岛海尔电器公司）；morris水迷宫仪、脑立体定位仪（成都仪器厂）。

1.2方法。

1.2.1aβ侧脑室注射ad小鼠模型的建立。

取小鼠称重，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉。麻醉后，将小鼠固定在脑立体定位仪上，用无菌手术刀沿颅骨中线做约1.5cm切口，找到囟门，将微量进样器垂直悬针于囟门上，用针尖定位，记录位置，以此位置为起始位置，依照《小鼠脑立体定位图谱》，向后0.5mm，向右1.0mm距离移动微量进样器，此点为侧脑室在颅骨表面的投影位置，悬针于颅骨表面，垂直刺入，深度为3.00mm，将3μl已经聚化的aβ1-42于1min内缓慢注入侧脑室内，留针5min用于药物弥散，随后提针，在创口处涂抹青霉素钠粉，将小鼠从脑立体定位上取下，缝合伤口，依次涂抹75%乙醇、碘伏、火棉胶，并在腿部肌肉注射0.2ml10万/ml的青霉素钠注射液，手术结束后放入鼠笼饲养，假手术组侧脑室内注入3μl生理盐水。于手术后第10天morris水迷宫法检测ad动物模型的学习记忆能力明显降低，说明ad模型制备成功，可用于后续实验。

1.2.2小鼠活体成像。

将造模成功的ad模型鼠选取12只随机分为4组，每组3只，采用活体成像实验考察不同制剂的体内靶向性。将ost替换为荧光试剂dir，分别制备dir脂质体（dir-lips）和cxcr4修饰的dir靶向脂质体（cxcr4-dir-lips），各组分别通过尾静脉注射：1）生理盐水（blankcontrol）；2）游离dir；3）dir-lips；4）cxcr4-dir-lips。保证各给药组的dir剂量相同，均为2μg/只。异氟烷麻醉小鼠，使用活体成像系统对各组小鼠体内的荧光信号进行监测，并于给药后的1，3，6，12，24h对小鼠进行荧光成像。

1.2.3小鼠脑组织中蛇床子素浓度测定。

将36只昆明种小鼠，随机分成4组。分别为①游离ost；②ost-lips；③cxcr4-ost-lips。实验前禁食12h，可自由饮水。每组小鼠分别给予20mg/kg的ost，经尾静脉一次性给药，分别于给药后0.5、2、4、6、12和24h，处死每组小鼠并取出脑组织，用pbs洗涤以洗去附着在器官上的血液并称重。制备脑组织匀浆液，使用hplc确定脑组织中药物的浓度^[25]。

1.2.4ad模型小鼠分组及给药。

将模型制备成功的小鼠随机分为假手术组组（sham）、模型组（model）、蛇床子素游离药组（ost）、蛇床子素脂质体组组（ost-lips）及cxcr4修饰蛇床子素脂质体组（cxcr4-ost-lips），按20mg/kg剂量，每日腹腔注射1次，连续6周，sham及model组小鼠给予等体积生理盐水。

1.2.5morris水迷宫实验。

morris水迷宫用于评估小鼠的学习和记忆能力。该装置由一个圆形池（直径120cm，高60cm）和黑色内壁组成，黑色内壁细分为四个相等的象限，并用水（25℃）填充至30厘米的深度。将逃逸平台（直径10cm）放置在其中一个象限内并浸没在水面下约1cm处。连续5d分别从四个象限中观察小鼠的逃避潜伏期。如果小鼠在60s内无法到达平台，则将它们引导至平台并停留10s。训练5d后，移除平台并进行空间探索实验试，将各组小鼠从同一入水点放入水中，观察其穿越原平台的次数以及在原平台所在象限停留的时间。

1.2.6ad脑内相关炎症因子、抗氧化指标的检测。

治疗6周后处死小鼠，每只小鼠各取一半脑组织，称重、匀浆、离心后取上清液，按试剂盒操作说明书进行以下检测：1）相关炎症介质il-1β、il-6、tnf-α含量测定；2）脑组织内超氧化物歧化酶(sod)活性、丙二醛（mda）含量测定。

1.2统计学处理。

所有数据以均数±标准差表示，应用spss18.0软件进行单因素方差分析，两组之间比较采用t检验，以p<0.05为具有显著性差异。

2.结果。

2.1小鼠活体成像。

为了研究脂质体进入ad小鼠体内的分布情况，分别对ad小鼠尾静脉注射游离dir、dir-lips、cvcr4-dir-lips及生理盐水，并选用活体成像仪于不同时间点观察ad小鼠体内的荧光强度及分布。结果如图11所示，游离dir组荧光主要分布在肝脏和脾脏，而脂质体组荧光分布于全身各处。随着时间的延长，各组荧光强度逐渐减弱，12h时游离dir组荧光消失，而脂质体组依然能观察到荧光，可能是由于加入了亲水性长循环材料，降低了网状内皮系统的清除速率，延长了其在体内的循环时间。cxcr4-dir-lips组与dir-lips组相比，各时间点脑内的荧光强度均增加，24h时cxcr4-dir-lips组脑组织内仍能检测到较强的荧光信号，而dir-lips组脑内荧光信号已经消失，说明脂质体经cxcr4修饰后，可以增加其对脑的靶向性，提高药物在脑内的累积。

2.2脑组织分布。

小鼠尾静脉注射游离ost、ost-lips或cxcr4-ost-lips后不同时间点脑组织中ost的含量。结果如图12所示，给药0.5h后，游离ost组含量明显高于ost-lips组，但在4h时，游离ost组脑组织中ost含量迅速下降，24h时已检测不到ost，可能是药物已经被代谢。且4，6，12和24host-lips组脑中ost含量高于游离ost组，差异具有统计学意义（p<0.05）。在2h时，cxcr4-ost-lips组脑组织中的ost含量明显高于ost-lips组，差异具有统计学意义（p<0.05），且这种趋势一直维持至24h。进一步说明了cxcr4修饰后增加了ost-lips对脑组织的靶向性，能有效提高药物在脑内的积聚。

2.3cxcr4-ost-lips改善ad小鼠的学习和记忆能力。

水迷宫结果如图13-16所示，各组小鼠经历5天的定位航行训练后，与sham组小鼠相比，model组小鼠的逃避潜伏期显著延长（p<0.01）；cxcr4-ost-lips、ost-lips及ost组的逃避潜伏期相比mode组明显缩短，差异具有统计学意义（p<0.01）。且ost组小鼠与cxcr4-ost-lips、ost-lips组相比，差异有统计学意义（p<0.05）。在定位航行实验结束后，撤去平台进行空间探索实验来检测ad小鼠的记忆能力。结果显示，在60s内model组小鼠穿越平台次数与原平台所在象限时间百分比明显低于sham组，差异具有统计学意义（p<0.05），实验结果表明aβ侧脑室注射造模成功。经过cxcr4-ost-lips、ost-lips及ost治疗后小鼠的穿越平台次数与原平台所在象限时间百分比相比model组明显延长，差异有统计学意义（p<0.01），ost组与cxcr4-ost-lips、ost-lips组相比，差异具有显著性意义（p<0.05），cxcr4-ost-lips与ost-lips组相比，差异具有显著性意义（p<0.05），实验结果表明cxcr4修饰后可以增强ost改善ad小鼠的学习及记忆的能力。

2.4cxcr4-ost-lips降低ad小鼠脑内炎性细胞因子的水平。

elisa结果如图17-19显示，model组与sham组相比，il-1β、il-6、tnf-α含量明显升高且具有显著性差异（p<0.01），各组给药组与model组相比，均能降低il-1β、il-6、tnf-α的含量，差异具有显著性意义（p<0.05，p<0.01），对于il-1β、il-6、tnf-α的影响，cxcr4-ost-lips组、ost-lips组与freeost组相比，差异具有显著性意义（p<0.05，p<0.01），且对于il-6和tnf-α的影响，cxcr4-ost-lips组对其抑制作用明显好于ost-lips组，差异具有显著性意义（p<0.05）。说明cxcr4修饰后可以增强ost对ad小鼠脑内炎症因子的抑制作用。

2.5cxcr4-ost-lips提高ad小鼠抗氧化能力，减轻脑内自由基损伤。

氧化应激和自由基损伤是导致ad脑内神经细胞损伤的重要原因。sod是体内重要的自由基清除剂，对机体的氧化与抗氧化平衡起着重要作用。本实验结果如表2所示，model组小鼠脑内sod活性下降，清除自由基能力下降，致使脑组织过氧化产物mda升高，与sham组比较，差异具有显著性意义（p<0.01，）；cxcr4-ost-lips治疗后显著提高了sod活力，降低了mda含量（p<0.01，p<0.05，与model组比较），从而减轻了脑组织脂质过氧化损伤，保护并改善了神经功能，作用明显强于ost-lips及freeost组（p<0.05）。

^**p<0.01vs.sham组；^#p<0.05，^##p<0.01vs.model组；^{^}p<0.05，^{^^}p<0.01vs.freeost组；^&p<0.05vs.ost-lips组。

3.结论。

1）由于加入了亲水性长循环材料，使脂质体制剂在血液中循环的时间明显长于游离药物，并且cxcr4修饰，提高了药物对ad模型小鼠的脑靶向作用。

2）cxcr4-ost-lips组ad小鼠脑内ost质量浓度和停留时间显著增加及延长，进一步说明cxcr4修饰于ost-lips表面后明显增强其脑靶向能力。

3）与游离ost相比，ost-lips可以增强药物对ad小鼠学习记忆能力的改善能力；经cxcr4修饰后，脂质体提高学习记忆能力的效果进一步增强。

4）cxcr4-ost-lips能降低ad小鼠脑内炎性细胞因子il-1β、il-6和tnf-α的水平，从而抑制免疫炎性损伤，保护神经组织，此作用强于ost-lips及游离ost。ost-lips能提高ad小鼠脑内sod活性，增强抗氧化能力，减轻脑组织脂质过氧化损伤，降低其产物mda含量，从而保护神经组织，此作用强于游离ost，且经过cxcr4修饰后，其作用进一步增强。

5）cxcr4-ost-lips增强其脑靶向作用及治疗效果分析其有以下两个原因：a.dspe-peg2000长循环亲水材料的加入，使其避免了网状内皮系统的快速摄取，延长了其在血液中的循环时间；b.由于ad小鼠脑内微环境sdf-1的高度表达，脂质体表面修饰cxcr4能够携带着载药脂质体向脑组织病变区域迁移，从而增加了其在脑组织内的积累。