一种抗HPV与HSV的中药微生态复方制剂及其制备方法与流程

一种抗hpv与hsv的中药微生态复方制剂及其制备方法
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种抗hpv与hsv的中药微生态复方制剂及制备方法。


背景技术：

2.健康女性阴道内存在以乳杆菌等优势菌为主的微生物菌群，健康的微生物菌群能够维持阴道的酸性环境，增强局部免疫屏障功能，抵御致病菌的侵袭，并减少女性阴道感染的风险。人类乳头瘤状病毒(hpv)是一种乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒a属，可导致女性宫颈癌的病毒，严重影响女性的身心健康和生殖结局。阴道菌群失调与高危型人乳头瘤状病毒(hr-hpv)感染之间存在相关性，hr-hpv感染者阴道菌群中乳酸杆菌属显著减少。在细菌性阴道病患者中，乳酸杆菌比例降低、其他细菌比例的增高可破坏阴道内微环境，从而增加hpv的易感性，表明hpv易感与阴道菌群失调有关。在年轻女性中，hpv感染非常普遍，多可自然缓解，hpv感染患者中有足够的免疫防御机制对抗病毒，仅少数妇女发展为持续性感染，并可发展为宫颈上皮内瘤样病变(cin)。hpv感染可激发细胞免疫和体液免疫，机体的免疫反应决定人乳头状瘤病毒感染的转归，有效的细胞免疫可清除已存在的感染，而体液免疫可阻止同一亚型的病毒再感染细胞，免疫细胞、细胞因子及某些病毒蛋白与病毒的免疫逃逸及持续性感染有关。此外，hpv相关的阴道粘膜免疫紊乱也与hpv感染有关，其中包含了相关免疫细胞的功能紊乱及数量减少，因此，hpv易感及转归由免疫能力决定。单纯疱疹病毒(hsv)是最早发现的人类疱疹病毒，也是所有人类病毒性疾病中最常见的病毒，包括hsv-1和hsv-2两种血清型。由hsv-2引发的生殖器疱疹引起了人们广泛的关注，并且一些新奇病例的出现暗示着疱疹的发病率逐渐升高，严重影响了人类公共卫生健康。
3.hpv、hsv二者作为常见的生殖道感染性疾病，彼此之间相互关联。据报道，宫颈癌患者的hsv-2、hpv感染率均明显高于健康者，宫颈癌患者的高危型hpv感染率明显高于健康者，宫颈癌患者hpv合并hsv-2的感染率均明显高于健康者，且高危型hpv感染与hsv-2感染之间均呈明显的正相关性。由此可见，宫颈癌与hsv-2、hpv生殖道感染间有紧密的相关性。hpv是最主要的1种生殖道感染病毒，hsv-2也较为常见，临床上应高度重视。
4.目前针对hpv、hsv感染的治疗策略以未病先防、既病防变为思路。在过去的20年里，针对hpv、hsv的疫苗研发虽然各国学者付出了巨大的努力，然而效果并不明显。现在临床上治疗hsv-2感染的药物通常是阿昔洛韦(acyclovir，acv)及它的核苷酸类似派生物，但由于其抗病毒谱窄，易产生耐药性且价格昂贵给人们的精神和经济上带来巨大的负担。中药具有提高机体免疫力及调节菌群的作用，能减少物理治疗及手术的创伤，具有广阔的前景。现有产品抗hpv、hsv作用机制单一，抗hpv、hsv效果有限，不能满足临床需求。我们的专利产品为中药微生态复方制剂，抗hpv、hsv能力强，功能多样，主要通过调节肠道、阴道菌群，抑制hpv、hsv复制，增强机体整体及局部免疫力等多机制抗hpv与hsv。


技术实现要素：

5.基于上述背景技术中的问题，本发明提供一种调节肠道与阴道菌群、增强免疫力，能同时抗hpv与hsv的中药微生态复方制剂及制备方法。
6.一种抗hpv与hsv的中药微生态复方制剂，它是由一种或一种以上中药多糖与一种或一种以上益生菌发酵上清液或发酵上清液的浓缩物组成；
7.一种抗hpv与hsv的中药微生态复方制剂，其中所述中药多糖为一种或一种以上中药黄精、党参、茯苓、金银花、夏枯草、板蓝根、灵芝、牛膝、黄芪的提取物；
8.一种抗hpv与hsv的中药微生态复方制剂，其中所述益生菌为鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和唾液乳杆菌中的一种或几种；
9.一种抗hpv与hsv的中药微生态复方制剂，其特征在于所述的发酵上清液是采用离心或过滤等方式获得，或将发酵上清液再采用低温减压浓缩、喷雾或冻干方式获得发酵上清液的浓缩物。
10.一种抗hpv与hsv的中药微生态复方制剂，其特征在于所述的中药多糖按以下步骤制得：
11.a、按黄精10～30份、党参10～30份、茯苓10～20份、金银花10～30份、夏枯草10～30份、板蓝根10～30份、灵芝10～20份、牛膝10～30、黄芪10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量8～15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；
12.b、弃去步骤a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；
13.c、将步骤b中上清进行醇沉，沉淀即为粗制中药多糖；
14.d、用灭菌纯化水洗涤步骤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42℃灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5％比例加入活性炭4℃吸附过夜，吸附后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清为精制中药多糖；或者采用葡聚糖凝胶柱等色谱方法富集精制获得精制中药多糖；
15.e、将步骤d中上清液经0.22μm滤膜过滤除菌后，进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；
16.f、将步骤e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥即得到中药多糖。
17.一种抗hpv与hsv的中药微生态复方制剂的制备方法，它包括下列步骤：
18.将益生菌培养，取出发酵液，通过离心和/或微孔薄膜除去菌体得到发酵上清液，经细菌培养验证无活菌生长，直接制成液体制剂或经真空冷冻干燥成为干粉，加入中药多糖制成制剂。
19.本发明的工作机理及有益效果为：
20.工作机理：多糖是中草药中重要的组成成分，在中草药发挥疗效的过程中起着不可或缺的作用。多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、防衰老、降血糖、降血脂等多种活性。药用植物中许多多糖如黄精多糖、党参多糖、茯苓多糖、金银花多糖、夏枯草多糖、板蓝根多糖、灵芝多糖、牛膝多糖、黄芪多糖等均具有抗hsv、增强机体免疫力的作用。例如，黄精多糖有显著的体内外抗hsv的作用，1.5％黄精多糖乳膏对豚鼠和人的生殖疤疹的疗效与acv相当，0.8％黄精多糖滴眼液治疗单纯疱疹性角膜炎的疗效优于acv，且有抗炎作用。同时，黄
精多糖乳膏治疗生殖器疤疹的药理作用较广泛，体内抗病毒活性与acv乳膏活性相当，但无西药的毒副作用，是一种有潜力的抗生殖器疱疹药物。同时，黄精多糖、茯苓多糖、黄芪多糖也具有调节肠道微生物形成良好微生态的功能，以及促进益生菌生长的功能。例如研究不同浓度的党参多糖对鼠李糖乳杆菌的影响，发现1.5％(m/v)的党参多糖对鼠李糖乳杆菌的增殖影响最大，其活菌数最大可达到2.18
×
109cfu/ml，能够使其提前2～3h达到最大产酸量，缩短发酵时间，较好地提高其耐酸、耐胆盐及耐高温的能力，其多糖的利用率可高达70.5％。鼠李糖乳杆菌和罗伊氏乳杆菌在维持阴道正常菌群平衡、预防和治疗女性阴道感染方面具有显著效果，这2种菌株均分离自健康女性体内，作为膳食补充剂长期在临床使用，未观察到任何不良反应，获得欧盟食品安全局(european food safety authority，efsa)的安全资格认定(qps)。同时，多糖也是益生菌定植与增殖的良好环境载体与营养源，多糖与益生菌并存时，当遇到合适的温度与湿度等环境，益生菌的定植与增殖速度明显加快。因此将二者结合使用，能起到调节肠道与阴道菌群、增强免疫力，抵御hpv与hsv侵袭与危害。
21.本发明具有以下有益效果：
22.(1)关注女性健康，抵御hpv及hsv侵袭与危害；
23.(2)倡导微生态护理，恢复阴道正常菌群，去除干涩疼痛；
24.(3)凸显机体免疫提升对抗hpv与微生态调正对抗hpv双保险；
25.(4)展示益生菌对抗hpv与中药多糖对抗hsv双作用；
26.(5)植物多糖配方益生菌能促进益生菌增长、快速占域、肃清杂菌，支持益生菌定植的优势。
附图说明
27.下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
28.附图1说明了本专利抗hpv与hsv的中药微生态复方制剂的配方原理。
具体实施方式
29.为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。
30.实施例1 益生菌的制备
31.(1)生产用种子制备
32.鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)的培养
33.将mrs液体培养基预热至37℃，同时按2％接种量接种鼠李糖乳杆菌种子液，37℃静置培养18～24小时，最终活菌计数应达到浓度为108～10
10
cfu/ml，收获菌液至4℃保存备用。
34.罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)的培养
35.将tpy液体培养基预热至37℃，同时按4％接种量接种罗伊氏乳杆菌种子液，37℃静置培养18～24小时，最终活菌计数应达到浓度为108～10
10
cfu/ml，收获菌液至4℃保存备用。
36.所述的mrs液体培养基为：
37.蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0ml、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18.0g、蒸馏水1000ml，ph6.2-6.4。121℃灭菌15min。
38.所述tpy液体培养基为：
39.酪蛋白10g、大豆蛋白胨5g、酵母粉2g、葡萄糖5g、l-半胱氨酸0.5g、磷酸氢二钾2g、氯化镁0.5g、硫酸锌0.25g、氯化钙0.15g、氯化铁0.001g、吐温801g、蒸馏水1l，ph 6.5，121℃灭菌20min。
40.实施例2 中药多糖的制备
41.a、取中药多糖10～30份，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量10倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；
42.b、弃去步骤a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；
43.c、将步骤b中上清进行醇沉，沉淀即为粗制中药多糖；
44.d、用灭菌纯化水洗涤步骤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42℃灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5％比例加入活性炭4℃吸附过夜，吸附后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；
45.e、将步骤d中上清液经0.22μm滤膜过滤除菌后，进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；
46.f、将步骤e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥即得到黄精多糖。
47.实施例3 冻干保护剂制备
48.每1000ml磷酸缓冲液包含以下组分：中药多糖40～70g、明胶4～6g、蔗糖50～60g，所述的中药多糖由实施例2制得。
49.制备方法：精确称取各组分，溶解于1000ml的磷酸缓冲溶液，无菌条件下经0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
50.磷酸缓冲液由氯化钠6～10g，氯化钾0.05～0.5g，磷酸氢二钠1～1.2g，磷酸二氢钾0.05～0.5g，氯化钙0.05～0.2g，含6个结晶水的氯化镁0.05～0.2g溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟得到。
51.实施例4 一种抗hpv与hsv的中药微生态复方制剂泡腾片的制备方法：
52.a、泡腾材料制备：酸性材料的制备：按质量份分别称取柠檬酸15份、乳糖10份、edta 15份、亮蓝指示剂0.5份，将上述成分充分混合，40～65℃烘干后过8～12目筛，制得酸性颗粒备用；碱性材料的制备：按质量份分别称取碳酸氢钠15份、乳糖10份、亮蓝指示剂1份，将上述成分充分混合，40～65℃烘干后过8～12目筛，制得碱性颗粒备用；将上述碱性材料与酸性材料按1∶1混合均匀，并加入0.5～1质量份的左旋咪唑，经co-60辐射灭菌制得泡腾材料。
53.b、将实施例1得到的鼠李糖乳杆菌和罗伊氏乳杆菌菌液混合均匀，并调整至160亿/ml(其中鼠李糖乳杆菌80亿/ml、罗伊氏乳杆菌80亿/ml)，得到益生菌混合菌液。
54.c、将b中益生菌混合菌液按1∶1、1∶2或1∶3(v∶v)比例加入含实施例3制得的冻干保护剂，分装后经冷冻真空干燥制成微生态制剂复合冻干粉。
55.d、泡腾片制备
56.将按上述制备的冻干制剂与a中泡腾材料按2∶1-3混合均匀后，用压片机压制成片剂，定量分装。
57.实施例5 一种抗hpv与hsv的中药微生态复方制剂凝胶制剂的制备方法：
58.a、取羧甲基纤维素钠(27g)与部分甘油加适量纯化水搅匀，使羧甲基纤维素钠充分溶胀，备用；
59.b、益生菌冻干粉的制备：将实施例1得到的鼠李糖乳杆菌菌液和罗伊氏乳杆菌菌液混合均匀，并调整至160
×
108cfu/ml(其中鼠李糖乳杆菌80
×
108cfu/ml、罗伊氏乳杆菌80
×
108cfu/ml)，得到益生菌混合菌液。液体制剂可进一步经真空冷冻干燥制备成粉剂。粉剂可在使用时加溶剂(比如水)溶解后使用。冻干时可选择加入或不加入冻干保护剂，选择加入冻干保护剂时，本领域技术人员可根据常规操作选择适宜的冻干保护剂及其用量。比如，在一个实施方式中，所述冻干保护剂为脱脂奶粉，加入量为6％(w/v)；
60.c、将实施例2中制备的中药多糖(40～70g)、步骤b中制备的益生菌冻干粉(80
×
108cfu/g)(30g)、倍他环糊精(80g)、柠檬酸钠(50g)和普鲁兰多糖(150g)，混合均匀后再加甘油(甘油共120g)分散；
61.d、与上述凝胶基质混合，加纯化水至1000g，搅拌均匀后灌装，包装即得。
62.实施例6 一种抗hpv与hsv的中药微生态复方制剂阴道栓剂的制备方法：
63.a、益生菌冻干粉的制备：将实施例1得到的鼠李糖乳杆菌菌液和罗伊氏乳杆菌菌液混合均匀，并调整至160
×
108cfu/ml(其中鼠李糖乳杆菌80
×
108cfu/ml、罗伊氏乳杆菌80
×
108cfu/ml)，得到益生菌混合菌液。液体制剂可进一步经真空冷冻干燥制备成粉剂。粉剂可在使用时加溶剂(比如水)溶解后使用。冻干时可选择加入或不加入冻干保护剂，选择加入冻干保护剂时，本领域技术人员可根据常规操作选择适宜的冻干保护剂及其用量。比如，在一个实施方式中，所述冻干保护剂为脱脂奶粉，加入量为6％(w/v)；
64.b、将实施例2中制备的中药多糖(40～70g)、步骤a中制备的益生菌冻干粉(80
×
108cfu/g)(30g)混合均匀，即得益生菌与中药多糖混合物。
65.c、以上述b中的益生菌与中药多糖混合物为主原料，加入微晶纤维素(150g)、硬脂酸镁(150g)、淀粉(150g)、葡萄糖(150g)作基质制成阴道栓剂，即得。
66.实施例7 一种抗hpv与hsv的中药微生态复方制剂口服固体制剂的制备
67.a、益生菌冻干粉的制备：将实施例1得到的鼠李糖乳杆菌和罗伊氏乳杆菌菌液混合均匀，并调整至160
×
108cfu(其中鼠李糖乳杆菌80
×
108cfu/ml、罗伊氏乳杆菌80
×
108cfu/ml)，得到益生菌混合菌液。液体制剂可进一步经真空冷冻干燥制备成粉剂。粉剂可在使用时加溶剂(比如水)溶解后使用。冻干时可选择加入或不加入冻干保护剂，选择加入冻干保护剂时，本领域技术人员可根据常规操作选择适宜的冻干保护剂及其用量。比如，在一个实施方式中，所述冻干保护剂为脱脂奶粉，加入量为6％(w/v)；
68.b、将实施例2中制备的中药多糖(40～70g)、步骤a中制备的益生菌冻干粉(80
×
108cfu/g)(30g)混合均匀，即得益生菌与中药多糖混合物；
69.c、配制生产，将混合好的益生菌与中药多糖混合物加入柠檬酸、蔗糖、糊精辅料适量，配制片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂，包装即得。
70.实施例8 一种抗hpv与hsv的中药微生态复方制剂口服液产品的制备
71.a、益生菌冻干粉的制备：将实施例1得到的鼠李糖乳杆菌和罗伊氏乳杆菌菌液混合均匀，并调整至160
×
108cfu(其中鼠李糖乳杆菌80
×
108cfu/ml、罗伊氏乳杆菌80
×
108cfu/ml)，得到益生菌混合菌液。液体制剂可进一步经真空冷冻干燥制备成粉剂。粉剂可在使用时加溶剂(比如水)溶解后使用。冻干时可选择加入或不加入冻干保护剂，选择加入冻干保护剂时，本领域技术人员可根据常规操作选择适宜的冻干保护剂及其用量。比如，在一个实施方式中，所述冻干保护剂为脱脂奶粉，加入量为6％(w/v)；
72.b、将实施例2中制备的中药多糖(40～70g)、步骤a中制备的益生菌冻干粉(80
×
108cfu/g)(30g)混合均匀，即得益生菌与中药多糖混合物；
73.c、配制生产，将混合好的益生菌与中药多糖混合物加入柠檬酸、蔗糖、糊精辅料适量，加入柠檬酸、蔗糖及不含糖的甜味剂辅料，调ph为4.5～6.5并搅拌均匀后灌装，包装即得。
74.实施例9 一种抗hpv与hsv的中药微生态复方制剂卫生巾(护垫)的制备：
75.a、益生菌冻干粉的制备：将实施例1得到的鼠李糖乳杆菌和罗伊氏乳杆菌菌液混合均匀，并调整至160
×
108cfu/ml(其中鼠李糖乳杆菌80
×
108cfu/ml、罗伊氏乳杆菌80
×
108cfu/ml)，得到益生菌混合菌液。液体制剂可进一步经真空冷冻干燥制备成粉剂。粉剂可在使用时加溶剂(比如水)溶解后使用。冻干时可选择加入适当的冻干保护剂，加入量为6％(w/v)；
76.b、将实施例2中制备的中药多糖(40～70g)、步骤a中制备的益生菌冻干粉(80
×
108cfu/g)(20g)混合均匀，即得益生菌与中药多糖混合物；
77.c、取上述b中的益生菌与与中药多糖混合物适量加入卫生巾(护垫)的肌肤接触面或者夹层中，即得。