本发明是关于(载体)疫苗的领域。本发明的病毒载体可用于产生用于在猪体内诱导抗猪流行性腹泻病毒(pedv)的免疫反应的免疫原性组合物或疫苗。
背景技术：
猪流行性腹泻病毒是在猪中引起急性腹泻、呕吐及脱水的包膜的正义单链rna病毒。在三周龄及更年轻的猪中，一旦pedv感染后24小时即可观察到临床征象(包括急性水样、腹泻、呕吐及脱水)，导致高达100％死亡率。此外，受pedv感染的动物的肠道的总体及组织学变化可导致小肠内出现严重的病理病灶。
尽管仅报导了pedv的一种血清型，但对s基因的系统发育研究显示，pedv可在遗传上分为2组：基因组1(g1；典型)及基因组2(g2；地区流行性或大流行)。每个基因组可进一步分为亚组(1a及1b；2a及2b)。g1a包括原型pedv株cv777、疫苗株及其他适应于细胞培养的毒株，而g1b包含在中国首次被鉴别到且稍后在美国、韩国及欧洲被鉴别到的新的变体。g2包含全球野外分离株，其进一步分簇为2a及2b亚组(g2a及g2b)，分别导致先前在亚洲的局部流行性疾病暴发及最近在北美及亚洲的大流行性疾病暴发。
pedv是α冠状病毒属冠状病毒亚科的成员。pedv是处理约28kb的正义单链rna基因组且具有5'帽及3'聚腺苷酸化尾的包膜病毒(pensaert及debouckp.1978)。基因组包含5'非翻译区(utr)、3'utr及至少七个编码四种结构蛋白(刺突(s)、包膜(e)、膜(m)及核衣壳(n))及三种非结构蛋白(复制酶1a及1b及orf3)的开放阅读框(orf)；该等以顺序5'-复制酶(1a/1b)-s-orf3-e-m-n-3'排列在基因组上(oldhamj.1972；及bridgen等人1993)。
pedvs蛋白是i型糖蛋白，其中(g2bpedv的)s蛋白由1,383个氨基酸(aa)构成。s蛋白基于其与其他冠状病毒的s蛋白的同源性，可分为s1(例如1-789aa)及s2(例如790-1,383aa)结构域。冠状病毒中的s蛋白是表面抗原，其中其在调节与宿主细胞受体糖蛋白的相互作用以介导病毒进入及刺激天然宿主中之中和抗体的诱导中起作用。因此，s糖蛋白是抗pedv的有效疫苗的研发的主要目标。
pedv在欧洲首次被鉴别到，但在包括韩国、中国、日本、菲律宾及泰国在内的许多亚洲国家中已经变得愈来愈成问题。自2013年以来，pedv出现在美国，且pedv感染的经济影响已经很大。因此，继续需要研发能够保护猪免于与pedv相关的疾病的疫苗。
wo2017165366(a1)阐述表达pedvs蛋白的羊口疮病毒(orfv)载体在肌内施用时在猪中诱导血清igg、iga及中和抗体反应(wo2017165366(a1)的第[0172]段)。此外，显示此载体对怀孕小母猪的肌内施用导致该等小母猪所生的仔猪的被动免疫(joshi等人archvirol.163(9):2327-2335(2018)。
然而，由于使用习用的针及注射器重复进行肌内注射可能对动物产生应力，因此期望可(例如)作为鼻喷雾经由鼻内途径施用的抗猪流行性腹泻(ped)的载体疫苗。
技术实现要素：
通过申请专利范围中表征的说明及实施例来实现对上述技术问题的解决方案。
因此，本发明在其不同方面中根据申请专利范围执行。
本发明基于以下惊人的发现：在犬瘟热病毒(cdv)病毒基因组的磷蛋白(p)基因与基质蛋白(m)之间插入编码猪流行性腹泻病毒(pedv)刺突(s)蛋白的异源核苷酸序列，可产生可用于对母猪进行鼻内免疫且由此保护由该等母猪哺育的仔猪对抗与pedv感染相关的临床征象的cdv载体。
在第一方面中，本发明因此提供包含所关注的异源核苷酸序列的犬瘟热病毒(cdv)载体，其中所关注的该异源核苷酸序列编码猪流行性腹泻病毒(pedv)抗原。
在具体方面中，本发明使用cdv的莱德利(lederle)疫苗株(以登录号vr-128保藏在atcc)作为主链(由基因库登录号dq903854.1、ay288311或ay286480代表的基因型)或与其至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的序列，例如来自由其额外传代衍生的病毒(例如犬犬瘟热病毒，莱德利无毒力，目录号nr-3845，biodefenseandemerginginfectionsresearchresourcesrepository,p.o.box4137,manassas,va20108-4137,usa)。
本发明的载体具体而言可用于哺乳动物、具体而言猪的疫苗接种。
此外，本发明涵盖用于在猪中诱导抗猪流行性腹泻病毒的免疫反应的载体。因此，在本发明的上下文中，亦提供cdv载体，其包含具有编码猪流行性腹泻病毒的刺突蛋白的异源rna序列的表达盒。
本发明进一步是关于包含该等载体的哺乳动物宿主细胞及使用该等宿主细胞生成载体疫苗的方法、以及包含本发明的cdv载体的免疫原性组合物及疫苗。
具体实施方式
本发明解决了先前技术中固有的问题，且提供最先进的明显进步。
在本发明的上下文中，向怀孕母猪鼻内施用编码猪流行性腹泻病毒(pedv)的刺突蛋白的cdv载体，其随后经由摄入抗体阳性初乳引起仔猪的被动免疫，如由在用pedv攻击后发病率或临床征象的严重程度、致死率及病毒脱落降低可见。
因此，本发明提供犬瘟热病毒载体，本文中亦称为“本发明的cdv载体”，其中该载体包含所关注的异源核苷酸序列，且其中该所关注的异源核苷酸序列编码猪流行性腹泻病毒(pedv)抗原。
如本文提及的所关注的异源核苷酸序列具体而言是所关注的异源rna序列。
优选地，该pedv抗原是选自由以下组成的群：pedv刺突(s)蛋白及pedv核蛋白(n蛋白)，其中pedv刺突蛋白尤佳。
优选地，该pedv抗原因此是pedvs蛋白，且其中该pedvs蛋白优选包含与seqidno:1或seqidno:2的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一个优选方面中，该pedvs蛋白因此包含与seqidno:1的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成。
在另一优选方面中，该pedvs蛋白因此包含与seqidno:2的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成。
作为另一优选选择，该pedv抗原是pedvs蛋白，且其中该pedvs蛋白优选包含与seqidno:16或seqidno:17的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一个优选方面中，该pedvs蛋白因此包含与seqidno:16的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成。
在另一优选方面中，该pedvs蛋白因此包含与seqidno:17的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成。
根据另一优选方面，所关注的异源核苷酸序列编码pedvs蛋白，其中该所关注的异源核苷酸序列由与seqidno:3至5中的任一者的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列组成或包含该rna序列。
因此，在一个优选方面中，该所关注的异源核苷酸序列由与seqidno:3的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列组成或包含该rna序列。
在另一优选方面中，该所关注的异源核苷酸序列因此由与seqidno:4的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列组成或包含该rna序列。
在又一优选方面中，该所关注的异源核苷酸序列因此由与seqidno:5的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列组成或包含该rna序列。
具体而言，优选地，所关注的rna序列的长度符合“六规则”，意指所关注的rna序列的核苷酸数目代表六的倍数。因此，可选地优选通过额外三联体来延长编码pedv抗原、具体而言编码终止密码子的给定核苷酸序列，使得所得所关注的核苷酸序列的核苷酸数目可被六整除。
根据本发明的尤佳方面，所关注的异源rna序列优选位于cdv的p基因与m基因之间，和/或
优选地，所关注的异源rna序列可操作地连接至位于该异源rna序列的3′方向上的基因起始(gs)序列，其中该gs序列最优选包括于cdv的h基因的外源3′非编码区中；和/或连接至cdv的基因组启动子。
因此，在一个优选方面中，该所关注的异源rna序列位于cdv的p基因与m基因之间且可操作连接至
-位于该异源rna序列的3′方向上的基因起始(gs)序列，且其中该gs序列包括于cdv的h基因的外源3′非编码区中，和/或
-cdv的基因组启动子。
在另一优选方面中，该所关注的异源rna序列可操作连接至位于该异源rna序列的3′方向上的基因起始(gs)序列和/或cdv的基因组启动子。
该gs序列优选包括于cdv的h基因的外源3′非编码区中。
具体而言，cdv载体中所关注的异源rna序列可操作连接至
-cdv的h基因的外源3′非编码区、具体而言其中包括的gs序列，其中cdv的h基因的该外源3′非编码区侧接编码pedvs蛋白的该所关注的异源rna序列的3′端，及
-cdv的基因组启动子。
优选地，本发明的cdv载体包含与seqidno:6或seqidno:7的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列。因此，本发明的cdv载体优选包含所关注的异源核苷酸序列，其中该所关注的异源核苷酸序列是与seqidno:6或seqidno:7的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列。
因此，根据一个优选方面，本发明的cdv载体包含与seqidno:6的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列。因此，根据一个优选方面，本发明的cdv载体包含所关注的异源核苷酸序列，其中该所关注的异源核苷酸序列是与seqidno:6的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列。
根据另一优选方面，本发明的cdv载体因此包含与seqidno:7的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列。因此，根据另一优选方面，本发明的cdv载体包含所关注的异源核苷酸序列，其中该所关注的异源核苷酸序列是与seqidno:7的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列。
具体而言，本发明的cdv载体包含与seqidno:8的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列。因此，本发明的cdv载体具体而言包含所关注的异源核苷酸序列，其中该所关注的异源核苷酸序列是与seqidno:8的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列。
本发明的cdv载体优选进一步包含与seqidno:9的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列，且其中此rna序列侧接与seqidno:8的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列的5′端。
本发明的cdv载体优选进一步包含与seqidno:10的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列，且其中此rna序列侧接与seqidno:8的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列的3′端。
最优选地，本发明的cdv载体包含以下或由以下组成：
-与seqidno:8的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的第一rna序列，及
-与seqidno:9的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的第二rna序列，且其中该第二rna序列侧接该第一rna序列的5′端，及
-与seqidno:10的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的第三rna序列，且其中该第三rna序列侧接该第一rna序列的3′端。
本发明进一步提供核酸分子，其编码本发明的cdv载体，其中该核酸分子优选是dna分子，且其中该dna分子在下文中亦称作“本发明的dna分子”。
具体而言，该核酸分子是经分离核酸分子。
优选地，该核酸分子包含编码pedv刺突(s)蛋白的dna序列，且其中该序列优选是与seqidno:11或seqidno:12的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的dna序列。
在一个优选方面中，该核酸分子因此包含与seqidno:11的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的dna序列。
在另一优选方面中，该核酸分子因此包含与seqidno:12的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的dna序列。
此外，本发明提供dna分子、具体而言本发明的dna分子，其中该分子包含与seqidno:13的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的dna序列。
具体而言，该分子包含与seqidno:14的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的dna序列。
本发明进一步提供哺乳动物宿主细胞，其含有
-本发明的cdv载体，或
-本发明的dna分子，
且其中该哺乳动物宿主细胞优选是经分离的哺乳动物宿主细胞。
本发明亦提供
-本发明的cdv载体，或
-本发明的dna分子
其用作药剂、优选用作疫苗。
另外，在本发明的上下文中，提供包含本发明的dna分子的dna构建体，其中该dna构建体具体而言是dna载体，例如质粒。本发明的dna分子可插入的dna载体或质粒将由时是此项技术者识别。如本文所述的dna构建体优选是经分离的dna构建体。如本文所用术语“包含dna分子”具体而言应理解为等同于术语“包含dna分子的序列”。
此外，本发明提供本文所述dna构建体的rna转录物，其中该rna转录物优选是经分离的rna转录物。
本发明亦提供经本文所述的dna构建体转染的细胞，其中该细胞优选是经分离细胞。
此外，本发明提供经本文提及的rna转录物转染的细胞，其中该细胞优选是经分离细胞。
优选地，细胞系来自真核细胞系。
在具体而言本发明的方法的具体方面中，细胞系vero细胞、st细胞或bhk-21细胞、ma104细胞、mdbk细胞、rk13细胞、mdck细胞或pk15细胞。
所有提及的细胞系皆为本领域技术人员所熟知且可公共获得。vero细胞示例性以登录号atccccl-81地保藏在美国组织培养物保藏中心(americantissueculturecollection)。st细胞示例性地以登录号crl-1746保藏在美国组织培养物保藏中心。bhk-21细胞示例性地以登录号atccccl-10保藏在美国组织培养物保藏中心。mdck细胞示例性地以登录号atccccl-34或atcccrl-2285保藏在美国组织培养物保藏中心。
最优选地，细胞或哺乳动物宿主细胞分别是vero细胞。
此外，在本发明的上下文中，提供制备含有异源基因的感染性cdv、具体而言制备本发明的cdv载体的方法，其中该方法包含以下步骤：
a.提供表达异源rna聚合酶的宿主细胞；
b.用本文所述dna构建体转染宿主细胞，且其中dna构建体中所包括的本发明的dna分子由异源rna聚合酶转染，及
c.分离由该等细胞产生的病毒。
优选地，本发明的cdv载体在vero细胞中生长。
因此，如本文提及的宿主细胞优选是vero细胞。
由于cdv具有负链rna基因组，故需要在转染的细胞中存在rna聚合酶、优选t7rna聚合酶或由cdv编码的rna聚合酶。最优选使用t7rna聚合酶。rna聚合酶在转染的细胞中的存在可(例如)通过共转染编码并表达rna聚合酶的质粒或通过用rna聚合酶蛋白穿透细胞来提供。根据本发明，就此而言，尤佳使用产生rna聚合酶的转基因细胞，例如将dna构建体转染至表达t7聚合酶的bhk-21细胞中或转染至bsr-t7/5细胞中。或者，细胞亦可用编码rna聚合酶且在转染至宿主细胞中时转译至rna聚合酶中的mrna进行转染。
根据另一方面，本发明进一步提供本发明的cdv载体或本文所述细胞的用途，其用于制造免疫原性组合物或疫苗。
在又一方面中，本发明亦提供免疫原性组合物，其在本文中亦称作“本发明的免疫原性组合物”，其中该免疫原性组合物包含
a.本发明的cdv载体，其中该载体可选地是感染性和/或减毒病毒，或其中该载体可选地是经减毒和/或经修饰的活病毒，及
b.由该载体表达的重组蛋白和/或包含多个由该载体表达的重组蛋白的四级结构，及
c.可选地医药上或兽医上可接受的载剂或赋形剂，其中优选地，该载剂适于鼻内施加。
具体而言应理解，分别如本文所用的词组“由该载体表达”或“由载体表达”具体而言分别等同于“在经载体感染的细胞中表达”或“在经该载体感染的细胞中表达”。
出于本发明的目的，“包含多个重组蛋白的四级结构”是指多个该重组蛋白的三维排列，例如由沿着该(等)蛋白质的氨基酸序列中所包括的卷曲螺旋缔合的三个pedvs蛋白构成的三聚体结构。
优选地，由载体表达的该重组蛋白是
-pedvs蛋白，或
-pedvn蛋白。
具体而言，由该载体表达的该重组蛋白是pedvs蛋白，具体而言包含与seqidno:1或seqidno:2的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成。
作为另一优选选择，由该载体表达的该重组蛋白是pedvs蛋白，具体而言包含与seqidno:16或seqidno:17的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成。
根据另一优选方面，本发明的免疫原性组合物包含以下或由以下组成：
a.本发明的cdv载体，及
b.包含与seqidno:1或seqidno:2的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成的多肽，其中该多肽优选是由该载体表达的重组蛋白，
c.及可选地医药上或兽医上可接受的载剂或赋形剂，其中该载剂优选适于鼻内施加。
优选地，该cdv载体包含编码该多肽的所关注的异源核苷酸序列，其与seqidno:1或seqidno:2的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
根据另一优选选择，本发明的免疫原性组合物包含以下或由以下组成：
a.本发明的cdv载体，及
b.包含与seqidno:16或seqidno:17的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成的多肽，其中该多肽优选是由该载体表达的重组蛋白，
c.及可选地医药上或兽医上可接受的载剂或赋形剂，其中该载剂优选适于鼻内施加。
优选地，该cdv载体包含编码该多肽的所关注的异源核苷酸序列，其与seqidno:16或seqidno:17的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
本发明亦提供疫苗或医药组合物，其在下文中亦称作“本发明的疫苗或医药组合物”，其中该疫苗或医药组合物包含
a.本发明的cdv载体，及
b.由该载体表达的重组蛋白和/或包含多个由该载体表达的重组蛋白的四级结构，及
c.医药或兽医上可接受的载剂或赋形剂，其中该载剂优选适于经口、真皮内、肌内或鼻内施加，及
d.可选地该疫苗进一步包含佐剂，
且其中由载体表达的该重组蛋白优选是pedvs蛋白或pedvn蛋白。
优选地，由本发明的疫苗或医药组合物中所包括的该载体表达的该重组蛋白是pedvs蛋白，且其中该pedvs蛋白具体而言包含与seqidno:1或seqidno:2的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成。
作为另一优选选择，由本发明的疫苗或医药组合物中所包括的该载体表达的该重组蛋白是pedvs蛋白，且其中该pedvs蛋白具体而言包含与seqidno:16或seqidno:17的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成。
本发明进一步提供用于降低与感染相关或由感染引起的一或多种临床征象的发病率或严重程度的免疫原性组合物或疫苗的制备方法，其包含以下步骤：
a.用本发明的载体感染哺乳动物宿主细胞、具体而言vero细胞，
b.在适宜条件下培养感染的细胞，
c.收集感染的细胞培养物，
d.可选地纯化步骤c)的所收集的感染的细胞培养物，
e.可选地混合该收集的感染的细胞培养物与医药上可接受的载剂，
且其中该免疫原性组合物或疫苗优选降低与感染猪流行性腹泻病毒(pedv)相关或由其引起的一或多种临床征象的严重程度。此外，本发明是关于对个体进行免疫的方法，其包含向该个体施用本发明的免疫原性组合物。
有利地，已证明本发明的免疫原性组合物安全且有效。
术语“进行免疫”是关于通过以下方式达成的主动免疫化：向欲进行免疫的个体施用免疫原性组合物，由此引起抗该免疫原性组合物中所包括的抗原的免疫学反应。
优选地，免疫使得减小畜群中特定pedv感染的发病率或降低由特定pedv感染引起或与其相关的临床征象的严重程度。
此外，使用如本文所提供的免疫原性组合物对有需要的个体进行免疫使得可预防由pedv感染的个体的感染。甚至更优选地，免疫针对pedv感染产生有效、长效的免疫学反应。应理解，该时间段将持续1个月以上、优选2个月以上、优选3个月以上、更优选4个月以上、更优选5个月以上、更优选6个月以上。应理解，免疫不能在进行免疫的所有个体中皆有效。然而，该术语需要对畜群的大部分个体进行有效免疫。
优选地，在此上下文中设计通常(亦即未进行免疫)将发生通常由pedv感染引起或与其相关的临床征象的个体畜群。本领域技术人员可确定畜群个体是否经有效免疫而无需赘言。优选地，若与未进行免疫或经在本发明之前获得的免疫原性组合物免疫但随后由特定pedv感染的个体相比，至少33％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、仍更优选至少95％且最优选100％的给定畜群个体的临床征象在发病率或严重程度方面减轻至少10％、更优选至少20％、仍更优选至少30％、甚至更优选至少40％、仍更优选至少50％、甚至更优选至少60％、仍更优选至少70％、甚至更优选至少80％、仍更优选至少90％、仍更优选至少95％且最优选100％，则免疫将有效。
此外，本发明提供治疗和/或预防有需要的个体中由pedv感染引起的临床征象的方法，该方法包含向该个体施用治疗有效量的本发明的免疫原性组合物。
有利地，已证明本发明的免疫原性组合物可减少由pedv感染引起的临床征象。
术语“治疗和/或预防”具体而言是指减小畜群中特定pedv感染的发病率或降低由特定pedv感染引起或与其相关的临床征象的严重程度。因此，术语“治疗和/或预防”亦是指与个体尚未接受如本文所提供的免疫原性组合物的个体群相比，在个体已接受有效量的该等免疫原性组合物的个体群中，减小畜群中感染特定pedv的个体数量(＝减小特定pedv感染的发病率)、或降低通常与pedv感染相关或由其引起的临床征象的严重程度、或减少经特定pedv感染后的病毒脱落、或预防或减轻经特定pedv感染后的腹泻。
“治疗和/或预防”通常涉及将有效量的本发明的免疫原性组合物施用需要此一治疗/预防或可自其获益的个体或个体畜群。术语“治疗”指在个体或畜群的至少一些个体已感染该pedv且其中该等个体已显示由该pedv感染引起或与其相关的一些临床征象后，施用有效量的免疫原性组合物。术语“预防”是指在该个体经pedv任何感染之前或至少在该个体或个体群中没有个体不显示由该pedv感染引起或与其相关的任一临床征象之前，向个体施用。术语“预防”及“防止”在本申请案中可互换使用。
优选地，与未经治疗或经在本发明之前获得的免疫原性组合物治疗但随后由特定pedv感染的个体相比，临床征象在发病率或严重程度方面减轻至少10％、更优选至少20％、仍更优选至少30％、甚至更优选至少40％、仍更优选至少50％、甚至更优选至少60％、仍更优选至少70％、甚至更优选至少80％、仍更优选至少90％、仍更优选至少95％且最优选100％。
如本文所用术语“临床征象”具体而言是指个体感染pedv的征象。该等临床征象的实例包括(但不限于)病毒负荷、腹泻、脱落、体温升高、死亡率、肠中的总体病理病灶、抑郁症、体重损失、生长速率减小及食欲降低。然而，临床征象亦包括(但不限于)可自活动物直接观察到的临床征象。可自活动物直接观察到的临床征象的实例包括体重损失、生长速率减小、食欲降低、脱水、水样腹泻、呕吐、跛、嗜睡、消瘦及羸弱及诸如此类。
优选地，与未治疗或经在本发明之前获得的免疫原性组合物治疗但随后由特定pedv感染的个体相比，经治疗个体中临床征象在发病率或严重程度方面减轻是指体重损失减小、较低病毒负荷、腹泻减轻、脱落减少、直肠温度降低、死亡率降低、肠中总体病理病灶减少或其组合。
此外，本发明提供与相同物种的非免疫对照组的个体相比减轻个体的腹泻的方法，该方法包含向该个体施用治疗有效量的本发明的免疫原性组合物。
此外，本发明提供与相同物种的非免疫对照组的个体相比降低个体的死亡率的方法，该方法包含向该个体施用治疗有效量的本发明的免疫原性组合物。
术语“降低死亡率”意指与未经治疗(或免疫)但随后由特定pedv感染的个体相比，死亡率降低至少10％、更优选至少20％、仍更优选至少30％、甚至更优选至少40％、仍更优选至少50％、甚至更优选至少60％、仍更优选至少70％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少90％、仍更优选至少95％、最优选100％。
因此，应理解，个体可经本发明的免疫原性组合物进行疫苗接种以减少或预防该个体的临床征象，例如腹泻或死亡率。优选地，该个体是仔猪、猪或母猪。
此外，本发明提供在个体中诱导产生对pedv具有特异性的抗体的方法，其中该方法包含向该个体施用本发明的免疫原性组合物。优选地，该个体是仔猪、猪或母猪。
此外，本发明提供在母猪中诱导产生对pedv具有特异性的抗体的方法，其中该方法包含向该母猪施用本发明的免疫原性组合物。
术语“对pedv具有特异性的抗体”是指可检测的抗pedv抗体。此外，已因应经本发明的pedv疫苗进行疫苗接种研发母猪中的抗pedv抗体。术语“对pedv具有特异性的抗体”应进一步意指(但不限于)母猪具有可检测的抗pedv抗体效价，优选至少1:10、更优选1:20以上、甚至更优选1:40以上、甚至更优选1:80以上、甚至更优选1:160、甚至更优选1:320以上且最优选1:640以上。优选地，该抗pedv抗体效价是在特异性抗pedv免疫分析中可检测且可定量的。
有利地，已显示本发明的免疫原性组合物可在母猪中诱导产生对pedv具有特异性的抗体。
本领域技术人员熟知如何检测对pedv具有特异性的抗体的产生，例如通过elisa分析(elisa有市售)。
此外，本发明提供与非免疫对照组的仔猪相比减轻仔猪的腹泻的方法，该方法包含向仔猪的母猪施用治疗有效量的本发明的免疫原性组合物，其中仔猪欲由该母猪哺育。如本文所用术语“仔猪的母猪”具体而言应理解为等同于分别“仔猪的母亲母猪”或“仔猪的护理母猪”。
此外，本发明提供与非免疫对照组的仔猪相比降低仔猪的死亡率的方法，该方法包含向仔猪的母猪施用治疗有效量的本发明的免疫原性组合物，其中仔猪欲由该母猪哺育。
此外，本发明提供与非免疫对照组的仔猪相比降低仔猪的死亡率的方法，该方法包含向仔猪的母猪施用治疗有效量的本发明的免疫原性组合物，其中仔猪欲由该母猪哺育。
此外，本发明提供减少或预防仔猪中由pedv感染引起的临床征象或疾病的方法，其中仔猪欲由已施用本发明的免疫原性组合物的母猪哺育。
优选地，减少的临床征象是死亡率。此外，本发明亦提供降低仔猪中由pedv感染引起的死亡率的方法，其中仔猪欲由已施用本发明的免疫原性组合物的母猪哺育。
此外，本发明提供减少或预防仔猪中由pedv感染引起的临床征象或疾病的方法，其中该方法包含
-向母猪施用本发明的免疫原性组合物，及
-使该仔猪由该母猪哺育。
有利地，已显示本发明的免疫原性组合物在施用怀孕期间的母猪时可减少猪的临床征象。
倘若仔猪经本发明的免疫原性组合物进行疫苗接种，则必须理解，在该仔猪中实际产生抗体需要时间。因此，在本发明方法的另一方面，向怀孕的母猪疫苗接种本发明的免疫原性组合物。该疫苗接种导致在该母猪中产生对pedv具有特异性的抗体。然后将来自该母猪的母源抗体经由初乳和/或乳汁被动转移至新生的仔猪。
在本发明的方法的另一特定方面中，免疫原性组合物所施用的该母猪是正怀孕、具体而言怀有该仔猪的母猪。然而，应理解，仔猪可由任何给予初乳或乳汁的母猪哺育，其中该母猪具体而言是已施用该免疫原性组合物的母猪。
在本发明的方法的另一具体方面中，该方法包含以下步骤：
-向怀有该仔猪的母猪施用本发明的免疫原性组合物，
-使该母猪生出该仔猪，及
-使该仔猪由该母猪哺育。
在本发明的方法的另一具体方面中，与相同物种的非免疫对照组的个体相比，该方法产生选自由以下组成的群的临床征象或效能参数的改良：体重损失减小、较低病毒负荷、腹泻减轻、脱落减少、直肠温度降低、死亡率降低、肠中总体病理病灶减少或其组合。
在本发明的方法的另一具体方面中，该个体是仔猪、猪或母猪。
优选地，免疫原性组合物是施用给前两个月龄内、更优选第一个月龄内的个体。
在本发明的方法的另一具体方面中，免疫原性组合物是施用给第一个月龄内的个体。
因此，必须理解，免疫原性组合物可施用给实例性前三周龄内或前两周龄内的个体。
在本发明的方法的另一具体方面中，该免疫原性组合物是施用给怀孕及泌乳期间的母猪。
有利地，已证明本发明的免疫原性组合物在施用怀孕期间的母猪时安全。
因此，提供通过以下方式抗pedv对猪进行疫苗接种的方法：在分娩之前向怀孕母猪施用本发明的pedv疫苗至少两次，优选地在分娩之前施用三次，更优选地在分娩之前施用两次(“重复剂量”)。优选地，在分娩之前以本发明pedv疫苗的单一剂量向怀孕母猪疫苗接种该疫苗两次。然而，当疫苗施用给母猪两次时，第一次施用应在分娩之前12周与4周之间、更优选在分娩之前9周与5周之间发生。第二次施用应在分娩之前8周与1周之间、更优选在分娩之前6周与1周之间发生。
在本发明的方法的另一具体方面中，以两个或更多个剂量施用免疫原性组合物。
有利地，已显示本发明的免疫原性组合物在两个剂量、优选地鼻内施用后可诱导产生对pedv具有特异性的抗体。
在本发明的方法的另一具体方面中，该免疫原性组合物施用给母猪两次，第一次施用在分娩之前9周与5周之间，且第二次施用在分娩之前6周与1周之间。
优选地，局部或全身性施用免疫原性组合物。常用的适宜施用途径是经口或非经肠施用，例如鼻内、静脉内、肌内、腹膜腔内、皮下以及吸入。然而，取决化合物的性质及作用模式，亦可通过其他途径施用免疫原性组合物。然而，最优选地，经鼻内或经口施用免疫原性组合物。
在本发明的方法的另一具体方面中，经鼻内、黏膜、经口、真皮内或肌内施用该免疫原性组合物。
有利地，已证明本发明的免疫原性组合物在鼻内施用时有效。
在本发明的方法的另一具体方面中，经鼻内或经口施用该免疫原性组合物。
优选地，免疫原性组合物包含介于1×102至1×109tcid50/ml之间、更优选介于1×103至1×107tcid50/ml之间且最优选介于1×104至1×106tcid50/ml之间。
在本发明的方法的另一具体方面中，免疫原性组合物包含介于1×103至1×107tcid50/ml之间。
术语“tcid50/ml”是指感染性病毒效价的量度。特定而言，半数组织培养感染剂量/毫升(tcid50/ml)给出感染与稀释物平行接种的多种细胞培养物的50％的病毒制剂的稀释度。
在本发明的方法的另一具体方面中，该方法自攻击或感染后第2天引起脱落减少。
在本发明的方法的另一具体方面中，该方法自攻击或感染后第3天引起脱落减少。
在本发明的方法的另一具体方面中，该方法自攻击或感染后第4天引起脱落减少。
在本发明的方法的另一具体方面中，该方法自攻击或感染后第5天引起脱落减少。
在本发明的方法的另一具体方面中，该方法自攻击或感染后第7天引起脱落减少。
在本发明的方法的另一具体方面中，该方法自攻击或感染后第10天引起脱落减少。
在本发明的方法的另一具体方面中，该方法自攻击或感染后第5、7或10天引起脱落减少。
有利地，已证明本发明的免疫原性组合物减少感染或攻击后的脱落。
术语“脱落减少”意指与未经治疗(或免疫)但随后由特定pedv感染的个体相比，脱落减少至少10％、更优选至少20％、仍更优选至少30％、甚至更优选至少40％、仍更优选至少50％、甚至更优选至少60％、仍更优选至少70％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少90％、仍更优选至少95％、最优选100％。本领域技术人员熟知如何量测病毒脱落。
术语“脱落”是指粪便排出物或粪便中pedv的分泌。因此，脱落可通过检查粪便排出物、粪便或直肠拭子中的病毒效价来测定。术语“脱落”进一步涵盖病毒转移至易感动物中(亦即哨点)。本领域技术人员熟知如何量测病毒脱落，例如通过pcr、qpcr或elisa。
在本发明的方法的另一具体方面中，该方法增加抗同源攻击的保护。
有利地，已证明本发明的免疫原性组合物在攻击后具有保护性。
本发明提供本发明的cdv载体或本发明的免疫原性组合物用于制造药剂的用途。
本发明亦提供本发明的cdv载体或本发明的免疫原性组合物用于治疗和/或预防个体中由pedv感染引起的临床征象或用于减轻个体的腹泻的用途。
本发明亦是关于：
-本发明的免疫原性组合物或
-本发明的疫苗或医药组合物
其用于减少或预防由pedv感染引起的临床征象或疾病的方法中或用于治疗或预防动物pedv的感染的方法中，其中优选地，该动物是猪。
具体而言，本发明亦是关于本发明的免疫原性组合物或疫苗或本发明的医药组合物，其用于在猪、具体而言优选地怀孕母猪中诱导抗pedv的免疫反应的方法中。
在一方面中，本发明的免疫原性组合物或疫苗或本发明的医药组合物用于减少或预防仔猪中由pedv感染引起的临床征象或疾病的方法中，其中仔猪欲由已施用免疫原性组合物的母猪哺育，且其中该母猪优选是在该母猪怀孕、具体而言怀有该仔猪的同时/时已施用免疫原性组合物的母猪。
根据本发明的尤佳方面，在该用途中，本发明的免疫原性组合物或疫苗或本发明的医药组合物欲经黏膜、优选经鼻内施用例如该母猪。
本发明进一步提供在母猪中诱导产生对pedv具有特异性的抗体的方法，其中该方法包含向该母猪施用本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗或医药组合物，具体而言其包含编码pedvs蛋白的本发明的cdv载体，该pedvs蛋白包含与seqidno:1或seqidno:2的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成。本发明亦进一步提供在母猪中诱导产生对pedv具有特异性的抗体的方法，其中该方法包含向该母猪施用本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗或医药组合物，具体而言其包含编码pedvs蛋白的本发明的cdv载体，该pedvs蛋白包含与seqidno:16或seqidno:17的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成。
此外，本发明具体而言提供减少或预防仔猪中由pedv感染引起的临床征象或疾病的方法，其中该方法包含
-向母猪施用本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗或医药组合物，具体而言其包含编码pedvs蛋白的本发明的cdv载体，该pedvs蛋白包含与seqidno:1或seqidno:2的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成，及
-使该仔猪由该母猪哺育。
此外，本发明具体而言提供减少或预防仔猪中由pedv感染引起的临床征象或疾病的方法，其中该方法包含
-向母猪施用本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗或医药组合物，具体而言其包含编码pedvs蛋白的本发明的cdv载体，该pedvs蛋白包含与seqidno:16或seqidno:17的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成，及
-分别使该仔猪由该母猪哺育，或使该仔猪向该母猪吮乳。
优选地，该母猪是怀孕、具体而言怀有该仔猪的母猪。
更优选地，减少或预防仔猪中由pedv感染引起的临床征象或疾病的该方法包含以下步骤：
--向怀有该仔猪的母猪施用本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗或医药组合物，具体而言其包含编码pedvs蛋白的本发明的cdv载体，该pedvs蛋白包含与seqidno:1或seqidno:2的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成，
-使该母猪生出该仔猪，及
-使该仔猪由该母猪哺育。
作为另一优选选择，减少或预防仔猪中由pedv感染引起的临床征象或疾病的该方法包含以下步骤：
-向怀有该仔猪的母猪施用本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗或医药组合物，具体而言其包含编码pedvs蛋白的本发明的cdv载体，该pedvs蛋白包含与seqidno:16或seqidno:17的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成，
-使该母猪生出该仔猪，及
-分别使该仔猪由该母猪哺育，或使该仔猪向该母猪吮乳。
优选地，本发明的免疫原性组合物或疫苗或本发明的医药组合物经黏膜、例如通过鼻内施用来施用给动物。
最优选地，在减少或预防仔猪中由pedv感染引起的临床征象或疾病的该方法中，该免疫原性组合物或该疫苗或医药组合物经黏膜、优选地鼻内施用给该母猪。
根据又一优选方面，本发明亦提供用于在猪中诱导抗至少一种病原体、具体而言抗pedv的免疫反应或用对猪进行接种疫苗抵抗与pedv相关的疾病和/或降低猪中与pedv相关或由其引起的一或多种临床征象的发病率或严重程度的试剂盒，其包含：
a)能够向该猪施用疫苗的注射器或分配器；及
b)本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗或医药组合物，及
c)可选地说明书手册。
定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术及科学术语皆具有与申请时熟习本发明所属技术领域者通常所了解含义相同的含义。术语的含义及范围应清楚；然而，倘若存在任何潜在歧义，则本文所提供的定义优先于任一字典或外在的定义。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语包括复数形式且复数术语包括单数。在本文中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。此外，使用术语“包括(including)”以及其他形式(例如“包括(includes)”及“包括(included)”)不具有限制意义。本文所提及的所有专利及出版物皆以引用方式并入本文中。
除非另外指明，否则本发明的实践将采用病毒学、分子生物学、微生物学、重组dna技术、蛋白质化学及免疫学的习用技术，其均在本领域的技术范围内。该等技术充分阐释于文献中。参见(例如)sambrook、fritsch及maniatis,molecularcloning:alaboratorymanual,第i、ii及iii卷，第二版(1989)；dnacloning,第i及ii卷(d.n.glover编辑，1985)；寡核苷酸合成(m.j.gait编辑，1984)；核酸杂交(b.d.hames及s.j.higgins编辑1984)；动物细胞培养(r.k.freshney编辑，1986)；固定细胞及酶(irlpress,1986)；perbal,b.,apracticalguidetomolecularcloning(1984)；系列，酶学中的方法(s.colowick及n.kaplan编辑，academicpress,inc.)；蛋白纯化方法-一种实践方法(e.l.v.harris及s.angal编辑，irlpressatoxforduniversitypress)；及handbookofexperimentalimmunology,第i-iv卷(d.m.weir及c.c.blackwell编辑，1986,blackwellscientificpublications)。
在详细阐述本发明之前，应理解，本发明不限于特定dna、多肽序列或制程参数，因为该等当然可变化。亦应理解，本文所用术语仅是出于阐述本发明特定实施例的目的，而非意欲具有限制性。必须注意，除非内容另外明确指出，否则本说明书及随附申请专利范围中所用的单数形式“一(a,an)”及“该(the)”包括多个指示物。因此，例如，所提及的“抗原”包括两种或更多种抗原的混合物，所提及的“赋形剂”包括两种或更多种赋形剂的混合物及诸如此类。
cdv定义
如本文所用的术语，“cdv的特定基因(例如h基因)的3'非编码区”具体而言是指优选地感染性cdv的可表达的特定基因(例如h基因)的rna序列，该rna序列侧接编码序列的3'端(即与起始密码子互补的rna三联体的3'端)且包含该基因的基因起始序列。因此，更特定而言，如本文中提及的“3′非编码区序列”是与优选地感染性cdv的可表达的特定基因(例如h基因)的整个3′非编码序列相同的rna序列。更特定而言，如本文中所提及的“3′非编码区”是与cdv的特定基因(例如h基因)的非编码序列相同的rna序列，其中该非编码序列侧接(a)编码序列及(b)在3′方向上连接该基因与下一基因的基因间序列。
如本文所用术语“基因间区”具体而言是指在cdv的5′方向上连接cdv的基因的5′端与毗邻基因的3′起始的rna序列。
如本文所用术语“基因起始序列”具体而言等同于术语“基因起始信号”。
如本文所用，应理解，术语“cdv的基因组启动子”等同于术语“cdv的基因组前导序列”。
pedv刺突蛋白定义
术语“pedv”为本领域技术人员所熟知的。pedv代表猪流行性腹泻病毒且是α冠状病毒属冠状病毒亚科的成员。。
术语“刺突”是指本领域技术人员所熟知的pedv的特定蛋白质。刺突蛋白是抗体及保护性免疫反应的主要诱导物。此外，刺突蛋白通过结合宿主细胞的细胞受体亦及通过介导与宿主细胞的病毒-细胞膜融合在pedv的细胞进入程序中起主要作用。
术语“蛋白质”、“氨基酸”及“多肽”可互换使用。术语“蛋白质”是指由天然氨基酸以及其衍生物构成的氨基酸(aa)序列。天然氨基酸或基因编码的氨基酸残基分别在业内已众所周知且阐述于生物化学的标准教科书中。在氨基酸序列内，氨基酸由肽键连接。此外，氨基酸序列的两端称为羧基末端(c-末端)及氨基末端(n-末端)。术语“蛋白质”涵盖基本上纯化的蛋白质或另外包含其他蛋白质的蛋白质制剂。此外，该术语亦是关于蛋白质片段。此外，其包括化学修饰的蛋白质。该等修饰可为人工修饰或天然修饰，例如磷酸化、糖基化、肉豆蔻酰化及诸如此类。
分子生物学定义
如本文所述的词组“侧接……的5'端的序列”具体而言等同于分别词组“与……的5'端共价连接的序列”，或词组“序列，其中其3'末端核苷酸与……的5'末端核苷酸共价连接”，其中尤其应理解，该两个末端核苷酸在连接至戊糖的5'碳的磷酸基团与相邻戊糖的3'碳原子之间共价连接。
如本文所述的词组“侧接……的3'端的序列”具体而言等同于分别词组“与……的3'端共价连接的序列”，或词组“序列，其中其5'末端核苷酸与……的3'末端核苷酸共价连接”，其中尤其应理解，该两个末端核苷酸在戊糖的3'碳原子与连接至相邻戊糖的5'碳的磷酸基团之间共价连接。
如业内所知，术语“载体”是指用于将遗传物质传递至宿主细胞的多核苷酸构建体，通常为质粒或细菌人工染色体。载体可为(例如)细菌、病毒、噬菌体、细菌人工染色体、黏粒或质粒。如本文所用的载体可由dna或rna构成或包含dna或rna。在一些实施例中，载体由dna构成。在一些实施例中，载体是感染性病毒。该病毒载体含有以使其携带外源基因的方式经操纵的病毒基因组，该外源基因在细胞培养物及宿主动物中的病毒载体复制中皆不起作用。根据本发明的具体方面，载体可用于各个方面，例如仅遗传物质的传递、用于宿主细胞或生物体的转染、用作疫苗(例如dna疫苗)或用于基因表达目的。基因表达是阐述由称为基因的特定多核苷酸序列引导的细胞中蛋白质的生物合成的术语。在具体方面中，载体可为“表达载体”，其是当载体存在于适当的环境中时，能引导由载体所携带的一或多个基因编码的蛋白质表达的载体。
载体及制备和/或使用载体(或重组物)进行表达的方法可通过以下中所揭示的方法或类似于该等方法：尤其美国专利第4,603,112号、第4,769,330号、第5,174,993号、第5,505,941号、第5,338,683号、第5,494,807号、第4,722,848号、第5,942,235号、第5,364,773号、第5,762,938号、第5,770,212号、第5,942,235号、第382,425号、pct公开案wo94/16716、wo96/39491号、wo95/30018；paoletti,“applicationsofpoxvirusvectorstovaccination:anupdate”，pnasusa93:11349-11353,1996年10月；moss,“geneticallyengineeredpoxvirusesforrecombinantgeneexpression,vaccination,andsafety”，pnasusa93:11341-11348,1996年10月；smith等人，美国专利第4,745,051号(重组杆状病毒)；richardson,c.d.(编辑),methodsinmolecularbiology39,“baculovirusexpressionprotocols”(1995humanapressinc.)；smith等人，“productionofhumanbetainterferonininsectcellsinfectedwithabaculovirusexpressionvector”,molecularandcellularbiology,1983年12月，第3卷，第12期，第2156-2165页；pennock等人，“strongandregulatedexpressionofescherichiacolib-galactosidaseininfectcellswithabaculovirusvector”，molecularandcellularbiology，1984年3月，第4卷，第3期，第406页；epa0370573；于1986年10月16日提出申请的美国申请案第920,197号；ep专利公开案第265785号；美国专利第4,769,331号(重组疱疹病毒)；roizman,“thefunctionofherpessimplexvirusgenes:aprimerforgeneticengineeringofnovelvectors”，pnasusa93:11307-11312,1996年10月；andreansky等人，“theapplicationofgeneticallyengineeredherpessimplexvirusestothetreatmentofexperimentalbraintumors”，pnasusa93:11313-11318,1996年10月；robertson等人，“epstein-barrvirusvectorsforgenedeliverytoblymphocytes”,pnasusa93:11334-11340,1996年10月；frolov等人，“alphavirus-basedexpressionvectors:strategiesandapplications”，pnasusa93:11371-11377,1996年10月；kitson等人，j.virol.65,3068-3075,1991；美国专利第5,591,439号、第5,552,143号；wo98/00166；核准的美国申请案是列第08/675,556号及第08/675,566号，二者皆于1996年7月3日提出申请(重组腺病毒)；grunhaus等人，1992,“adenovirusascloningvectors”，seminarsinvirology(第3卷)第237-52页,1993；ballay等人embojournal,第4卷，第3861-65页,graham,tibtech8,85-87,1990年4月；prevec等人，j.genvirol.70,42434；pctwo91/11525；felgner等人(1994),j.biol.chem.269,2550-2561,science,259:1745-49,1993；及mcclements等人，“immunizationwithdnavaccinesencodingglycoproteindorglycoproteinb,aloneorincombination,inducesprotectiveimmunityinanimalmodelsofherpessimplexvirus-2disease”,pnasusa93:11414-11420,1996年10月；及美国专利第5,591,639号、第5,589,466号及第5,580,859号，以及wo90/11092、wo93/19183、wo94/21797、wo95/11307、wo95/20660；tang等人，nature，及furth等人，analyticalbiochemistry,与dna表达载体有关。亦参见wo98/33510；ju等人，diabetologia,41:736-739,1998(慢病毒表达系统)；sanford等人，美国专利第4,945,050号；fischbach等人(intracel)；wo90/01543；robinson等人，seminarsinimmunology，第9卷，第271-283页(1997)，(dna载体系统)；szoka等人，美国专利第4,394,448号(将dna插入活细胞的方法)；mccormick等人，美国专利第5,677,178号(细胞病变病毒的使用)；及美国专利第5,928,913号(用于基因递送的载体)；以及本文中引用的其他文件。
术语“病毒载体”阐述通过重组dna技术操纵的基因修饰的病毒，使得其进入宿主细胞产生特异性生物活性，例如由载体携带的转基因的表达。在具体方面中，转基因是抗原。病毒载体在靶细胞、组织或生物体中可复制胜任或可不复制胜任。尤其应理解，如本文使用的术语“病毒载体(viralvector)”等同于术语“病毒的载体(virusvector)”。
病毒载体的产生可使用业内熟知的任何适宜基因工程技术来完成，包括但不限于限制内核酸酶消化、连接、转变、质粒纯化、dna测序、细胞培养物转染的标准技术，例如如以下中所述：sambrook等人(molecularcloning:alaboratorymanual.coldspringharborlaboratorypress,n.y.(1989))或k.maramorosch及h.koprowski(methodsinvirologyvolumeviii,academicpressinc.london,uk(2014))。
病毒载体可纳入来自任何已知生物体的基因组的序列。序列可以其天然形式纳入或可以任何方式经修饰以获得期望活性。举例而言，序列可包含插入、缺失或取代。
病毒载体可包括两种或更多种所关注的蛋白质的编码区。举例而言，病毒载体可包括所关注的第一蛋白质的编码区及所关注的第二蛋白质的编码区。所关注的第一蛋白质及所关注的第二蛋白质可相同或不同。在一些实施例中，病毒载体可包括所关注的第三或第四蛋白质的编码区。所关注的第三及第四蛋白质可相同或不同。由一种病毒载体编码的两种或更多种所关注的蛋白质的总长度可变。举例而言，两种或更多种蛋白质的总长度可为至少约200个氨基酸。至少约250个氨基酸、至少约300个氨基酸、至少约350个氨基酸、至少约400个氨基酸、至少约450个氨基酸、至少约500个氨基酸、至少约550个氨基酸、至少约600个氨基酸、至少约650个氨基酸、至少约700个氨基酸、至少约750个氨基酸、至少约800个氨基酸或更长。
术语“病毒载体”及“病毒构建体”可互换使用。
如本文所用术语“构建体”是指人工产生的重组核酸，例如质粒、bac或重组病毒。
术语“质粒”是指独立于细菌宿主细胞内的细菌染色体复制的细胞质dna。在本发明的具体方面中，术语“质粒”和/或“转移质粒”是指用于构筑(例如)表达盒用于插入病毒载体中的重组dna技术的组件。在另一具体方面中，术语“质粒”可用于指定可用于dna疫苗接种目的的质粒。
如本文所用术语“核酸”及“多核苷酸”可互换使用且是指任何核酸。术语“核酸序列”应理解为等同于术语“核苷酸序列”。术语“核苷酸序列”应理解为等同于术语“多核苷酸序列”。
如本文所用的术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“rna序列”或“dna序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段及部分，且是指基因组或合成来源的dna或rna，其可为单链或双链且代表有义链或反义链。序列可为非编码序列、编码序列或二者的混合物。本发明的核酸序列可使用本领域技术人员熟知的标准技术来制备。
术语“核酸”及“多核苷酸”亦特定而言包括由除5个生物碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶)外的碱基构成的核酸。
如本文所用术语“启动子”或“启动子序列”是指允许rna聚合酶结合并引导基因转录的核苷酸序列。通常，启动子位于基因的5'非编码区中，靠近基因的转录起始位点。启动子内用于起始转录的序列组件通常特征在于具有共有核苷酸序列。启动子的实例包括(但不限于)来自细菌、酵母、植物、病毒及动物(例如哺乳动物(包括马、猪、牛及人类))、鸟或昆虫的启动子。启动子可为可诱导型、可阻抑型和/或组成型。诱导型启动子因应于培养条件的一些变化(例如温度变化)，在其控制下启动增加的自dna的转录程度(ptashne,2014)。本领域技术人员熟知的启动子的实例是(例如)sv40大t、hcmv及mcmv立即早期基因1、人类延长因子α启动子、杆状病毒多角体蛋白启动子。
术语“互补核苷酸序列”阐述多核苷酸的两条配对链的一条链，例如dna或rna。互补链的核苷酸序列与其配对链的核苷酸序列成镜像，使得对于每一腺苷，其含有胸腺激素(或对于rna为尿嘧啶)，对于每一鸟嘌呤为胞嘧啶，且反的亦然。例如，5’-gcatac-3’的互补核苷酸序列是3’-cgtatg-5’或对于rna为3’-cguaug-5’。
如本文所用术语“基因”、“所关注的基因”具有相同含义且是指编码所关注的产物的任何长度的多核苷酸序列。基因可进一步包含编码序列之前的调控序列(5'非编码或非转译序列)及随后的调控序列(3'非编码或非转译序列)。选择的序列可是全长或截短的、融合或标记的基因，且可为cdna、基因组dna或dna片段。通常理解，编码多肽或rna的基因组dna可包括自成熟信使rna(mrna)剪接的非编码区(即内含子)且因此不存在于编码相同多肽或rna的cdna中。其可为天然序列，即天然形式，或可经突变，或包含源自不同来源的序列或视需要进行其他修饰。该等修饰包括密码子优化，以优化所选宿主细胞中的密码子使用或标记。此外，其可包括去除或添加顺式作用位点，例如(隐藏)剪接供体、受体位点及分支点、多聚腺苷酸化信号、tata-盒、chi位点、核糖体进入位点、重复序列、二级结构(例如茎环)、转录因子或其他调节因子的结合位点、限制性内切酶位点等，仅给出几个但并非限制性实例。选择的序列可编码分泌的、细胞质、核、膜结合的或细胞表面多肽。
如本文所用的术语“所关注的核苷酸序列”是比所关注的基因更通用的术语，此乃因其不一定包含基因，但可包含基因的组件或部分或其他遗传信息(例ori(复制起点))。所关注的核苷酸序列可为任何dna或rna序列，与其是否包含编码序列无关。
术语“转录”阐述细胞中mrna的生物合成。
如本文所用的术语“表达”是指宿主细胞内核酸序列的转录和/或转译。根据本发明的具体方面，术语“表达”是指宿主细胞内异源和/或外源核酸序列的转录和/或转译。在宿主细胞中期望产物的表达量可基于存在于细胞中的相应rna或mrna的量或由所选序列编码的期望多肽的量来测定。举例而言，可通过北方印迹杂交、核糖核酸酶rna保护、与细胞rna原位杂交或通过rtqpcr(反转录，之后定量pcr)来定量自所选序列转录的mrna。自所选序列表达的蛋白质可通过各种方法定量，例如通过elisa、蛋白印迹法、通过放射免疫分析、通过免疫沉淀、通过分析蛋白质的生物活性或通过蛋白质的免疫染色、之后facs分析。
术语“表达盒”或“转录单元”或“表达单元”定义含有一或多个欲转录基因的载体、构建体或多核苷酸序列内的区，其中编码转录基因的核苷酸序列以及含有包含于表达盒内的调节组件的多核苷酸序列彼此可操作地连接。其是自激活子转录，且转录是由至少一个聚腺苷酸化信号终止。在一个具体方面中，其是自一个单一启动子转录。因此，不同基因至少是转录相关联的。可自每一转录单元(多顺反子转录单元)转录及表达一种以上蛋白质或产物。每一转录单元将包含转录及转译包含于单位内的任何所选序列所需的调节组件。且每一转录单元可含有相同或不同调节组件。举例而言，每一转录单元可含有相同终止子，ires组件或内含子可用于转录单元内基因的功能性连接。载体或多核苷酸序列可含有一个以上转录单元。
术语“病毒效价”是每体积的病毒制剂的感染单位的量度。病毒效价是生物程序中的终点并定义为平行实施的一定比例的测试显示效应的稀释度(reed及muench，1938)。特定而言，半数组织培养感染剂量/毫升(tcid50/ml)给出感染与稀释物平行接种的多种细胞培养物的50％的病毒制剂的稀释度。
“转录调节组件”通常包含欲表达的基因序列上游的启动子、转录起始及终止位点及多聚腺苷酸化信号。
术语“转录起始位点”是指构建体中对应于纳入一级转录物(即mrna前体)中的第一核酸的核酸。转录起始位点可能与启动子序列重迭。
“终止信号”或“终止子”或“多聚腺苷酸化信号”或“多a”或“转录终止位点”或“转录终止组件”是引起在真核mrna的3'端的特异性位点裂解及在裂解的3'端转录后纳入约100-200个腺嘌呤核苷酸的序列(多a尾)，且因此引起rna聚合酶终止转录。多聚腺苷酸化信号包含在裂解位点上游约10-30个核苷酸的序列aataaa及位于下游的序列。已知各种多聚腺苷酸化组件，例如tk多a、sv40晚期及早期多a、bgh多a(阐述于例如美国专利第5,122,458号中)或仓鼠生长激素多a(wo2010010107)。
“转译调节组件”包含欲表达的每一个别多肽的转译起始位点(aug)、终止密码子及多a信号。一些构建体中可包括内部核糖体进入位点(ires)。为了优化表达，可能建议去除、添加或改变欲表达的核酸序列的5'和/或3'非转译区，以消除任何潜在的额外不适当的替代性转译起始密码子或可能在转录或转译程度上干扰或降低表达的其他序列。可紧接起始密码子的上游插入共有核糖体结合位点(kozak序列)，以增强转译并由此表达。此核糖体结合位点附近增加的a/u含量促进更有效的核糖体结合。
根据定义，插入宿主细胞中的每个多核苷酸序列或每个基因以及由此编码的个别蛋白质或rna当其来自不同(病毒)物种时，被称为相对于宿主细胞的“外源”、“外源序列”、“外源基因”、“外源编码序列”。如本文关于所关注的序列或基因(例如抗原)所使用的术语“外源”意指所关注的该序列或基因、具体而言该抗原在其天然物质的背景外表达。因此，相对于cdv载体，pedvs蛋白是外源性抗原的一个实例(参见实例)。如本文所用术语“外源rna”或“外源核酸序列”具体而言是指自外部来源、例如自重组序列引入cdv病毒的基因组中的核酸序列。该外部来源的实例包含pedv衍生的序列。更特定而言，外源核酸序列的引入导致分别具有非天然存在的部分的基因组或基因。因此，如本文所用术语“外源rna”具体而言是指在cdv基因组中非天然发现的核苷酸序列。该非天然存在的部分或非天然发现的序列分别亦可为一个天然存在的核苷酸序列插入另一个天然存在的核苷酸序列的结果。
根据定义，插入宿主细胞中的每个多核苷酸序列或每个基因以及由此编码的各别蛋白质或rna被称为相对于宿主细胞的“异源”、“异源序列”、“异源基因”、“异源编码序列”、“转基因”或“异源蛋白质”。即使欲引入的序列或欲引入的基因与宿主细胞的内源序列或内源基因相同，此亦适用。举例而言，在与cdv野生型病毒中不同的位点或以经修饰形式引入cdv载体中的cdv的n基因的5′非编码区是通过定义异源序列。如本文关于所关注的序列或基因(例如抗原)所使用的术语“异源”意指所关注的该序列或基因、具体而言该抗原在其天然亚物质的背景外表达。
术语“非天然存在”意指在此背景下天然存在的所关注的任何序列或基因(例如抗原)，例如杂交序列或来自不同物种的所关注的序列或基因(例如抗原)、或由于人造突变、插入、缺失或诸如此类而并非自然产物的所关注的序列或基因(例如抗原)。
在本发明的整个说明书中，术语“重组”可与术语“非天然存在”、“异源”及“外源”交换使用。因此，“重组”蛋白是自异源或外源多核苷酸序列表达的蛋白质。关于病毒使用的术语重组意指通过人工操纵病毒基因组产生的病毒。包含异源或外源序列(例如外源抗原编码序列)的病毒是重组病毒。术语重组病毒与术语非天然存在的病毒可互换使用。
因此，术语“异源载体”意指包含异源或外源多核苷酸序列的载体。术语“重组载体”意指包含异源或重组多核苷酸序列的载体。
如本文所用术语可“操作连接”用于阐述调节组件与基因或其编码区之间的链接。通常，基因表达置于一或多个调节组件(例如但不限于组成型或可诱导型启动子、组织特异性调节组件及增强子)控制下。据称基因或编码区“可操作连接至”或“以可操作方式连接至”或“可操作缔合至”调节组件意指基因或编码区由调节组件控制或影响。例如，若启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作连接至编码序列。
尤其应理解，在本发明的上下文中，术语“与序列[…]相同”等同于术语“与序列具有[…]序列相同性”。
如本文所用，尤其应理解，术语“与seqidno:y的序列至少x％相同”等同于分别术语“在seqidno:y的长度内与seqidno:y的序列至少x％相同”或术语“在seqidno:y的整个长度内与seqidno:y的序列至少x％相同”。在此上下文中，“x”是70至100的任何数字，具体而言选自70至100的任何整数，使得“x％序列相同性”代表本文提及的序列相同性％中的任一者。分别地，“x”在此上下文中是选自1至17的任何整数，使得“seqidno:y”表示本文提及的seqidno中的任一者。
此外，应理解，如本文所述术语“至少99％相同”亦(在范围的一个极端中)包含且是关于分别术语“100％相同”或“与该序列相同”。
术语“序列相同性”已为业内所知且是指两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列、亦即参照序列与欲与参照序列进行比较的给定序列之间的关是。通过在将序列最优选地比对以产生最高序列相似性程度之后比较给定序列与参考序列来测定序列相同性，如通过该等序列串之间的匹配所测定。在该比对后，基于逐个位置来确定序列相同性，例如，若核苷酸或氨基酸残基在一个位置相同，则该等序列在该位置“相同”。然后将该等位置相同性的总数除以参考序列中的核苷酸或残基的总数以得到序列相同性％。序列相同性可通过已知方法容易地计算，该等方法包括但不限于以下中所述的那些：computationalmolecularbiology,lesk,a.n.编辑，oxforduniversitypress,newyork(1988),biocomputing:informaticsandgenomeprojects,smith,d.w.编辑，academicpress,newyork(1993)；computeranalysisofsequencedata，第i部分，griffin,a.m.及griffin,h.g.编辑，humanapress,newjersey(1994)；sequenceanalysisinmolecularbiology,vonheinge,g.,academicpress(1987)；sequenceanalysisprimer,gribskov,m.及devereux,j.编辑，m.stocktonpress,newyork(1991)；及carillo,h.及lipman,d.,siamj.appliedmath.,48:1073(1988)，其教示以引用方式并入本文中。设计用于测定序列相同性的优选方法以得到所测试序列之间的最大匹配。将测定序列相同性的方法编成测定给定序列间的序列相同性的公开获得的计算机程序。该等程序的实例包括(但不限于)gcg程序包(devereux,j.,等人，nucleicacidsresearch,12(1):387(1984))、blastp、blastn及blastx(altschul,s.f.等人，j.molec.biol.,215:403-410(1990)。该blastx程序可自ncbi及其他来源公开获得(blastmanual,altschul,s.等人，ncvinlmnihbethesda,md20894；altschul,s.f.等人，j.molec.biol.,215:403-410(1990)，其教示以引用方式并入本文中)。该等程序最优选地使用默认空位权重比对序列以在给定序列与参考序列之间产生最高序列相同性程度。作为阐释，对于具有与参照核苷酸序列具有至少(例如)85％、优选90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选95％、96％、97％、98％、99％、99.9％“序列相同性”的核苷酸序列的多核苷酸而言，预计给定多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同，只是给定多核苷酸序列可包括多达15个、优选多达10个、甚至更优选多个5个点突变/参照核苷酸序列的100个核苷酸。换言的，在具有相对于参照核苷酸序列具有至少85％、优选90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选95％、96％、97％、98％、99％、99.9％相同性的核苷酸序列的多核苷酸中，参照序列中高达15％、优选10％、9％、8％、7％、6％、甚至更优选5％、4％、3％、2％、1％、0.1％的核苷酸可缺失或经另一核苷酸取代，或可向参照序列插入占参照序列中总核苷酸的高达15％、优选10％、9％、8％、7％、6％、甚至更优选5％、4％、3％、2％、1％、0.1％的数目的核苷酸。参考序列的该等突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或在那些末端位置之间的任何位置，其是个别地散布在参考序列中的各核苷酸之间或在参考序列内呈一或多个邻接基团形式。类似地，对于具有与参照氨基酸序列具有至少(例如)85％、优选90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选95％、96％、97％、98％、99％序列相同性的给定氨基酸序列的多肽而言，预计多肽的给定氨基酸序列与参照序列相同，只是给定多肽序列可包括高达15个、优选高达10、9、8、7、6个、甚至更优选高达5、4、3、2、1个氨基酸改变/参照氨基酸序列的100个氨基酸。换言的，为了获得与参照氨基酸序列具有至少85％、优选90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选95％、96％、97％、98％、99％序列相同性的给定多肽序列，参照序列中高达15％、优选高达10％、9％、8％、7％、甚至更优选高达5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸残基可缺失或经另一氨基酸取代，或可向参照序列中插入占参照序列中氨基酸残基的总数的高达15％、优选高达10％、9％、8％、7％、甚至更优选高达5％、4％、3％、2％、1％的数目的氨基酸。参考序列的该等改变可发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或在那些末端位置之间的任何位置，其是个别地散布在参考序列中的各残基之间或在参考序列内呈一或多个邻接基团形式。优选地，不同残基位置因保守氨基酸取代而不同。然而，当确定序列相同性时，保守取代并不作为匹配包括在内。
术语“序列相同性”或“相同性％”在本文中可互换使用。出于本发明目的，此处定义，为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的相同性％，将序列进行比对以达到最优选比较目的(例如，可在第一氨基酸或核酸的序列中引入空位，用于与第二氨基酸或核酸序列进行最优选比对)。然后比较相应氨基酸或核苷酸位置的氨基酸或核苷酸残基。当第一序列中的位置由与第二序列中的相应位置相同的氨基酸或核苷酸残基占据时，则分子在该位置相同。两个序列之间的相同性％随该等序列所共享的相同位置数变化(即，相同性％＝相同位置数/总位置(即重迭位置)数×100)。优选地，两个序列的长度相同。
序列比较可在比较的两个序列的整个长度上实施，或在两个序列的片段上实施。通常，比较将在所比较的两个序列的整个长度上实施。然而，序列相同性可在(例如)20、50、100或更多个邻接氨基酸残基的区上实施。
本领域技术人员将明了以下事实：若干不同计算机程序可用于测定两个序列之间的相同性。举例而言，两个序列之间的序列比较及相同性％的测定可使用数学算法来完成。在优选实施例中，使用needleman及wunsch(j.mol.biol.(48):444-453(1970))算法测定两个氨基酸或核酸序列之间的相同性％，该算法纳入accelrysgcg软件包(可在http://www.accelrys.com/products/gcg/获得)中的gap程序中，使用blosum62矩阵或pam250矩阵、及16、14、12、10、8、6或4的空位权重及1、2、3、4、5或6的长度权重。本领域技术人员应了解，所有该等不同参数将产生略微不同的结果，但在使用不同算法时，两个序列的总体相同性％并不显著改变。
可使用本发明的蛋白质序列或核酸序列作为“询问序列”来实施针对公共数据库的检索，以例如鉴别其他家族成员或相关序列。该等搜索可使用altschul等人，(1990)j.mol.biol.215:403-10的blastn及blastp程序(2.0版)来实施。blast蛋白搜索可利用blastp程序、评分＝50、字长＝3来实施，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位化比对，可如以下中所述利用空位化blast：altschul等人(1997)nucleicacidsres.25(17):3389-3402。在利用blast及空位化blast程序时，可使用各别程序(例如，xblast及nblast)的默认参数。参见国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
疫苗定义
“免疫原性或免疫组合物”是指包含至少一种抗原或其免疫原性部分的物质的组合物，其引发宿主中细胞或抗体介导的对组合物的免疫反应的免疫反应。
本文使用的术语“抗原”在业内是众所周知的，且包括具有免疫原性的物质(即免疫原)，以及诱导免疫不反应性或无反应性(即身体的防御机制对外来物质无反应)的物质。如本文所用术语“抗原”欲指含有或包含表位的全长蛋白质以及其肽片段。
如本文所用的“免疫原性组合物”可以指多肽或蛋白质，例如引发如本文所述的免疫反应的病毒表面蛋白。术语“免疫原性片段”或“免疫原性部分”是指蛋白质或多肽的片段或截短和/或取代形式，其包括一或多个表位且由此引发本文所述的免疫反应。一般而言，该等截短和/或取代的形式或片段将包含来自全长蛋白质的至少六个邻接氨基酸。该等片段可使用任一数目的业内熟知的表位定位技术来鉴别。参见(例如)epitopemappingprotocolsinmethodsinmolecularbiology,第66卷(glenne.morris编辑，1996)humanapress,totowa,newjersey。举例而言，线性表位可通过在固体载体上同时合成大量肽(该等肽对应于蛋白质分子的部分)、及与抗体反应同时肽仍连接至载体来测定。该等技术是业内已知及经阐述的，参见例如美国专利第4,708,871号；geysen等人(1984)proc.natl.acad.sci.usa81:3998-4002；及geysen等人(1986)molec.immunol.23:709-715。类似地，例如通过例如x射线结晶学及二维核磁共振，通过测定氨基酸的空间构象来容易地鉴别构象表位。参见epitopemappingprotocols，上文文献。该定义内亦包括合成抗原，例如多表位、侧接表位及其他重组或合成衍生的抗原。参见(例如)bergmann等人(1993)eur.j.immunol.23:2777-2781；bergmann等人(1996),j.immunol.157:3242-3249；suhrbier,a.(1997),immunol.andcellbiol.75:402-408；及gardner等人，(1998)12thworldaidsconference,geneva,switzerland,1998年6月28日至7月3日。(其教示及内容全部以引用方式并入本文中。)
如本文所用术语“疫苗”是指包含至少一种在动物中诱导免疫反应的免疫活性组分且可能但不一定包含一或多种增强活性组分的免疫活性的额外组分的医药组合物。疫苗可另外包含为医药组合物典型的其他组分。通过区别，疫苗的免疫活性组分可包含呈其初始形式的完整病毒颗粒或所谓经修饰活疫苗(mlv)中的减毒颗粒或通过适当方法在所谓杀死的疫苗(kv)中灭活的颗粒。在另一形式中，疫苗的免疫活性组分可包含生物体的适当组件(亚单位疫苗)，其中该等组件是通过以下方式生成：通过破坏整个颗粒或含有该等颗粒的生长培养物及可选地随后的纯化步骤从而产生期望结构，或通过合成方法，包括利用基于例如细菌、昆虫、哺乳动物或其他物种的适宜系统的适当操纵加上可选地随后的分离及纯化程序，或通过使用适宜医药组合物直接纳入遗传物质来诱导需要疫苗的动物中的合成过程(多核苷酸疫苗接种)。疫苗可包含上述组件中的一种或同时一种以上。如在本发明的具体方面中所用，“疫苗”是指活疫苗或活病毒，亦称为重组疫苗。在本发明的另一具体方面中，“疫苗”是指包括类病毒颗粒(vlp)在内的灭活或杀死的病毒。因此，疫苗可为亚单位疫苗或杀死(kv)或灭活的疫苗。
术语“感染复数(m.o.i.)”阐述每个细胞使用多少感染单元(例如，tcid50)的病毒制剂以感染培养的细胞。举例而言，m.o.i.为0.01意味着对于培养容器中的每100个细胞，接种一个感染单元。
术语“dna疫苗接种”或“多核苷酸疫苗接种”意指使用适宜医药组合物直接接种遗传物质。
灭活的各种物理及化学方法为业内已知。术语“灭活”是指先前有毒力或无毒力的病毒或细菌经辐照(紫外线(uv)、x射线、电子束或γ辐射)、加热或化学处理以灭活或杀死该病毒或细菌，同时保留其免疫原性。适宜灭活剂包括β-丙内酯、二元或β-或乙酰基-次乙亚胺、戊二醛、臭氧及福尔马林(formalin)(甲醛)。
对于由福尔马林或甲醛灭活，通常将甲醛与水及甲醇混合以产生福尔马林。添加甲醇可防止灭活过程期间的降解或交叉反应。一个实施例使用约0.1％至1％的37％甲醛溶液来灭活病毒或细菌。至关重要的是，调节福尔马林的量以确保材料灭活，但不会多至发生因高剂量的副作用。
更具体而言，术语“灭活”在病毒的上下文中意指该病毒不能在活体内或活体外复制，且分别，术语“灭活”在细菌的上下文中意指细菌不能在活体内或活体外复制。举例而言，术语“灭活”可以指已经在活体外繁殖且然后使用化学或物理方式使其灭活以使其不再能够复制的病毒。在另一实例中，术语“灭活”可以指已经繁殖且然后使用化学或物理方式使其灭活的细菌，从而产生细菌、细菌的片段或组分的悬浮液，例如产生可用作疫苗的组分的菌苗。
如本文所用术语“灭活”、“杀死”或“kv”可互换使用。
术语“活疫苗”是指包含活生物体或复制胜任病毒或病毒载体的疫苗。
“医药组合物”基本上由一或多种能够改变其所施用的生物体或生物体中或上面存活的生物体的生理(例如免疫)功能的成分组成。该术语包括(但不限于)抗生素或抗寄生虫剂、以及通常用于实现某些其他目的(例如但不限于处理性状、不孕性、稳定性、经肠或非经肠途径(例如经口、鼻内、静脉内、肌内、皮下、真皮内或其他适宜途径)施用组合物的可行性、施用后耐受性或控制释放性质)的其他成分。该医药组合物的一个非限制性实例仅仅是用于展现目的给出，可如下制备：将感染的细胞培养物的细胞培养物上清液与稳定剂(例如亚精胺和/或牛血清白蛋白(bsa))混合且随后将混合物通过其他方法进行冻干或去水。在疫苗接种之前，随后将混合物在水溶液(例如，盐水、磷酸盐缓冲盐水(pbs))或非水溶液(例如，油乳液、基于铝的佐剂)中再水化。
如本文所用的“医药上或兽医上可接受的载剂”包括任何及全部溶剂、分散介质、涂布剂、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂及诸如此类。在一些优选实施例且尤其包括冻干的免疫原性组合物的那些中，用于本发明的稳定剂包括用于冻干或冷冻干燥的稳定剂。
在一些实施例中，本发明的免疫原性组合物含有佐剂。如本文所用的“佐剂”可包括氢氧化铝及磷酸铝、皂素，例如quila、qs-21(cambridgebiotechinc.,cambridgema)、gpi-0100(galenicapharmaceuticals,inc.,birmingham,al)、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。具体而言，乳液可基于轻质液体石蜡油(欧洲药典型)；类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；由烯烃(具体而言异丁烯或癸烯)寡聚产生的油；酸或含有直链烷基的醇的酯，更具体而言植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、三-(辛酸甘油酯/癸酸甘油酯)或丙二醇二油酸酯；具支链脂肪酸或醇的酯，具体而言异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选是非离子型表面活性剂，具体而言为山梨醇酐、二缩甘露醇(例如无水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇与油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的可选地经乙氧基化的酯，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，具体而言pluronic产品，尤其l121。参见hunter等人，thetheoryandpracticalapplicationofadjuvants(编辑stewart-tull,d.e.s.),johnwileyandsons,ny,第51-94页(1995)及todd等人，vaccine15:564-570(1997)。实例性佐剂是由m.powell及m.newman编辑的“vaccinedesign,thesubunitandadjuvantapproach”，plenumpress,1995的第147页上阐述的spt乳液、及同一本书第183页上阐述的乳液mf59。
佐剂的又一实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物及马来酸酐与烯基衍生物的共聚物的化合物。优选的佐剂化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，其尤其与糖类或多元醇的聚烯基醚交联。此等化合物由术语卡波姆(carbomer)已知(pharmeuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。本领域技术人员亦可参考美国专利第2,909,462号，其阐述与聚羟基化化合物交联的该等丙烯酸是聚合物，该聚羟基化化合物具有至少3个(优选不超过8个)羟基，至少3个羟基的氢原子由具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团置换。优选基团是含有2个至4个碳原子的那些，例如乙烯基、烯丙基及其他烯是不饱和基团。不饱和基团自身可含有诸如甲基等其他取代基。以名称
其他适宜佐剂尤其包括(但不限于)ribi佐剂系统(ribiinc.)、嵌段共聚物(cytrx,atlantaga)、saf-m(chiron,emeryvilleca)、单磷酰脂质a、阿夫立定(avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(重组或其他)的热不稳定肠毒素、霍乱毒素、ims1314或胞壁酰二肽、或其天然或重组细胞介素或其类似物或内源细胞介素释放的刺激剂等。
预计佐剂可以每剂量约100μg至约10mg的量、优选以每剂量约100μg至约10mg的量、更优选以每剂量约500μg至约5mg的量、甚至更优选以每剂量约750μg至约2.5mg的剂量、且最优选以每剂量约1mg的量添加。或者，以最终产物的体积计，佐剂可为约0.01％至50％的浓度，优选约2％至30％的浓度，更优选为约5％至25％的浓度，仍更优选为约7％至22％的浓度，且最优选为10％至20％的浓度。
“稀释剂”可包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油及诸如此类。等渗剂可尤其包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸的碱金属盐。
“经分离”意指自其天然状态“由人工”改变，即若其在自然界中存在，则其已经改变或自其初始环境中移出，或两者兼而有的。举例而言，天然存在于活生物体中的多核苷酸或多肽并非“分离的”，但自其天然状态的共存物质分离的相同多核苷酸或多肽是“分离的”，如本文中使用的术语。
“减毒”意指降低病原体的毒力。在本发明中，“减毒”与“无毒力”同义。在本发明中，减毒病毒是毒力已降低从而不会引起感染的临床征象但能够在目标哺乳动物(例如犬)中诱导免疫反应者，但亦可意指与感染非减毒病毒或病原体且未接受减毒病毒的动物的“对照组”相比在感染减毒病毒、尤其所主张的cdv载体的动物(例如犬)中临床征象的发生率或严重程度有所降低。在此上下文中，术语“降低(reduce/reduced)”意指与如上文所定义的对照组相比降低至少10％、优选25％、甚至更优选50％、仍更优选60％、甚至更优选70％、仍更优选80％、甚至更优选90％且最优选100％。因此，减毒的无毒力病原体(例如所主张的减毒的病毒载体、尤其所主张的cdv载体)适于产生经修饰的活疫苗(mlv)或经修饰的活的免疫原性组合物。
在本文中，“有效剂量”意指(但不限于)引起或能够引发免疫反应且在施用抗原的动物中产生临床症状的减少的量。
如本文所用术语“有效量”在组合物的上下文中意指能够诱导免疫反应且降低动物的疾病的感染或事件的严重程度的免疫原性组合物的量。具体而言，有效量是指每剂量的菌落形成单位(cfu)。或者，在疗法的上下文中，术语“有效量”是指足以减轻或改善疾病或病症或其一或多种症状的严重程度或持续时间、防止疾病或病症进展、引起疾病或病症消退、防止与疾病或病症相关的一或多种症状的复发、发展、发作或进展、或增强或改良另一疗法或治疗剂的预防或治疗的疗法的量。
“免疫反应(immuneresponse或immunologicalresponse)”意指(但不限于)对所关注的(免疫原性)组合物或疫苗发生细胞和/或抗体介导的免疫反应。通常，免疫(immune或immunological)反应包括(但不限于)以下效应中的一或多者：产生或活化特异性针对所关注组合物或疫苗中所包括的一或多种抗原的抗体、b细胞、辅助性t细胞、阻抑性t细胞和/或细胞毒性t细胞。优选地，宿主将展示治疗性或保护性免疫(记忆)反应，使得对新感染的抗性将增强和/或疾病的临床严重程度降低。该保护将通过症状数量的减少、症状严重程度的降低、或无与病原体感染相关的一或多种症状、病毒血症发作的延迟、病毒持久性降低、整体病毒负荷的降低和/或病毒排泄的降低来展现。
“保护抵抗疾病”、“保护性免疫性”、“功能免疫性”、“临床症状的减少”、“中和抗体的诱导/产生和/或血清转化”及类似片语意指通过施用本发明的一或多种治疗性组合物或其组合而产生的针对疾病或病况的部分或完全反应，其导致比已暴露于疾病或感染的未经免疫个体所预计较不有害的效应。即，在经疫苗接种个体中减轻感染有害作用的严重程度。在经疫苗接种个体中可减少、减慢或可能完全预防感染。在本文中，在意指完全预防感染的情况下，将特别指出。若未指出为完全预防，则该术语包括部分预防。
术语“中和抗体”是指通过中和或抑制其生物效应能保持传染原、通常病毒、例如pedv或cdv免于感染细胞的抗体。中和可在抗体结合至特异性病毒抗原时发生，从而阻断病原体进入其宿主细胞。在一个实例中，其预防病毒结合至其受体且获取细胞内的其遗传物质。
如本文所用术语“抗体”或“免疫球蛋白”在本文中可互换使用，包括全抗体及其任何抗原结合片段(抗原结合部分)或单链同源物。“抗体”包含至少一条重(h)链及一条轻(l)链。在天然igg中，例如，该等重链及轻链由二硫键互连且存在两条成对重链及轻链，该两条链由二硫键互连。每一重链包括重链可变区(本文中缩写为vh)及重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域，即ch1、ch2及ch3。每一轻链包括轻链可变区(本文中缩写为vl)及轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域cl。vh及vl区可细分成超变区，称为互补决定区(cdr)，散布有更保守的区，称为框架区(fr)或接合(j)区(在重链及轻链中分别为jh或jl)。每一vh及vl由三个cdr、三个fr及一个j结构域构成，其自氨基末端至羧基末端以如下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、j。重链及轻链的可变区与抗原结合。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)或体液性因子，例如典型补体系统的第一组分(clq))的结合。
在本文中，“临床征象的发生率和/或严重程度的降低”或“临床症状的减少”意指(但不限于)与野生型感染相比，减少组中感染个体的数量、减少或消除展现感染的临床征象的个体的数量、或降低一或多个个体中存在的任何临床征象的严重程度。举例而言，其应该指病原体负荷的任何减少、病原体脱落、病原体传播减少或疾病(例如猪流行性腹泻或疟疾)的症状的任何临床征象减少。优选地，与未接受该组合物且被感染的个体相比，在接受本发明治疗组合物的一或多个个体中该等临床征象减少至少10％。更优选地，接受本发明组合物的个体的临床征象减少至少20％、优选至少30％、更优选至少40％且甚至更优选至少50％。
术语“增加的保护”在本文中意指(但不限于)相对于未接种疫苗的个体对照组，接种疫苗的个体组中与由传染原感染相关的一或多种临床症状在统计学上显著减轻。术语“临床症状的统计学显著减轻”意指(但不限于)接种疫苗的个体组的至少一种临床症状的发病频率比在用传染原攻击后未接种疫苗的对照组中低至少10％、优选20％、更优选30％、甚至更优选50％且甚至更优选70％。
“持久保护”将指持续至少3周、但更优选至少3个月、仍更优选至少6个月的“改良的效能”。在牲畜的情形下，最优选地，持久保护应持续直至动物出售用于肉类的平均年龄。
术语由病毒诱导的“病毒血症的减轻”意指(但不限于)进入动物血流的病毒减少，其中与未接受本发明组合物且可被感染的动物相比，接受该组合物的动物的血清中的病毒血症程度、即每毫升血清的病毒dna或rna拷贝数或每公合血清的噬菌斑形成菌落数减少至少50％。更优选地，接受本发明组合物的动物的病毒血症程度降低至少90％、优选至少99.9％、更优选至少99.99％、且甚至更优选至少99.999％。
如本文所用术语“病毒血症”具体而言应理解为病毒颗粒在动物、具体而言哺乳动物、鸟或昆虫的血流中复制和/或循环的病况。
“安全性”是指在疫苗接种后，在接种疫苗的动物中不存在不良后果，包括但不限于：基于病毒的疫苗潜在地逆转成有毒力、临床上显著的副作用，例如持久性、全身性疾病或在疫苗施用位点不可接受的发炎。
如本文所用术语“疫苗接种”(“vaccination”或“vaccinating”)或其变化形式意指(但不限于)包括施用本发明的免疫原性组合物的过程，在施用动物时，其引发或能够引发(直接或间接)该动物的免疫反应。
在本发明上下文中，“死亡率”是指由感染引起的死亡，且包括感染如此严重以致于将动物安乐死以防止痛苦并为其生命提供人道结局的情况。
调配物
施用组合物的个体优选是动物，包括(但不限于)牛、马、绵羊、猪、家禽(例如鸡)、山羊、猫、狗、仓鼠、小鼠及大鼠，最优选哺乳动物是猪。
本发明的调配物包含有效免疫量的一或多种免疫原性组合物及生理上可接受的媒剂。疫苗包含有效免疫量的一或多种免疫原性组合物及生理上可接受的媒剂。调配物应适合于施用方式。
免疫原性组合物(若需要)亦可含有极少量的润湿剂或乳化剂或ph缓冲剂。免疫原性组合物可为液体溶液、悬浮液、乳液、锭剂、丸剂、胶囊、持续释放调配物或粉末。经口调配物可包括标准载剂，例如医药级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
治疗方法
优选施用途径包括(但不限于)鼻内、经口、真皮内及肌内。最优选呈单一剂量的于饮用水中施用是合意的。本领域技术人员将认识到，本发明组合物亦可以一个、两个或更多个剂量通过其他施用途径来施用。举例而言，该等其他途径包括皮下、皮内、腹膜内，且根据治疗的期望持续时间及有效性，本发明组合物可以例如每日计一次或若干次、亦间歇地以不同剂量(例如约103至108tcid50(参见上述病毒效价))施用若干天、若干周或若干月。在本发明的具体方面中，剂量是约103至108tcid50，尤其对于活病毒/活疫苗。
若期望，组合物可在包装或分配器装置中呈递，该包装或分配器装置可含有一或多个含有活性成分的单位剂型。包装可(例如)包含金属或塑料箔，例如泡罩包装。该包装或分配器装置可附有施用说明书，优选施用哺乳动物、尤其猪。该(等)容器可附带有监管医药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构所规定形式的公告，该公告显示该机构已批准用于人类施用的制造、使用或销售。
实例
包括以下实例以展现本发明的优选实施例。本领域技术人员应了解，下列实例中揭示的技术代表本发明者发现在实践本发明中运行良好的技术，且因此可认为构成其实践的优选方式。然而，本领域技术人员借助于本揭示内容应了解，可对所揭示具体实施例作出多种改变且仍获得相同或类似结果，此并不背离本发明的精神及范畴。
实例1：由重组cdv载体的pedv-s表达
在活体外实验中，使用sacii内核酸酶消化衍生自莱德利疫苗株(莱德利；atccvr-128)的编码全cdv基因组的全质粒(pbr322)，然后克隆编码p基因与m基因之间的盒的pedv刺突(s)蛋白(产生包含seqidno:14的序列)。在克隆及拯救重组cdv-pedv-s时，可在cdv相关的荧光灶中显示2b基因型的猪流行性腹泻病毒刺突蛋白的表达。对于相应cdv载体(即，仅编码2a基因型的猪流行性腹泻病毒刺突蛋白的序列seqidno:15不同)亦达成各别结果。通过免疫荧光获得的两种载体的结果指示，pedv的刺突蛋白在所有cdv感染的合胞体中皆强烈表达(数据未显示)。
实例2：疫苗效能研究
猪流行性腹泻(ped)是高度传染性的猪疾病，其可具有巨大的经济影响。尽管所有年龄段的猪皆易受感染，但严重临床征象及死亡率主要见于哺乳的仔猪。致病因子是ped病毒(pedv)，其是冠状病毒科病毒家族中α冠状病毒属的包膜单正链rna病毒。在欧洲，pedv首先在1970年代后期在英格兰发生。之后，其传播到整个欧洲，引起散发性爆发。在1990年代后期，pedv已自欧洲猪场中消失，如由极低的血清流行病学及不存在疾病报告所证明。仍然自亚洲报导爆发及地方性感染，在亚洲，该疾病对工业化猪场的生产力具有高度影响。自2005年开始，再次自欧洲、即意大利报导ped病例。在2013年将看似高度毒力的pedv引入美国后，自中欧、包括德国及邻国亦报导了病例。后一情况是由相关但不同的pedv株(所谓s-indel株)引起。在德国，自2014年5月开始报导病例，哺乳猪发病率高且致死率可变。
此研究(其中在p基因与m基因之间插入seqidno:4的序列(编码pedv刺突蛋白)的源自莱德利疫苗株(参见实例1)的cdv主链(因此，载体包含seqidno:8的序列)作为载体疫苗(下文分别称为“cdv_pedv-刺突疫苗”或“cdvpedv-刺突载体疫苗”)进行了测试)包括六头母猪及其后代。
通过靶向s基因及pedv特异性抗体的rt-qpcr检查所有动物。该研究仅入选阴性动物。
三个治疗组(参见下文)接受随机分配的动物：
-组1(阴性对照)：两头母猪(命名为1号及2号)，未接种疫苗
-组2(阳性对照)：两头母猪(命名为3号及4号)，未接种疫苗
-组3(cdv_pedv-刺突)：两头母猪(命名为5号及6号)，疫苗接种cdv_pedv-刺突载体疫苗。
根据以下方案进行组3的两头母猪的疫苗接种，其中通过终点滴定法定义的cdv_pedv-刺突疫苗的原液效价为7.94×104tcid50/ml：
预期分娩日期之前9周：两头母猪中的每一者鼻内接受4ml疫苗(每个鼻孔各2ml)；
预期分娩日期之前6周：两头母猪中的每一者鼻内接受4ml疫苗(每个鼻孔各2ml)；
预期分娩日期之前3周：两头母猪中的每一者鼻内接受4ml各别疫苗(每个鼻孔各2ml)，且另外肌内接受2ml。
对组1的母猪所生的仔猪(1号母猪的13头仔猪及2号母猪的12头仔猪)进行了经口模拟接种。用pedv野生株(下文称为“pedveu”)攻击4日龄的组2母猪所生的仔猪(3号母猪的12头仔猪及4号母猪的14头仔猪)及组3母猪所生的仔猪(5号母猪的5头仔猪及6号母猪的15头仔猪)。
对于组2及组3的仔猪的接种，使用细胞培养适应的pedveu。效价为2.15×105tcid50/ml。经口接种组2及组3的仔猪。在此情形中，使用2ml注射器，每一仔猪接受1ml1:10稀释的病毒原液(效价2.15×104tcid50)。
使用2ml注射器中的1ml细胞培养基对组1的仔猪进行经口模拟接种。
在整个试验期间，在接种当天及接种后(pi)第1至10天以及所有动物的pi第14、17及20/21天时，取直肠拭子(无培养基的copan普通拭子)，进行rt-qpcr分析。在接种前及攻击后两天，自每一母猪的4头仔猪取额外直肠拭子进行细菌学检查。此外，每天使用确立的标准化累积评分系统记录指示ped的临床征象(参见下文)。在接种当天及pi第14天及20/21天(试验结束)或各别动物安乐死或死亡当天取血样。
临床监测
使用确立的累积临床评分每日监测指示ped的临床征象(参见下表)。
表1：指示ped的临床征象的累积临床评分
样品制备及核酸提取
将直肠拭子浸入1ml杜贝克氏改良的鹰氏培养基(dulbecco'smodifiedeaglemedium)中，并在室温培育1小时。使用qiampviralrnaminikit(qiagen)或nucleomagvet-kit与kingfisher提取平台的组合提取病毒rna。将rna储存于-20°度下直至进一步使用。
将血样在室温下以2031xg离心20min以获得血清。将所得血清分成等份且储存于-20℃下。
病毒检测
为了检测pedv脱落，如先前所述使用靶向pedv的s基因的rt-qpcr系统(stadler等人，bmcvetres.11:142(2015))。测试在dpi第0至7天以及dpi10及20/21时获取的样品的pedv基因组。使用内部标准物计算基因组拷贝数/μl。
抗体检测
根据制造商的手册，对所有血清实施商业间接elisa(ingezimpedv,ingenasa,madrid,spain)。
细菌学
在0及2dpi取每窝四头仔猪的粪便拭子以用于不同的细菌学。
统计学
使用shapiro-wilk测试进行正态性测试，且按照在软件包中所实施执行mann-whitney秩和测试。使用sigmaplot软件测试统计显著性。
结果
血清中的抗体检测：
由于摄入抗体阳性的初乳，在攻击接种之前，cdv组的所有仔猪在elisa(检测抗pedv刺突蛋白的抗体)中皆显示阳性结果，而阳性及阴性对照组的所有动物皆显示明显阴性结果。
在14dpi，阳性对照组中除三头仔猪外所有皆被血清转化，而疫苗组中的所有动物在血清样品中仍显示高量的pedv特异性igg。
在研究结束时，cdv组及阳性对照组的所有仔猪皆在elisa中显示强烈阳性结果。在整个试验期间，阴性对照中的动物无一血清转化。
在进一步的研究中，亦观察到当母猪仅经由鼻内途径接种疫苗两次时，同样获得各别抗体结果。
细菌学：
在0及2dpi获取的粪便拭子未显示任何病原体细菌。细菌菌群在感染后未经历明显变化。
临床征象：
阳性对照组(组2)的仔猪清楚地显示指示pedv的临床征象，24hpi在7天内以呕吐开始，之后腹泻。26头仔猪中有8头因严重脱水及临床评分值超过6(人道终点)而被安乐死。指示pedv的首批临床征象在36hpi时可检测。
cdv载体接种疫苗及pedv攻击的仔猪(组3)的临床征象关于一般行为整体上更优选，且组3中20头中仅2头(10％)猪因严重脱水及临床评分值超过6而必须被安乐死(与的相比，组2的31％仔猪)。
阴性对照中的动物在整个试验期间保持健康。
病毒的脱落
在经攻击的组之间可检测到病毒脱落的明显差异。在1dpi，所有经攻击仔猪的直肠拭子中的病毒基因组皆呈阳性，但cdv-pedv接种疫苗组中的动物所显示的pedv基因组拷贝数(平均ct值32,79)显著低于攻击组(平均ct值26,65)。
同时，在pi的接下来的五天中，cdv组的直肠拭子中的基因组负荷与阳性对照极为相似，在7dpi开始，病毒基因组的可检测量下降至低于受接种疫苗的母猪保护的仔猪中的截止值，而阳性对照组中的所有动物仍脱落pedv。
在阴性对照组的拭子中不能检测到pedv基因组。
总之，该研究的结果是，与阳性对照相比，疫苗接种cdvpedv-刺突重组疫苗的母猪所生的仔猪显示临床征象减少，且具体而言关于仔猪的死亡率/致死率观察到很大改善。此外，pedv攻击后的病毒脱落显著减少。
此外，实施对应于上述疫苗效能研究的动物研究，其中施用在p基因与m基因之间具有seqidno:17的编码pedv刺突蛋白的插入物的源自莱德利疫苗株(参见实例1)的cdv主链两次(分娩前5周及分娩前2周)，且其中使用高毒力基因型2apedv野生株进行攻击。与攻击对照相比，疫苗接种此重组疫苗的母猪所生的仔猪显示死亡率降低或临床征象减少。
实例3：
此动物研究(其中在p基因与m基因之间具有编码seqidno:15的编码pedv刺突蛋白的插入物的源自莱德利疫苗株(参见实例1及2)的cdv主链作为载体疫苗(下文分别称为“cdv_pedv-g2a疫苗”或“cdvpedv-g2a刺突载体疫苗”)进行了测试)包括20(20)头母猪及其后代。
仅入选通过qrt-pcr及elisa被认为呈pedv阴性的动物。
三个治疗组(参见下文)接受随机分配的动物：
组1(严格阴性对照)：四头母猪(命名为1-4)，未接种疫苗；
组2(攻击对照)：八头母猪(命名为5-12)，未接种疫苗；
组3(cdv_pedv-g2a-刺突)：八头母猪(命名为13-20)，疫苗接种cdvpedv-g2a-刺突载体疫苗。
组3的8头母猪的疫苗接种是在研究的分娩前5周(do)及分娩前2周(d21)进行，其中由终点滴定定义的cdv_pedv-g2a刺突疫苗的原液效价为2,57×105tcid50/ml。每次接种疫苗时，母猪鼻内接受4ml疫苗(每个鼻孔2ml)。
组1的母猪所生的仔猪(总共41头仔猪)未经攻击(严格对照)。以剂量2.0×103tcid50/2ml剂量(1ml鼻内+1ml经口)用属g2a基因型的高毒力pedv野生株口服攻击3-7日龄的组2的母猪所生的仔猪(总共81头仔猪)及组3的母猪所生的仔猪(总共83头仔猪)。
在整个试验期间，在接种前一天及pi第1、3、7及14天(攻击后病毒接种)获取直肠拭子。
样品制备及核酸提取
收集后将直肠拭子浸入2ml最低必需培养基(mem)中，并在处理前储存于-70℃下。通过涡旋10秒、之后于4℃下以1,500xg离心10分钟处理样品。处理后，使用具有biosprintone-for-allvetkit(qiagen)的bs96vet100biosprint提取平台使用100μl/样品进行病毒rna提取。将rna储存于-20°度下直至进一步使用。
将血样在室温下以1960xg离心10min以获得血清。将所得血清分成等份且储存于-70℃下。
病毒检测
为了检测pedv脱落，使用靶向pedv的s基因的内部衍生的rt-qpcr系统：定量的一步rt-pcr试剂盒(itaquniversalone-steprt-pcr试剂盒；biorad，目录号1725140)。在含有2μl提取的总核酸、0.75μl探针(4μm)、0.5μl每一引物(10μm)、12.5μl2xrt-pcr混合物、0.5μliscript反转录酶及8.25μldepc处理的水的25μl反应物中实施实时rt-pcr。关于引物、探针及终结器(ultramer)序列，参见下表2。反应是在以下条件下使用cfx96实时pcr检测系统(biorad)进行：在50℃初始反转录30min，之后在95℃下初始变性5min，在95℃下进行40个循环的变性达15s并在57℃下退火及延伸30s。为了生成定量数据，每次运行包括pedv终结器(integrateddnatechnologies)。将冻干的终结器(4nmol)重新悬浮于depc处理、无核酸酶的无菌水中，以生成1.0e+10个基因组拷贝/μl(gc/μl)的原液浓度。自原液终结器，在depc处理的水中制备1.0e+08至1.0e+01的10倍连续稀释液。在使用前通过qubitdsdnahs分析确认浓度。使用cfxmanager软件分析光学数据。对于每一测定，使用循环临界值(ct)测定模式的消退设置自动计算临界线。使用扣除基线的模式自动进行基线扣除。人工校正基线最终值小于10的曲线。
表2：用于内部衍生的rt-qpcr系统的探针(pr)、引物(f/r)及终结器序列。
抗体检测
使用内部研发的ccif分析测试该研究的血清及乳样品：将野生型pedv分离株(基因组2a)1:100稀释至pedv生长培养基(mem+2.5％hepes+0.3％磷酸胰蛋白酶肉汤+0.02％酵母+10μg/ml胰蛋白酶)中。将稀释的病毒(100μl/孔)接种至两天大的装有vero细胞的96孔板上。在感染之前，将细胞生长培养基自板中移出，并将其用100μlpedv生长培养基洗涤两次。将板在37±2℃+co2(4-6％)下培育24小时。培育后，弃去上清液，且将板用200μl/孔的1xpbs洗涤两次。为了固定，添加200μl/孔的乙醇。将板在室温下培育30分钟，风干，然后储存于-20℃下直至使用。在用于分析中之前，将板在室温下用200μl/孔的1xpbs(gibco)再水合10min，且在37℃下用100μl/孔的缓冲液(1xpbs+1％正常山羊血清+0.1％tritonx)封阻15分钟。在含有pedvmab抗体(mediandiagnostics)的1:1000稀释液的稀释缓冲液(1xpbs+5％bsa+1％正常山羊血清+0.1％titron-x100)中制备血清样品的连续两倍稀释液。将稀释的样品(50μl/孔)添加至制备的板中，且在37℃下培育1小时。培育后，将板用200μl/孔的1xpbs洗涤3次。然后向每一板中添加总共50μl/孔的稀释的二级抗体[alexa594山羊抗小鼠igg(fisher，1:500稀释)；fitc标记的山羊抗猪igg(biorad，1:500稀释)；hoechst33342(fisher，1:1000稀释)且在37℃下培育1小时。培育后，将板用200μl/孔的1xpbs洗涤3次。观察到荧光，其中mab3f12结合的pedv感染的细胞显示特定的红色荧光。绿色荧光的共定位指示猪igg的结合。检测到特定绿色荧光的最高稀释度相当于igg效价。
结果
死亡率
在组1(严格对照)中存活40头猪，在组2(攻击对照)中存活16头猪，而在组3(疫苗接种cdv-pedv-g2a刺突)中存活34头猪，平均死亡率为2％(组1)、80％(组2)及59％(组3)。
抗体反应
攻击后的特异性pedv抗体反应揭示，cdv-pedv-g2a刺突接种疫苗组中母猪血清及乳汁中ccifigg抗体效价的平均值高于组2(攻击对照)。此指示，接种疫苗的母猪在接触来自攻击后受感染仔猪的病毒后通过提高乳汁及血清中的igg含量而强烈反应。与此相比，仅经由与经攻击的仔猪(及其粪便)接触而pedv感染所产生的攻击对照的母猪的抗体效价显著较低。
病毒的脱落
在攻击病毒接种后的第3天，在接种疫苗及未接种疫苗组中检测到相对相似的平均rna负荷，对于cdv-pedv-g2a刺突接种疫苗组及攻击对照组分别达到9.2及9.8组平均log10pedv基因组拷贝。在d48(7dpi)及d55(14dpi)，cdv-pedv-g2a刺突接种疫苗组中的平均log10pedv基因组拷贝数分别为3.2及2.0log10，而在攻击对照组中分别为5.5及3.9log10，指示在pi第7及14天分别减少2.3及1.9log。尽管未实施更长期的脱落监测，但根据上述实例4下所述的结果，在攻击病毒接种后第7天及第14天观察到的脱落的动力学的趋势明确指示，接种疫苗的动物的脱落时间缩短。
在严格阴性对照组的拭子中不可检测到pedv基因组。
总之，该研究的结果是，在经高毒力pedv株攻击时，与对照组的仔猪相比，由疫苗接种cdvpedv-g2a刺突重组疫苗的母猪所生或哺育的仔猪显示死亡率显著降低。而且，在产后最初几天经由母源抗体的转移自乳汁中接受pedv保护性igg抗体的该等仔猪揭示，在感染后第7天及第14天攻击后病毒脱落显著减少，此是重要的流行病学参数。
根据本揭示内容无需过多实验即可获得并实施本文所揭示及主张的所有组合物及方法。尽管本发明的组合物及方法已根据优选实施例予以阐述，但本领域技术人员应明了，可改变该等组合物及方法及本文所述方法的步骤或步骤的顺序，此并不背离本发明的概念、精神及范围。更特定而言，应明了，某些在化学及生理上均相关的试剂可代替本文所述试剂且同时可达成相同或类似结果。本领域技术人员显而易见的所有该等类似替代物及修改皆被视为涵盖于由随附申请专利范围所界定的本发明精神、范围及概念内。
本文亦揭示以下方案：
1.一种犬瘟热病毒(cdv)载体，其包含所关注的异源核苷酸序列，其中该所关注的异源核苷酸序列编码猪流行性腹泻病毒(pedv)抗原。
2.如方案1的cdv载体，其中该pedv抗原是选自由pedv刺突(s)蛋白及pedv核蛋白(n蛋白)组成的群。
3.如方案1或2的cdv载体，其中该pedv抗原是pedvs蛋白，且其中该pedvs蛋白优选地包含与seqidno:1或seqidno:2的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成。
4.如方案1至3中任一项的cdv载体，其中该pedv抗原是pedvs蛋白，且其中该pedvs蛋白优选地包含与seqidno:16或seqidno:17的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成。
5.如方案1至4中任一项的cdv载体，其中该所关注的异源核苷酸序列编码pedvs蛋白，且其中该所关注的异源核苷酸序列由与seqidno:3至5中的任一者的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列组成或包含该rna序列。
6.如方案1至5中任一项的cdv载体，其中该所关注的异源核苷酸序列是所关注的rna序列。
7.如方案1至6中任一项的cdv载体，其中
-该所关注的异源核苷酸序列位于cdv的p基因与m基因之间；和/或
-该所关注的异源核苷酸序列是所关注的异源rna序列，且其中该异源rna序列可操作地连接至位于该异源rna序列的3′方向上的基因起始(gs)序列和/或cdv的基因组启动子。
8.如方案7的cdv载体，其中该gs序列包括于cdv的基因的外源3′非编码区中，且其中cdv的基因的该外源3′非编码区优选地侧接该所关注的异源rna序列的3′端。
9.如方案1至8中任一项的cdv载体，其包含与seqidno:6或seqidno:7的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列。
10.如方案1至9中任一项的cdv载体，其包含与seqidno:8的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列。
11.如方案1至10中任一项的cdv载体，其进一步包含由与seqidno:9的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列组成或包含该rna序列的rna序列，且其中该rna序列侧接与seqidno:8的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列的5′端。
12.如方案1至11中任一项的cdv载体，其进一步包含由与seqidno:10的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列组成或包含该rna序列的rna序列，且其中该rna序列侧接与seqidno:8的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rna序列的3′端。
13.一种核酸分子，其编码前述方案中任一项的cdv载体，且其中该核酸分子优选是dna分子。
14.如方案13的dna分子，其中该分子包含编码pedv刺突(s)蛋白的dna序列，且其中该序列优选是与seqidno:11或seqidno:12的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的dna序列。
15.一种dna分子、具体而言如方案13或14的dna分子，其中该分子包含与seqidno:13的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的dna序列。
16.一种dna分子、具体而言如方案13至15中任一项的dna分子，其中该分子包含与seqidno:14的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的dna序列。
17.一种哺乳动物宿主细胞，其含有如前述方案中任一项的cdv载体或核酸分子或dna分子。
18.如前述方案中任一项的cdv载体或核酸分子，其用作药剂、优选地用作疫苗。
19.一种dna构建体，其包含如方案13至18中任一项的dna分子。
20.一种如方案19的dna构建体的rna转录物。
21.一种经如方案19的dna构建体转染的细胞。
22.一种经如方案20的rna转录物转染的细胞。
23.一种制备含有异源基因的感染性cdv、具体而言制备如方案1至12中任一项的cdv载体的方法，其中该方法包含以下步骤：
a.提供表达异源rna聚合酶的宿主细胞；
b.用如方案19的dna构建体转染该宿主细胞，且其中该dna分子由该异源rna聚合酶转录，及
c.分离由该等细胞产生的病毒。
24.一种如方案1至12中任一项的载体或如方案17、21及22中任一项的细胞的用途，其用于制造免疫原性组合物或疫苗。
25.一种免疫原性组合物，其包含：
如方案1至12中任一项的cdv载体，其中该载体可选地是感染性和/或减毒病毒，或该载体可选地是减毒和/或经修饰的活病毒，及可选地
由该载体表达的重组蛋白和/或包含多个由该载体表达的重组蛋白的四级结构，及可选地
医药或兽医上可接受的载剂或赋形剂，其中该载剂优选适于经口、真皮内、肌内或鼻内施加。
26.如方案25的免疫原性组合物，其中由该载体表达的该重组蛋白是-pedvs蛋白，或
-pedvn蛋白。
27.如方案25或26的免疫原性组合物，其包含以下或由以下组成：
如方案1至12中任一项的cdv载体，及
由该载体表达的重组蛋白，其中由该载体表达的该重组蛋白是pedvs蛋白或pedvn蛋白，及可选地
医药或兽医上可接受的载剂或赋形剂，其中该载剂优选适于经口、真皮内、肌内或鼻内施加。
28.如方案25至27中任一项的免疫原性组合物，其中由该载体表达的该重组蛋白是pedvs蛋白。
29.如方案25至28中任一项的免疫原性组合物，其中由该载体表达的该重组蛋白是包含与seqidno:1或seqidno:2的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成的pedvs蛋白。
30.如方案25至29中任一项的免疫原性组合物，其中由该载体表达的该重组蛋白是包含与seqidno:16或seqidno:17的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成的pedvs蛋白。
31.一种疫苗或医药组合物，其包含
a.如方案1至12中任一项的载体，及
b.由该载体表达的重组蛋白和/或包含多个由该载体表达的重组蛋白的四级结构，及
c.医药上或兽医上可接受的载剂或赋形剂，优选地，该载剂适于鼻内施加，及
d.该疫苗可选地进一步包含佐剂。
32.如方案31的疫苗或医药组合物，其中由该载体表达的该重组蛋白是pedvs蛋白或pedvn蛋白。
33.如方案31或32的疫苗或医药组合物，其中由该载体表达的该重组蛋白是pedvs蛋白，且其中该pedvs蛋白优选地包含与seqidno:1或seqidno:2的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成。
34.如方案31至33中任一项的疫苗或医药组合物，其中由该载体表达的该重组蛋白是pedvs蛋白，且其中该pedvs蛋白优选地包含与seqidno:16或seqidno:17的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成。
35.如方案31至34中任一项的疫苗或医药组合物，其包含以下或由以下组成：
a.如方案1至12中任一项的cdv载体，及
b.由该载体表达的重组蛋白，其中该重组蛋白包含如下氨基酸序列或由其组成：包含与seqidno:1或seqidno:2的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成，及
c.医药或兽医上可接受的载剂或赋形剂，优选地该载剂适于经口、真皮内、肌内或鼻内施加，
d.及可选地佐剂。
36.如方案31至35中任一项的疫苗或医药组合物，其包含以下或由以下组成：
a.如方案1至12中任一项的cdv载体，及
b.由该载体表达的重组蛋白，其中该重组蛋白包含如下氨基酸序列或由其组成：包含与seqidno:16或seqidno:17的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成，及
c.医药或兽医上可接受的载剂或赋形剂，优选地该载剂适于经口、真皮内、肌内或鼻内施加，
d.及可选地佐剂。
37.一种制备用于降低与感染相关或由感染引起的一或多种临床征象的发病率或严重程度的免疫原性组合物或疫苗的方法，该方法包含以下步骤：
a.用如方案1至12中任一项的载体感染哺乳动物宿主细胞，
b.在适宜条件下培养该等感染的细胞，
c.收集感染的细胞培养物，
d.可选地纯化步骤c)的该等收集的感染的细胞培养物，
e.可选地混合该等收集的感染的细胞培养物与医药上可接受的载剂。
38.如方案37的方法，其中该免疫原性组合物或该疫苗降低与猪流行性腹泻病毒(pedv)感染相关或由其引起的一或多种临床征象的严重程度。
39.如方案25至30中任一项的免疫原性组合物或如方案31至36中任一项的疫苗或医药组合物，其用于减少或预防动物中由pedv感染引起的临床征象或疾病或用于治疗或预防动物的pedv感染的方法中，且其中该动物优选是猪。
40.如方案25至30中任一项的免疫原性组合物或如方案31至36中任一项的疫苗或医药组合物，其用于诱导猪、具体而言优选地怀孕母猪中抗pedv的免疫反应的方法中。
41.如方案25至30中任一项的免疫原性组合物或如方案31至36中任一项的疫苗或医药组合物，其用于减少或预防仔猪中由pedv感染引起的临床征象或疾病的方法中，其中该仔猪欲由已施用该免疫原性组合物的母猪哺育。
42.如方案41的免疫原性组合物，其中已施用该免疫原性组合物的该母猪是在该母猪怀孕、具体而言怀有该仔猪的同时已施用该免疫原性组合物的母猪。
43.如方案25至30中任一项的免疫原性组合物或如方案31至36中任一项的疫苗或医药组合物，其根据方案39至42中任一项使用，其中该免疫原性组合物或该疫苗或医药组合物欲经黏膜、优选地鼻内施用。
44.如方案25至30中任一项的免疫原性组合物或如方案31至36中任一项的疫苗或医药组合物，其根据方案40至43中任一项使用，其中该免疫原性组合物或该疫苗或医药组合物欲经黏膜、优选地鼻内施用该母猪。
45.一种对个体进行免疫的方法，其包含向该个体施用如方案25至30中任一项的免疫原性组合物或如方案31至36中任一项的疫苗或医药组合物。
46.一种对猪进行免疫抗该动物中由至少一种病原体引起的临床疾病的方法，该方法包含向该动物施用如方案25至30中任一项的免疫原性组合物或如方案31至36中任一项的疫苗或医药组合物的步骤，其中该免疫原性组合物或疫苗不能引起感染的临床征象，但能诱导对该动物进行免疫抗该至少一种病原体的病原体形式的免疫反应。
47.如方案46的方法，其中该至少一种病原体是pedv。
48.一种诱导在母猪中产生对pedv具有特异性的抗体的方法，其中该方法包含向该母猪施用如方案25至30中任一项的免疫原性组合物或如方案31至36中任一项的疫苗或医药组合物。
49.一种减少或预防仔猪的由pedv感染引起的临床征象或疾病的方法，其中该方法包含
-向母猪施用如方案25至30中任一项的免疫原性组合物或如方案31至36中任一项的疫苗或医药组合物，及
-使该仔猪由该母猪哺育。
50.如方案49的方法，其中该母猪是怀孕、具体而言怀有该猪的母猪。
51.如方案49或50的方法，其包含以下步骤
-向怀有该仔猪的母猪施用如方案25至30中任一项的免疫原性组合物或如方案31至36中任一项的疫苗或医药组合物，
-使该母猪生出该仔猪，及
-使该仔猪由该母猪哺育。
52.一种降低仔猪中由pedv感染引起的死亡率的方法，其中该仔猪欲由已施用如方案25至30中任一项的免疫原性组合物的母猪哺育。
53.如方案45至52中任一项的方法，其中该免疫原性组合物或该疫苗或医药组合物经黏膜、优选地鼻内施用该母猪。
54.如方案45至53中任一项的方法，其中该免疫原性组合物或该疫苗或医药组合物施用该母猪两次。
55.如方案45至54中任一项的方法，其中该免疫原性组合物或该疫苗或医药组合物经黏膜施用该母猪两次、优选地鼻内施用该母猪两次。
56.一种在猪中诱导抗pedv的免疫反应或对猪进行接种疫苗抵抗猪中与pedv相关的疾病和/或降低与pedv相关或由pedv引起的一或多种临床征象的发病率或严重程度的试剂盒，其包含：
a)能够具体而言经由鼻内途径向该猪施用疫苗的注射器或分配器；及
b)如方案25至30中任一项的免疫原性组合物或如方案31至36中任一项的疫苗，及
c)可选地说明书手册。
序列概述
在本发明中于本文中详述且揭示以下序列，其中序列表中的核苷酸序列自左至右在5’端至3’端方向上提供，且其中：
seqidno:1对应于pedvs蛋白(衍生自基因型2bpedv)的氨基酸序列，
seqidno:2对应于pedvs蛋白(衍生自基因型2apedv)的氨基酸序列，
seqidno:3(rna)对应于编码pedvs蛋白(衍生自g2bpedv)的序列，
seqidno:4(rna)对应于具有第二终止密码子的又一序列的seqidno.3的序列(以满足“六规则”)，
seqidno:5(rna)对应于编码pedvs蛋白(衍生自基因型2apedv)的序列，
seqidno:6(rna)对应于包含seqidno:4的序列的表达盒，
seqidno:7(rna)对应于包含seqidno:4的序列的表达盒，
seqidno:8(rna)包含seqidno:6和/或seqidno:7的序列，
seqidno:9(rna)对应于包含cdv的m、f、h及l基因的序列，
seqidno:10(rna)对应于包含cdv的n及p基因的序列，
seqidno:11对应于seqidno:3的dna反向补体，
seqidno:12对应于seqidno:4的dna反向补体，
seqidno:13对应于seqidno:8的dna反向补体，
seqidno:14对应于包含seqidno:13的序列的dna序列，
seqidno:15对应于由seqidno:5编码的pedvs蛋白的氨基酸序列，
seqidno:16对应于pedvs蛋白(衍生自基因型2apedv)的氨基酸序列，
seqidno:17对应于pedvs蛋白(衍生自基因型2apedv)的氨基酸序列，
seqidno:18-21：探针、引物及ultramer序列(表2)。
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<160>21
<170>patentin版本3.5
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