小柴胡颗粒在抑制甲型流感病毒中的新应用的制作方法

本发明属于中成药领域，尤其涉及一种中药组合物—小柴胡颗粒在抑制流感甲型病毒中的新应用。
背景技术：
：流感病毒属于正粘病毒科，分为甲、乙、丙三型。其中，甲型流感对人类致病性高，曾多次引起世界性大流行，造成数千万人死亡。甲型流感病毒根据h和n抗原不同，又分为许多亚型，h可分为18个亚型(h1～h18)，n有11个亚型(n1～n11)。其中仅h1n1、h2n2、h3n2主要感染人类，其它许多亚型的自然宿主是多种禽类和动物。具有高致病性的h5n1、h7n7、h7n9、h9n2等禽流感病毒，一旦发生变异而具有人与人的传播能力，会导致人间禽流感流行，对人类具有很大的潜在威胁。人体感染流感病毒会具有不同程度的全身症状及咳嗽、鼻塞、流涕等局部症状，对于老年人、儿童和有潜在健康问题的人来说，容易有合并并发症甚至致命的危险。最近的研究表明，流感病毒感染机体后诱导宿主细胞产生氧化应激，产生大量活性氧自由基(ros)，从而引起肺炎性肺组织损伤。自由基是具有不配对电子的分子、原子、离子或原子团，为了使自己变得稳定，自由基会很活跃地夺取其它原子或分子的电子。如果自由基的产生和清除之间的平衡被打破了，自由基便会对机体造成损伤。流感病毒入侵机体会诱发大量氧自由基的产生，如：过氧化氢、羟自由基、单线态氧等。同时激活巨噬细胞产生大量一氧化氮(no)自由基反应生成过氧亚硝酸盐。两者共同造成氧化应激水平升高，造成机体局部损伤并导致全身免疫应答功能下降，使病毒复制能力增强，也使生物膜的脂质受到过氧化损伤，从而导致肺组织损伤。由此可见，流感病毒感染机体以后，自由基是机体损伤的主要参与者。因此，清除流感病毒所致的过量自由基，对机体保护和治疗流感有着十分重要的意义。小柴胡汤为中医八大名方之一，系医圣张仲景所著《伤寒杂病论》中少阳病的代表性方剂。小柴胡颗粒系广州白云山光华制药依据小柴胡汤首家研制而成的颗粒型中成药制剂，活性成分由柴胡、黄芩、姜半夏、党参、生姜、甘草、大枣七味中药组成，具有解表散热，疏肝和胃的功效，用于外感病，邪犯少阳证。自上市以来，小柴胡颗粒疗效好，受到众多医生、患者的认可，有着很好的市场竞争力和社会效益。2020年小柴胡颗粒更被列入《广东省新型冠状病毒肺炎中医药治疗方案(试行第二版)》。最新临床研究表明，用于治疗新型冠状病毒肺炎的洛匹那韦、利托那韦(克力芝)、阿比多尔在改善临床症状和加速病毒清除方面均未优于对照组，疗效不显著。这可能是由于肺炎类疾病是一个多系统紊乱的复杂疾病，仅仅通过主动进攻病毒来治疗疾病的效果不好，而利用中医药的优势，在抗击感染时结合抗炎、抗病毒或等其他机制的防守性治疗或许可以取得较好的疗效。目前，已有报道证实小柴胡汤对甲型流感病毒h1n1亚型、h7n9亚型具有抑制作用，但其与自由基的清除是否相关、具体机制如何，这些问题尚不清楚。至于针对其他亚型是否有效，以及哪些亚型确实具有效果可以应用于临床，目前尚未明确。技术实现要素：本发明的目的之一提供一种中药组合物—小柴胡颗粒在抑制甲型流感病毒中的新应用。本发明首次发现小柴胡颗粒在抑制甲型流感病毒h3n2亚型及其所致自由基损伤中的新应用，尤其解决甲型流感病毒h3n2亚型感染治疗中清除自由基的问题。一种中药组合物在制备防治甲型流感病毒h3n2亚型感染的药物中的应用，所述中药组合物的活性成分的重量份组成为：柴胡150±5份、黄芩56±5份、姜半夏56±3份、党参56±3份、生姜56±3份、甘草56±3份、大枣56±3份。本发明的另一目的是提供一种中药组合物—小柴胡颗粒在制备清除感染甲型流感病毒h3n2亚型所致的过量自由基的药物中的应用。一种中药组合物在制备清除感染甲型流感病毒h3n2亚型所致的过量自由基的药物中的应用，所述中药组合物的活性成分的重量份组成为：柴胡150±5份、黄芩56±5份、姜半夏56±3份、党参56±3份、生姜56±3份、甘草56±3份、大枣56±3份。本发明的另一目的是提供一种中药组合物在制备治疗甲型流感病毒h3n2亚型所致肺炎的药物中的应用。一种中药组合物在制备治疗甲型流感病毒h3n2亚型所致肺炎的药物中的应用，所述中药组合物的活性成分的重量份组成为：柴胡150±5份、黄芩56±5份、姜半夏56±3份、党参56±3份、生姜56±3份、甘草56±3份、大枣56±3份。在其中一个实施例中，所述中药组合物的活性成分的重量份组成为：柴胡150份、黄芩56份、姜半夏56份、党参56份、生姜56份、甘草56份、大枣56份。在其中优选的一个实施例中，所述中药组合物的剂型是颗粒剂。本发明通过体外抗病毒实验、体内小鼠流感模型实验，首次发现一种中药组合物(包括小柴胡颗粒)能够显著抑制甲型流感病毒h3n2亚型，改善甲型流感病毒h3n2亚型导致的肺部损伤(如：肺指数、肺湿干比重等)，尤其对甲型流感病毒h3n2亚型导致的过量自由基具有显著的清除作用(显著调控：cat、sod、gsh-px、mda、no、mpo、tnf-a、il-6、ros、抗超氧阴离子等)，且呈现量效关系特征。本发明提供了以小柴胡颗粒在抑制甲型流感病毒h3n2及其所致肺炎及过量的自由基中的新应用。附图说明图1、图2、图3分别是本发明实施例2中小柴胡颗粒对h2n2亚型、h3n2亚型、h5n1亚型感染小鼠肺炎模型肺指数、肺湿干比率、抑制率作用柱状图。图4、图5、图6、图7分别是本发明实施例3中小柴胡颗粒对h2n2亚型、h3n2亚型、h5n1亚型感染模型小鼠血清tnf-a、il-6、ros、抗超氧阴离子作用柱状图。图8、图9、图10、图11、图12、图13分别是本发明实施例3中小柴胡颗粒对h2n2亚型、h3n2亚型、h5n1亚型感染模型小鼠肺组织cat、sod、gsh-px、mda、no、mpo作用柱状图。具体实施方式本发明下列实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明的术语包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或组分，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或组分。在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。本发明所述小柴胡颗粒的活性成分为：柴胡150±5份、黄芩56±5份、姜半夏56±3份、党参56±3份、生姜56±3份、甘草56±3份、大枣56±3份。以下实施例中的小柴胡颗粒由广州白云山光华制药出售，其活性成分具体组成为：柴胡150g、黄芩56g、姜半夏56g、党参56g、生姜56g、甘草56g、大枣56g，制剂为颗粒剂。因辅料蔗糖可导致抗菌试验产生假阳性结果，故本研究以小柴胡颗粒(无糖版)用于后续试验。实施例1：小柴胡颗粒体外甲型流感病毒h2n2亚型、h3n2亚型、h5n1亚型抑制实验1.材料：1.1受试药物：小柴胡颗粒(无糖，广州白云山光华制药股份有限公司)。1.2对照药物：利巴韦林。1.3病毒株：甲型流感病毒(h2n2亚型、h3n2亚型、h5n1亚型)。病毒用mdck细胞单层连续传代2次，收获细胞培养液，bsl-3(生物安全实验室三级)检测，分装，冻藏于-80℃冰箱备用。1.4细胞模型：狗肾细胞mdck细胞，经甲型流感病毒攻击会发生凋亡。上述药物均经二甲基亚砜(dmso)充分溶解后-20℃保存备用。2.方法：2.1病毒毒力的测定将100μl10倍系列稀释得到的10个浓度的病毒液，每浓度设8个复孔，依次接种到长满单层mdck细胞层的96孔板中，同时设细胞对照。37℃、5％co2病毒培养箱中培养，逐日用倒置显微镜观察细胞病变(cpe)，连续观察3天，用mtt法进行检测。在酶标仪570nm波长测定吸光度od值，用reed-muench法计算病毒半数感染剂量(tcid50)。测定结果：甲型流感病毒(h2n2亚型、h3n2亚型、h5n1亚型)在mdck细胞中病毒毒力tcid50分别为10-5.7/0.1ml、10-5.3/0.1ml、10-4.9/0.1ml。2.2小柴胡颗粒细胞毒性测定取mdck细胞已长成单层的96孔细胞培养板，倾去培养液，用pbs洗涤2次，加入不含血清的dmem培养基连续2倍系列稀释(1600μg/ml-50μg/ml)的小柴胡颗粒药液，100μl/孔，每个浓度设4个复孔，设正常细胞对照4孔。37℃、5％co2病毒培养箱中培养72h，用mtt法进行检测，在570nm波长下测出各实验组与细胞对照组的吸收度。以对照孔为参照，计算各试验孔细胞的活力比值。根据reed-muench法计算细胞tc50，整个实验重复3次，取平均值。结果：小柴胡颗粒的细胞半数毒性浓度tc50>1150μg/ml。2.3小柴胡颗粒抗甲型流感病毒活性测试取mdck细胞已长成单层的96孔细胞培养板，倾去培养液，用pbs洗涤2次，加入100tcid50病毒液，100μl/孔，37℃、5％co2吸附2h。加入不含血清的dmem培养基连续2倍系列稀释(200μg/ml-12.5μg/ml)小柴胡颗粒药液，同时设病毒对照组、细胞对照组、阳性药组。在37℃、5％co2病毒培养箱中培养72h，用mtt法进行检测，用酶标仪测570nm波长的吸光度od值。按下述公式计算药物对病毒的抑制率：病毒抑制率(％)＝(药物处理组od均值-病毒对照组od均值)/(细胞对照组od均值-病毒对照组od均值)×100％，根据reed-muench法计算药物对甲型流感病毒(h2n2亚型、h3n2亚型、h5n1亚型)致cpe产生的抑制率、ic50，整个实验重复3次，取平均值。结果：根据mtt结果，采用reed-muench法计算，小柴胡颗粒对h3n2亚型感染细胞cpe抑制率超过60％，对h2n2亚型、h5n1亚型感染细胞cpe抑制率为30％左右；利巴韦林组对h2n2亚型、h3n2亚型、h5n1亚型感染细胞cpe抑制均在40％以上；表明小柴胡颗粒能够显著抑制h3n2亚型病毒在细胞中的增殖。其中，小柴胡颗粒对甲型流感病毒(h2n2亚型、h3n2亚型、h5n1亚型)的ic50分别为45.6μg/ml、10.4μg/ml、39.8μg/ml，阳性药物利巴韦林对甲型流感病毒(h2n2亚型、h3n2亚型、h5n1亚型)的ic50分别为17.3μg/ml、18.6μg/ml、20.1μg/ml。结论：在mdck细胞中，小柴胡颗粒对甲型流感病毒h3n2亚型具有显著的抑制作用(优于利巴韦林)，即抗病毒效果；小柴胡颗粒对甲型流感病毒h2n2亚型、h5n1亚型抑制作用不明显(弱于利巴韦林)，即未显现出抗病毒效果。实施例2：小柴胡颗粒对甲型流感病毒h2n2亚型、h3n2亚型、h5n1亚型感染小鼠肺炎模型体内实验1.材料：1.1受试药物：小柴胡颗粒(无糖，广州白云山光华制药股份有限公司)。1.2对照药物：达菲。1.3病毒：流感h2n2亚型、h3n2亚型、h5n1亚型病毒a/hongkong/1968鼠肺适应株。病毒用mdck细胞单层连续传代2次，收获细胞培养液，bsl-3(生物安全实验室三级)检测，分装，冻藏于-80℃冰箱备用。1.4动物：昆明种小鼠体重18～20g，雄性，160只，由广东省医学实验动物中心提供，syxk(粤)2019－0185)。在实验动物适应新环境一周后开始实验，并在实验过程中采取适当的方法减轻对动物的伤害。2.方法：将小鼠随机分为空白对照组、模型组h2n2、模型组h3n2、模型组h5n1、达菲药物组h2n2、达菲药物组h3n2、达菲药物组h5n1、小柴胡颗粒低剂量组h2n2(5.4g/kg，为人体临床等效剂量，其他对应组相同)、小柴胡颗粒中剂量组h2n2(10.8g/kg，其他对应组相同)、小柴胡颗粒高剂量组组h2n2(21.6g/kg，其他对应组相同)、小柴胡颗粒低剂量组h3n2、小柴胡颗粒中剂量组h3n2、小柴胡颗粒高剂量组组h3n2、小柴胡颗粒低剂量组h5n1、小柴胡颗粒中剂量组h5n1、小柴胡颗粒高剂量组组h5n1，一共16组，每组10只，小鼠在乙醚轻度麻醉下，除空白对照组外，每只小鼠采用对应病毒亚型的25μl50ld50病毒液滴鼻感染，空白对照组用等量生理盐水滴鼻。感染后1h，空白对照组和模型组予以等体积生理盐水灌胃，低、中、高剂量实验组给予小柴胡颗粒水溶液灌胃，每日一次，连续5日。感染后第6天，剖杀小鼠，剖杀前禁食不禁水12h以上。腋下动脉放血处死后取出鼠肺，将鼠肺放在盛有9g/l生理盐水的培养皿中洗净表面血液，并用吸水纸吸干表面水分，然后放在锡纸上一起称湿质量，做好标记放到65℃烘箱烘干48h，质量不变后称量干质量，计算肺湿干比率、肺指数与肺指数抑制率。计算公式：肺湿干比率＝肺湿质量(g)/肺干质量(g)；肺指数＝肺质量(g)/体重(g)×100％；肺指数抑制率＝(模型对照组平均肺指数-实验组平均肺指数)/模型对照组平均肺指数×100％。数据处理与统计方法：数据用平均值±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析；采用spss22.0软件处理数据。3.结果及结论：肺指数值与肺湿干比率越大，表示肺炎越严重。结果表明(表1，图1-图3)，小柴胡颗粒能够显著降低甲型流感病毒h3n2亚型感染小鼠的肺指数与肺湿干比率，且呈现剂量依赖效应；小柴胡颗粒对h2n2亚型、h5n1亚型感染小鼠的肺指数与肺湿干比率未见明显作用。即发现小柴胡颗粒能够抑制甲型流感病毒h3n2亚型导致的肺炎损伤。表1小柴胡颗粒对h2n2亚型、h3n2亚型、h5n1亚型感染小鼠肺炎模型肺指数及肺湿干比率作用(n＝10)注：与空白对照组比较，#p<0.05，##p<0.01；与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01实施例3：小柴胡颗粒清除甲型流感病毒h2n2亚型、h3n2亚型、h5n1亚型感染小鼠肺炎模型体内过量自由基实验1.材料：1.1受试药物：小柴胡颗粒(无糖，广州白云山光华制药股份有限公司)。1.2对照药物：达菲。.3病毒：流感h2n2亚型、h3n2亚型、h5n1亚型病毒a/hongkong/1968鼠肺适应株。病毒用mdck细胞单层连续传代2次，收获细胞培养液，bsl-3(生物安全实验室三级)检测，分装，冻藏于-80℃冰箱备用。1.4.动物：昆明种小鼠体重18～20g，雄性，160只，由广东省医学实验动物中心提供，syxk(粤)2019－0185。在实验动物适应新环境一周后开始实验，并在实验过程中采取适当的方法减轻对动物的伤害。2.方法：将小鼠随机分为空白对照组、模型组h2n2、模型组h3n2、模型组h5n1、达菲药物组h2n2、达菲药物组h3n2、达菲药物组h5n1、小柴胡颗粒低剂量组h2n2(5.4g/kg，为人体临床等效剂量，其他对应组相同)、小柴胡颗粒中剂量组h2n2(10.8g/kg，其他对应组相同)、小柴胡颗粒高剂量组组h2n2(21.6g/kg，其他对应组相同)、小柴胡颗粒低剂量组h3n2、小柴胡颗粒中剂量组h3n2、小柴胡颗粒高剂量组组h3n2、小柴胡颗粒低剂量组h5n1、小柴胡颗粒中剂量组h5n1、小柴胡颗粒高剂量组组h5n1，一共16组，每组10只，小鼠在乙醚轻度麻醉下，除空白对照组外，每只小鼠采用对应病毒亚型的25μl50ld50病毒液滴鼻感染，空白对照组用等量生理盐水滴鼻。感染后1h，空白对照组和模型组予以等体积生理盐水灌胃，低、中、高剂量实验组给予小柴胡颗粒水溶液灌胃，每日一次，连续5日。感染后第6天，小鼠眼球取血，4℃、3500r/min离心15min分离血清，-20℃保存备用。按试剂盒说明书检测血清中tnf-a、ros、il-6含量与抗超氧阴离子(o2-)活力单位。处死动物后取出全肺，置匀浆器中加生理盐水，研磨制成匀浆，4℃、2500r/min离心20min，取上清液，-20℃保存备用。按试剂盒说明书检测肺组织cat、sod、gsh-px、mda、no、mpo的含量。实验数据采用spss22.0软件进行统计分析，计量资料以平均值±标准差表示，组间差异采用单因素方差分析，p<0.05为差异有统计学意义。3.结果及结论：tnf-a、il-6能诱导肺内皮细胞活化、白细胞迁移、粒细胞脱颗粒和毛细血管渗漏等，激活损伤粒细胞、内皮细胞、血小板等，进一步释放氧自由基、溶酶体酶等，诱发并加重炎症反应。mda的水平越高，反映脂质过氧化程度越高；高水平no、ros与mpo导致细胞毒性作用，介导免疫损伤。结果表明(表2、表3，图4-图7，图8-图13)，小鼠感染甲型流感病毒h3n2亚型后，小柴胡颗粒给药能够显著抑制tnf-a、il-6的表达，抑制氧自由基的释放，同时降低mda、no、ros与mpo含量，减轻脂质过氧化程度和降低各种炎症因子的水平，从而减轻炎症反应；而小鼠感染甲型流感病毒h2n2亚型、h5n1亚型后，小柴胡颗粒给药对机体炎症反应未见明显的抑制作用。抗超氧阴离子活力单位越高，说明清除超氧阴离子(o2-)能力越强；cat、sod、gsh-px是机体重要的抗氧化酶，可清除自由基，减轻氧化损伤。结果表明(表2、表3)，小鼠感染甲型流感病毒h3n2亚型后，小柴胡颗粒给药显著升高了cat、sod、gsh-px活性与抗超氧阴离子能力，增强清除自由基的能力，减轻肺组织损伤；而小鼠感染甲型流感病毒h2n2亚型、h5n1亚型后，小柴胡颗粒给药对机体过量自由基未见明显的清除作用。表2小柴胡颗粒对h2n2亚型、h3n2亚型、h5n1亚型感染模型小鼠血清tnf-a、il-6、ros、抗超氧阴离子作用(n＝10)组别tnf-a(pg/ml)il-6(pg/ml)ros(u/ml)抗超氧阴离子(u/l)空白对照组2.06±0.188.94±0.75100.20±8.81220.56±18.29模型组h2n23.56±0.31##21.97±0.99##328.31±19.81##142.33±8.18##达菲药物组h2n22.36±0.16**12.01±0.92**169.64±12.08**190.25±13.47**小柴胡颗粒h2n2-低3.47±0.3520.56±1.96319.11±17.14151.21±14.95小柴胡颗粒h2n2-中3.39±0.3919.66±1.25311.99±12.58152.34±16.27小柴胡颗粒h2n2-高3.22±0.5119.21±1.33313.02±14.66159.12±18.62模型组h3n23.37±0.29##20.31±0.73##337.55±19.62##150.36±9.20##达菲药物组h3n22.17±0.18**11.79±0.87**150.80±10.04**183.15±10.43**小柴胡颗粒h3n2-低2.28±0.2**16.14±1.22**246.63±21.40**197.19±17.96**小柴胡颗粒h3n2-中2.21±0.17**13.69±0.99**180.74±13.41**213.58±18.85**小柴胡颗粒h3n2-高2.19±0.19**12.37±0.90**137.98±9.42**217.22±20.63**模型组h5n13.76±0.23##18.39±1.17##353.22±23.69##155.31±11.39##达菲药物组h5n12.25±0.21**12.56±1.03**158.63±15.63**178.29±11.08**小柴胡颗粒h5n1-低3.42±0.3817.25±1.02336.59±18.24161.21±17.45小柴胡颗粒h5n1-中3.34±0.2916.89±1.22329.34±12.36158.39±16.55小柴胡颗粒h5n1-高3.18±0.4717.21±0.98313.29±15.33162.33±15.92注：与空白对照组比较，#p<0.05，##p<0.01；与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01表3小柴胡颗粒对h2n2亚型、h3n2亚型、h5n1亚型感染模型小鼠肺组织cat、sod、gsh-px、mda、no、mpo作用(n＝10)注：与空白对照组比较，#p<0.05，##p<0.01；与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01结论：由上述实验数据可知，小柴胡颗粒在抑制甲型流感病毒h3n2亚型及其所致自由基损伤中，能够有效的减轻甲型流感病毒h3n2亚型引起的呼吸道、肺部过氧化损伤，增加机体清除自由基的能力，达到治疗病毒感染所致肺炎的效果。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12