本发明涉及抗体药物领域，特别是涉及一种鸡腺病毒卵黄抗体全蛋喷干粉的制备方法。
背景技术：
：卵黄抗体提取于新鲜鸡蛋的蛋黄，因为鸡蛋含水量高（平均值在70%以上）在储存过程中易受周围温度、湿度、储存方法及储存时间等的限制，易腐败变质。然而将卵黄抗体提取后进行处理得到粉状蛋黄粉，不但能阻止微生物生长又能减缓化学反应速度，有利于抗体的储存及运输。处理后得到的蛋黄粉使用更加简便，不仅可任意调节稀释倍数，控制抗体浓度，还能作为添加剂，添加于兽药中。但是市面上存在的卵黄抗体喷雾干燥技术使用的是卵黄，并且卵黄液还经过沉降后才喷雾干燥，虽然得到的卵黄抗体较为纯净，但卵黄与卵清分离过程中以及卵黄沉降过程中相当一部分的卵黄抗体会丢失，而且过多的纯化抗体也会造成成本的增加，卵黄抗体喷雾干燥前越纯净，喷雾干燥后损失的越多，这是因为鸡蛋的某些物质能够对抗体起到保护作用。虽然目前也存在全蛋粉喷干工艺的研究，但是这些方法都存在着喷干温度过高，喷干后溶解性不好等问题，而且这些工艺对于卵黄中的抗体并未起到保护措施，喷干后抗体存活基本为零。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种鸡腺病毒卵黄抗体全蛋喷干粉的制备方法；通过该方法得到的全蛋抗体粉剂溶解性好，抗体损失少，抗体活性高，并且成本大大减少。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种鸡腺病毒卵黄抗体全蛋喷干粉的制备方法，步骤如下：（1）取刚开始产蛋的蛋鸡，为蛋鸡注射腺病毒疫苗，对蛋鸡免疫3次，每次间隔9天，对卵黄中的卵黄抗体进行免疫学检测，腺病毒的卵黄抗体琼脂扩散效价达到1:15以上时收集鸡蛋；（2）将收集的鸡蛋进行清洗干净，然后用新洁尔灭进行消毒，之后再清洗喷淋干净，晾干，置于4℃下保存；（3）将步骤（2）中保存的鸡蛋在无菌条件下打蛋，将整蛋液添加一倍体积水后用搅拌机搅拌均匀；（4）向整蛋液中添加4‰的酿酒酵母进行除糖，除糖时间为6-10小时，除糖温度为30-35℃；（5）用ph为3的盐酸溶液活化胃蛋白酶，活化后加水调节ph为4-5，按总蛋液2‰的酶量添加胃蛋白酶进行酶切，酶切时间为2-4h，酶切温度32-37℃；（6）酶切完成过后，于50℃温浴15-20分钟，在温浴过程中，添加2-8‰的海藻酸钠作为保护剂，1‰吐温80作为乳化剂，5-10％的可溶性淀粉，慢慢搅拌直至温浴时间结束；然后迅速冷却至4℃，设置喷干机进风温度140℃，出风温度70℃，将蛋液进行喷干，收集可得腺病毒全蛋抗体喷干粉。优选的方案是，所述步骤（4）中除糖时间为8小时。优选的方案是，所述步骤（4）中除糖温度为32℃。优选的方案是，所述步骤（5）中酶切时间为3小时。优选的方案是，所述步骤（5）中酶切温度34℃。优选的方案是，所述步骤（6）中海藻酸钠的添加量为4‰。优选的方案是，所述步骤（6）中可溶性淀粉的添加量为8％。本发明的有益效果体现在：（1）在本发明中，获取全蛋液后加入了酵母除糖、胃蛋白酶酶切蛋白步骤，酵母除糖的同时还能将蛋液处理成更稳定的溶液体系，并且不会对抗体蛋白特异性免疫活性产生危害；（2）在本发明中，采用胃蛋白酶酶切能完整保存抗体fab片段，不会造成抗体失活；（3）本发明在喷雾干燥前添加海藻酸钠作为抗体保护剂，吐温80作为乳化剂，并且温浴作用能够让海藻酸钠与吐温80溶解迅速，能使吐温80将油水混合物切成更小的分子体系，这样喷干得到的全蛋抗体粉不会存在不溶的情况；（3）由本发明提供的制备方法得到的全蛋抗体粉剂溶解性好，抗体损失少，抗体活性高，并且成本大大减少，具有较好的经济效益和社会效益。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步说明：其中本发明中所用蛋鸡均来自青岛后山后鸡场。实施例1一种鸡腺病毒卵黄抗体全蛋喷干粉的制备方法，步骤如下：（1）取刚开始产蛋的蛋鸡，为蛋鸡注射腺病毒疫苗，对蛋鸡免疫3次，每次间隔9天，对卵黄中的卵黄抗体进行免疫学检测，腺病毒的卵黄抗体琼脂扩散效价达到1:15以上时收集鸡蛋；（2）将收集的鸡蛋进行清洗干净，然后用新洁尔灭进行消毒，之后再清洗喷淋干净，晾干，置于4℃下保存；（3）将步骤（2）中保存的鸡蛋在无菌条件下打蛋，将整蛋液添加一倍体积水后用搅拌机搅拌均匀；（4）向整蛋液中添加4‰的酿酒酵母进行除糖，除糖时间为6小时，除糖温度为30℃；（5）用ph为3的盐酸溶液活化胃蛋白酶，活化后加水调节ph为4，按总蛋液2‰的酶量添加胃蛋白酶进行酶切，酶切时间为2h，酶切温度32℃；（6）酶切完成过后，于50℃温浴15分钟，在温浴过程中，添加2‰的海藻酸钠作为保护剂，1‰吐温80作为乳化剂，5％的可溶性淀粉，慢慢搅拌直至温浴时间结束；然后迅速冷却至4℃，设置喷干机进风温度140℃，出风温度70℃，将蛋液进行喷干，收集可得腺病毒全蛋抗体喷干粉。实施例2一种鸡腺病毒卵黄抗体全蛋喷干粉的制备方法，步骤如下：（1）取刚开始产蛋的蛋鸡，为蛋鸡注射腺病毒疫苗，对蛋鸡免疫3次，每次间隔9天，对卵黄中的卵黄抗体进行免疫学检测，腺病毒的卵黄抗体琼脂扩散效价达到1:15以上时收集鸡蛋；（2）将收集的鸡蛋进行清洗干净，然后用新洁尔灭进行消毒，之后再清洗喷淋干净，晾干，置于4℃下保存；（3）将步骤（2）中保存的鸡蛋在无菌条件下打蛋，将整蛋液添加一倍体积水后用搅拌机搅拌均匀；（4）向整蛋液中添加4‰的酿酒酵母进行除糖，除糖时间为10小时，除糖温度为35℃；（5）用ph为3的盐酸溶液活化胃蛋白酶，活化后加水调节ph为4，按总蛋液2‰的酶量添加胃蛋白酶进行酶切，酶切时间为4h，酶切温度34℃；（6）酶切完成过后，于50℃温浴15分钟，在温浴过程中，添加8‰的海藻酸钠作为保护剂，1‰吐温80作为乳化剂，8％的可溶性淀粉，慢慢搅拌直至温浴时间结束；然后迅速冷却至4℃，设置喷干机进风温度140℃，出风温度70℃，将蛋液进行喷干，收集可得腺病毒全蛋抗体喷干粉。实施例3一种鸡腺病毒卵黄抗体全蛋喷干粉的制备方法，步骤如下：（1）取刚开始产蛋的蛋鸡，为蛋鸡注射腺病毒疫苗，对蛋鸡免疫3次，每次间隔9天，对卵黄中的卵黄抗体进行免疫学检测，腺病毒的卵黄抗体琼脂扩散效价达到1:15以上时收集鸡蛋；（2）将收集的鸡蛋进行清洗干净，然后用新洁尔灭进行消毒，之后再清洗喷淋干净，晾干，置于4℃下保存；（3）将步骤（2）中保存的鸡蛋在无菌条件下打蛋，将整蛋液添加一倍体积水后用搅拌机搅拌均匀；（4）向整蛋液中添加4‰的酿酒酵母进行除糖，除糖时间为8小时，除糖温度为32℃；（5）用ph为3的盐酸溶液活化胃蛋白酶，活化后加水调节ph为4，按总蛋液2‰的酶量添加胃蛋白酶进行酶切，酶切时间为3h，酶切温度37℃；（6）酶切完成过后，于50℃温浴15分钟，在温浴过程中，添加4‰的海藻酸钠作为保护剂，1‰吐温80作为乳化剂，5％的可溶性淀粉，慢慢搅拌直至温浴时间结束；然后迅速冷却至4℃，设置喷干机进风温度140℃，出风温度70℃，将蛋液进行喷干，收集可得腺病毒全蛋抗体喷干粉。试验例由本发明制备方法所得全蛋喷干粉的相关试验研究：试验组：采用本发明实施例3所述制备方法制备全蛋喷干粉；对比组1：按现有技术中方法制备全蛋喷干粉，具体步骤为：原料鲜蛋-清洗-带壳消毒-晾蛋-打蛋去壳-过滤-均质-巴氏杀菌-喷雾干燥-粉体收集其中喷雾干燥温度进风温度为180℃，出风温度60℃。对比组2：按照某现有技术制备蛋黄抗体粉，其步骤为：（1）饲养免疫鸡苗：选取一定数量的健康的25周龄的鸡苗，隔离饲养，并在各只鸡苗的鸡翅下肌肉注射灭活疫苗进行首免，于1周、2周之后分别进行相同剂量的强化免疫，首免后检测鸡苗的血清中抗体水平达8log2以上时收集鸡蛋；（2）鸡蛋的消毒冷藏：将收集的鸡蛋进行清洗干净，然后利用消毒液进行消毒，之后再清洗喷淋干净，晾干，置于4℃下冷藏；（3）收集蛋黄：将步骤（2）冷藏后的鸡蛋打蛋，并在4℃且无菌的条件下将蛋清与蛋黄分离，取蛋黄，将蛋黄利用搅拌机搅拌均匀，搅拌机的搅拌速率为150r/min，搅拌时间为15min；（4）稀释蛋黄液：边搅拌边缓慢加入2倍蛋黄体积的去离子蒸馏水，完全加完去离子蒸馏水后继续搅拌20min，之后置于4℃的冷藏室内静置3h；（5）过滤：将所述步骤（4）得到的蛋黄稀释液利用过滤膜进行过滤，取过滤液，滤膜的滤孔大小为15微米；（6）沉淀脂类物质：向过滤液中加人2倍体积的生理盐水震荡混匀,加入浓度为30g/l的邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素，加入的邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素的体积为0.3倍过滤液的体积，搅拌均匀，在15℃下作用24h，利用离心机离心，离心转速为5000r/min，离心时间为20min，之后静置沉淀，取上清液；（7）喷雾干燥：用喷雾干燥机喷雾干燥成粉，其中，喷雾干燥机采用155℃进气,78℃出气，制成干燥粉，获得成品，置于4℃下冷藏。将试验组、对比组1和对比组2所得粉剂分别进行溶解速度测定、溶液稳定性测定、抗体活性测定和抗体损失测定。其中，（1）溶解速度测定方法为：将盛有30ml的去离子水的50ml烧杯置于磁力搅拌器上，转速设定为300r/min，称取1g粉剂放入烧杯中，同时记录从加入粉体到粉块全部在溶液中分散开所用的时间，时间越短，代表溶解速度越快。结果如表1所示：表1由表1数据可知，本发明制备得到的全蛋喷干粉剂的溶解速度明显快于对比组1，并与对比组2的溶解速度几乎等同。（2）溶液稳定性测定：取1g完全干燥全蛋粉，完全溶解到30ml去离子水中，4000r/min条件下离心20min，取上清放于105℃烘箱中干燥至恒重，称量此时的质量。稳定性计算公式如下：式中m1代表完全干燥全蛋粉的重量，m2为上清液干燥后固体的重量。结果如表2所示：表2由表2数据可知，本发明制备得到的全蛋喷干粉剂的溶液稳定性明显优于对比组1，且高于对比组2，因此，本发明方法所得全蛋喷干粉剂的溶液稳定性更强。（3）抗体活性测定：通过琼扩试验测定抗体效价。结果如表3所示：表3由表3数据可知，本发明方法制备得到的全蛋粉抗体活性较对比组1的抗体活性更高。（4）抗体损失测定：蛋液处理前后测量效价，记录为效价1和效价2；蛋液喷干前测量体积，喷干后全部收集蛋粉溶解到原来体积，测量前后效价，记录为效价3和效价4。前处理效价损失为喷干效价损失为结果如表4所示，表4样品试验组对比组1对比组2前处理效价损失3%0%15%喷干效价损失5%60%7%由表4数据可知，本发明方法制备得到的全蛋粉与沉降后喷干的抗体粉比较，本发明的抗体损失较少，喷干过程中保护剂的加入使抗体在喷干过程前后损失少，而对比组2由于沉降步骤带给抗体的损失是比较大的。综上，由本发明提供的制备方法得到的全蛋抗体粉剂溶解性和稳定性好，抗体损失少，抗体活性高，并且成本大大减少，具有较好的经济效益和社会效益。本发明方法同样可以适用于流感或者新城疫卵黄抗体鸡蛋，可以得到鸡流感或者新城疫卵黄抗体全蛋粉。应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较由代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，以本发明所明确公开的或根据文件的书面描述毫无异议的得到的，均应认为是本专利所要保护的范围。当前第1页12