包含水果提取物的组合物的制作方法
本申请是申请号为201380067642.7的中国专利申请的分案申请，原申请是2013年12月24日提交的pct国际申请pct/gb2013/053431于2015年6月23日进入中国国家阶段的申请。
本发明涉及组合物，其包含水果提取物或者水果提取物与任选的其它特定营养物之组合，其可用于预防运动诱发的全身性炎症和促进从剧烈运动中恢复。
背景技术：
保持任何的运动方案都需要心理保证和体力两者。
体力持续的程度主要取决于(在没有持续损伤的情况下)身体对运动方案向其施加之压力的恢复力，即，从这些压力影响中恢复的速度。
从运动中恢复涉及许多身体过程。这些过程包括修复受损的肌肉组织；补充肌糖原储备；除去运动期间积累在肌肉或其它组织中的代谢副产物；以及响应并下调运动期间出现的炎症。
对于全面恢复而言，一些运动诱发的炎症是必要的。例如，运动期间使用的肌肉群内的局部炎症信号传导有助于将白细胞募集到肌肉损伤部位，从而有助于愈合过程。
然而，一些类型的运动可诱发全身性炎症，所述全身性炎症并不充当愈合的刺激物，而是充当有害的全身炎性负担，其可(尤其是如果在反复的运动环节期间全身炎性持续的话)降低身体的恢复能力，并使一些生物系统处于不必要的和可能危险的压力下。
如果运动强度足够，则任何运动形式都可引发这种全身性炎症。剧烈运动很快就伴随着凝血系统的活化，所述剧烈运动意指在对应于大于约60％最大摄氧量(vo2max)的强度下进行的任何运动。凝血系统包括血小板和凝血因子，并且血小板和凝血因子均被强度大于60％最大摄氧量的运动活化。其活化导致凝血酶产生，促凝血循环微粒和促炎循环微粒释放，循环的白细胞活化，血管内皮活化，可用一氧化氮和相关的血管舒张降低，以及诸如il-6的循环炎症标志物增加。
高水平的循环il-6与较强烈的运动后肌肉酸痛以及从之前的运动环节中恢复较慢有关。
鉴于此，本发明人已意识到，能够减少运动诱发的il-6和相关炎症标志物之产生的药剂在促进从运动中恢复方面具有潜在用途。然而，已经确定不是所有抑制凝血系统的药剂都影响运动诱发的血小板活化、凝血和炎症标志物产生。有许多在血小板产生和作用的不同阶段中起作用的已知抗血小板聚集剂(anti-platelet-aggregationagent)，例如最广泛使用和研究的阿司匹林(乙酰水杨酸)。然而，这样的抗血小板药并不抑制运动诱发的凝血系统活化。这已在进行长期抗血小板治疗的患者中得到证实，并且这是在否则可从常规运动方案中受益的患者群组中禁止运动的原因。剧烈运动期间血小板的主要生物活化剂是凝血酶和肾上腺素，而最常用的抗血小板药对其具有非常有限的功效。凝血酶和肾上腺素一起作用提供了用于血小板活化的非常有效的系统，这是不可逆转的非常快的作用。
因此，本发明的一个目的是鉴定这样的组合物，其会在对象中治疗、减少、尽可能降低或预防运动诱发的全身性炎症，并会因此可用于促进对象从运动中恢复。
技术实现要素：
根据本发明的第一方面，提供了具有抑制血小板聚集活性的茄科(solanaceae)水果水溶性提取物，其用于在对象中治疗、减少、尽可能降低或预防运动诱发的全身性炎症。
“预防”意指该提取物会阻止运动诱发的炎症发生或替代地降低运动诱发的炎症的严重程度；延迟运动诱发的炎症的发生；或者减轻与运动诱发的炎症相关的症状。
“减少”意指当与未接受提取物的对照对象相比时，该提取物会降低运动诱发的炎症的严重程度；延迟运动诱发的炎症的发生；或者减轻与运动诱导的炎症相关的症状。
“尽可能降低”意指使运动诱发的炎症减少(即使没有消除)至其不会延迟对象从运动中恢复的程度。
在一个优选实施方案中，提取物的使用改善或促进对象从运动中恢复(当与未接受该提取物的对照对象相比时)。
恢复期对使神经系统、内分泌系统和肌肉骨骼系统得到进行重要修复工作的机会是必要的。例如，肌肉系统需要时间来修复在艰苦努力期间损伤的细胞。肌肉还需要时间来使营养物代谢、补充糖原储备并合成新酶和产生能量的线粒体。在恢复期间，神经系统适应于向其施加的压力，使得其可以更好地控制训练期间所使用的专业运动模式。内分泌系统必须回到平衡状态。增加的炎症负荷可干扰这些过程，降低在训练休息期间的恢复程度，并可能扰乱训练与恢复之间的平衡，而这种平衡对于顶尖运动表现是必不可少的。
根据本发明的第二方面，提供了具有抑制血小板聚集活性的茄科水果水溶性提取物，其用于促进对象从运动中恢复。
本发明人已发现，大多数抗血小板剂(例如，阿司匹林)对于在对象中治疗或预防运动诱发的全身性炎症或促进对象从运动中恢复是无效的。因此，出乎意料地发现，已知的具有抗血小板活性的水溶性番茄提取物(公开于国际专利申请wo99/55350，创造性改进描述于wo2010/049707中)在模拟剧烈运动的条件下在降低由内皮il-6产生所限定的运动诱发的炎症方面确实显示出了功效。
wo2010/049707公开了生产具有最佳抗血小板活性的水溶性番茄提取物的方法。在人体试验中发现这样的水溶性提取物对于预防或降低响应于二磷酸腺苷和胶原的血小板聚集具有显著功效，并且已经上市，在欧洲具有欧洲食品安全局授权的在心血管领域作为具有健康益处的营养补充剂的健康声明。
本发明人产生的新数据(参见实施例)表明，水溶性番茄提取物(例如，按照wo2010/049707的公开内容制成的)还减少了运动恢复时间并改善了剧烈运动后的恢复质量，特别是当在剧烈运动开始之前摄入时。
应理解，预防运动诱发的全身性炎症会改善对象从剧烈运动中恢复的能力。
优选的是，将水果提取物用于促进从剧烈运动中恢复。“剧烈运动”意指以对应于大于约60％最大摄氧量的强度进行的任何运动。
可将水果提取物给予任何哺乳动物对象，并且所述水果提取物在治疗兽医感兴趣的动物中具有效用(例如，改善马在运动或比赛后的恢复)。然而，优选地，对象是人类对象，并且更优选地，对象是即将进行或刚刚进行了如上文所定义的剧烈运动的人类对象。本发明人已发现，当将提取物给予身体健康个体，特别是希望从剧烈运动中得到最佳恢复的受训运动员或“精英”运动员的时候，提取物具有最大功效。
水果提取物优选地是活性水溶性番茄提取物(wstc)，所述级分包含基本上热稳定的无色水溶性化合物，所述化合物具有抑制血小板聚集的活性并且分子量小于1000。
所述提取物可来源于去皮水果的果肉和/或水果果仁周围的果汁。
所述提取物可基本上包含水果的果汁，并且然后可将所述果汁如本文和wo99/55350或wo2010/049707中所讨论的进行进一步加工。
所述提取物可以是可分离自番茄的活性级分，并且优选地，特征在于：
(a)其是无色或稻草色的；
(b)其是水溶性化合物；
(c)其由分子量小于1000的组分组成；并且
(d)其含有一种或更多种具有血小板聚集抑制活性的核苷。
优选的水果提取物包含：
(a)糖基化酚酸或酚酯或其衍生物；
(b)糖基化类黄酮；和
(c)核苷。
糖基化酚酸或酚酯可以是糖基化肉桂酸或其衍生物。这样的糖基化肉桂酸或其衍生物可选自包含以下的组：咖啡酰-4-o-奎尼酸、咖啡酰-4-o-葡糖苷、香豆酰-4-o-糖苷(葡萄糖苷/半乳糖苷)和香豆酰-4-o-糖苷(二糖)。
糖基化酚酸或酚酯可选自：咖啡酸葡糖苷、对香豆酸己糖/二氢山萘酚己糖、阿魏酸糖苷和对香豆酸衍生物。
糖基化类黄酮可以是槲皮素-3-o-葡糖苷或芦丁。
核苷可选自包括以下的组：amp、尿苷、腺苷、鸟苷或gmp。
在最优选的实施方案中，所述提取物是wo99/55350或wo2010/049707中所公开的具有预防血小板聚集活性的任何提取物。
wo99/55350，特别是wo2010/049707，还公开了用于制造可根据本发明使用的提取物的优选方法。
wo2010/049707在图2(用于由水果制备液体/糖浆提取物的方法)和图4(对提取物进行加工以制备已除去糖的粉末的方法)中公开了用于生产提取物的最优选方法以及可根据本发明使用的提取物本身。这些提取物及其制造方法通过引用并入本文。
本发明人进行了进一步的开发工作以生产这样的新型组合物，其包含水溶性番茄提取物和能够通过生物组织转化为外源性一氧化氮的硝酸盐。
本发明人出乎意料地发现，根据本发明的第一方面或第二方面水果提取物与硝酸盐的组合是特别有用的。虽然本发明人不希望受任何假说的束缚，但是认为这种组合有效的原因是其不仅通过凝血酶和肾上腺素靶向血小板活化，而且如果内源性来源的一氧化氮被耗尽，其还提供外源性来源的一氧化氮以供血小板和血管内皮细胞使用。
补充有硝酸盐的提取物代表了本发明的重要特征。因此，根据本发明的第三方面，提供了包含以下的组合物：
(a)具有抑制血小板聚集活性的茄科水果水溶性提取物，其中所述提取物包含：
(i)分子量小于1000的组分；和
(ii)具有血小板聚集抑制活性的核苷、糖基化酚酸或酚酯或其衍生物、或糖基化类黄酮中的一种或更多种；以及
(b)内源性一氧化氮的前体或膳食硝酸盐源。
本发明第三方面的组合物中的提取物(a)可以是具有抑制血小板聚集活性的茄科水果的任何水溶性提取物。优选地，提取物是如上所定义的提取物，并且特别地是wo99/55350或wo2010/049707中所公开的提取物。
适用于根据本发明该方面的组合物的膳食硝酸盐源(b)包括新鲜水果或蔬菜组织的水基提取物，其中已知所选择的水果或蔬菜含有足够高的硝酸盐水平，导致最终提取物的硝酸盐浓度大于7.5g/l或约7.5g/l。这样的水果和蔬菜的实例包括绿叶蔬菜，如菠菜、芝麻菜(rocket)、莴苣、甜菜、豆瓣菜的叶；十字花科蔬菜，如卷心菜或甘蓝菜；水果，如草莓、苹果或大黄。
膳食硝酸盐源可从新鲜的或冷冻干燥的水果或蔬菜组织中新鲜制备，或者可来源于可商购商品，如水果和蔬菜汁浓缩物。可通过对根据所存在的硝酸盐含量而使用的剂量进行滴定，将这样的浓缩物标准化为硝酸盐含量。或者，膳食硝酸盐可通过以下过程来制备：在添加水之后浸软新鲜植物组织，通过离心或过滤除去果肉，并例如通过冷冻干燥、通过低温真空干燥或通过低温蒸发在低温下浓缩以避免硝酸盐降解。应理解，也可将这样的制剂的硝酸盐含量标准化。
膳食硝酸盐源可单独使用，或者可制备不同来源材料的组合。优选组合的实例是唐莴苣(swisschard)提取物和大黄提取物，或者草莓提取物、大黄提取物和莴苣提取物。
膳食硝酸盐源可以以液体形式或者在通过干燥除去水后以粉末形式使用。膳食硝酸盐源的最终形式中存在的硝酸盐最终浓度可为7.5g/l至100g/l(对于液体)或者7.5g/kg至80g/kg(对于粉末)。最终形式中存在的亚硝酸盐的水平对于液体不得超过150mg/l或者对于粉末不得超过150mg/kg。
优选的是，根据本发明第三方面的组合物包含少于6.5g/l或小于6.5g/kg的硝酸盐；或者如果商业产品中包含大量的其他成分(见下文)，则包含所述组合物的产品包含少于6.5g/l或小于6.5g/kg的硝酸盐。优选地，所述组合物或产品包含约400mg/l至4500mg/l或约400mg/kg至4500mg/kg的硝酸盐。在一个实施方案中，所述组合物或产品包含约1.666g/l或1.666g/kg的硝酸盐。
根据本发明可使用内源性一氧化氮的多种前体。这样的前体可在体内转化形成硝酸盐。实例包括瓜氨酸、谷氨酰胺和精氨酸。根据本发明供使用的最优选前体是瓜氨酸。
优选的是，根据本发明第三方面的组合物还包含叶酸或其代谢物作为第三组分(c)，其充当内源性一氧化氮途径中的辅因子。叶酸是通过内皮细胞维持内源性一氧化氮产生的辅因子。本发明人已发现，在模拟剧烈运动的实验中(参见实施例)，硝酸盐补充剂和叶酸的联合作用出乎意料地改善了对血小板活化和炎症微粒释放两者的抑制。此外，与单独使用水溶性番茄提取物时相比，本发明第三方面的组合物使得活化内皮细胞中il-6产生的减少甚至更大。
根据本发明可使用的叶酸代谢物的实例包括5-甲氧基四氢叶酸(5-methoxytetahydrofolate)或四氢叶酸(tetrahydrofolate)。
适用于制剂的充当内源性一氧化氮途径辅因子的叶酸或其代谢物的来源通常是医药级的商业制剂，如由dsmk提供的folicacidbp/ep，纯度96％。
根据本发明的第四方面，提供了根据本发明第三方面的组合物，其用于在对象中治疗或预防运动诱发的全身性炎症。
根据本发明的第五方面，提供了根据本发明第三方面的组合物，其用于促进对象从运动中恢复。
根据本发明第三方面的组合物代表了可如与本发明第一方面和第二方面相关地讨论地以及如下面所讨论地使用的优选组合物。
药物制剂和营养制剂
虽然在优选的实施方案中，如下文和在实施例5中所讨论的，提取物和组合物与其他药剂一起配制以改善其商业性能(例如，改善递送、保质期、味道等)，但是也可制备根据本发明第一方面或第二方面使用的水果提取物或根据本发明第三方面的组合物(例如，参见实施例1或2)而无需任何附加的组分。
本发明的水果提取物和组合物可配制成用于口服施用。因此，可将其配制成例如凝胶剂、溶液、混悬剂、糖浆、片剂、胶囊、锭剂和零食(snackbar)、饮料、插入剂和贴剂。这样的制剂可按照本领域公知的方法来制备。例如，可将所述提取物或组合物制成糖浆或用于口服施用的其他溶液，例如作为保健饮料。这样的糖浆或溶液中可包含一种或更多种选自以下的赋形剂：糖、维生素、调味剂、着色剂、防腐剂和增稠剂。可添加张力调节剂(例如氯化钠或糖)以提供具有特定渗透强度的溶液，例如等张溶液。还可使用一种或更多种ph调节剂(例如缓冲剂)来将ph调节到特定值，并且优选使其保持在该值。缓冲剂的实例包括柠檬酸钠/柠檬酸缓冲剂和磷酸盐缓冲剂。
或者，可将所述提取物或组合物干燥(例如通过喷雾干燥或冷冻干燥)并将干燥产物配制成固体或半固体剂型，例如片剂、锭剂、胶囊剂、粉末、颗粒剂或凝胶。
含有提取物的组合物或本发明第三方面的组合物可通过使其吸附到固体载体上来制备，所述载体例如由以下组成的载体：诸如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖的糖，或者诸如木糖醇、山梨糖醇或甘露糖醇的糖醇，或者纤维素衍生物。其他特别有用的吸附剂包括基于淀粉的吸附剂，例如谷物粉，如小麦粉和玉米粉。
对于片剂形成，通常可将所述提取物或组合物与稀释剂相混合，所述稀释剂例如糖(如蔗糖和乳糖)；以及糖醇(如木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇)；或者改性纤维素或纤维素衍生物(如粉状纤维素或微晶纤维素或羧甲基纤维素)。片剂通常还会含有选自成粒剂、粘合剂、润滑剂和崩解剂的一种或更多种赋形剂。崩解剂的实例包括淀粉和淀粉衍生物，以及其它可膨胀聚合物，例如交联聚合物崩解剂，如交联羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮和羟乙酸淀粉。润滑剂的实例包括硬脂酸和诸如硬脂酸镁的硬脂酸盐。粘合剂和成粒剂的实例包括聚乙烯吡咯烷酮。在稀释剂本身不是非常甜的情况下，可加入甜味剂，例如甘草酸铵或诸如阿斯巴甜或糖精钠的人造甜味剂。
还可将提取物或组合物配制成并入胶囊中的粉末、颗粒剂、凝胶或半固体。当以粉末形式使用时，可将所述提取物与以上有关片剂所限定的任何一种或更多种赋形剂一起配制，或者可以以未稀释形式提供。对于以凝胶或半固体形式提供而言，可将干燥提取物或组合物溶解或悬于粘性液体或半固体载体(如聚乙二醇)，或者液体载体，例如诸如丙二醇的二醇或者甘油或者植物油或鱼油，例如选自以下的油：橄榄油、葵花籽油、红花油、月见草油、豆油、鱼肝油、鲱鱼油等。然后可将这些填充到硬明胶型胶囊或软明胶型胶囊中或者由硬明胶或软明胶等价物制成的胶囊中，对于粘性液体或半固体填料而言，优选软明胶或明胶等价物胶囊。在一个优选实施方案中，任选地与并入到胶囊(例如硬明胶胶囊)中的优选固体(例如粉末化的)赋形剂一起以粉末形式提供根据本发明的提取物或组合物。
本发明的固体或半固体剂型可含有多达约1000mg，例如多达约800mg的制剂。
本发明的提取物或根据本发明第三方面的组合物可以以单位剂型的形式提供，所述单位剂型含有限定浓度的具有抑制血小板聚集活性的化合物。可对这样的单位剂型进行选择以达到期望水平的生物活性。例如，单位剂型可含有多达1000mg(干重)量的根据本发明的水果提取物或组合物，更典型地多达800mg，例如50mg至800mg，例如100mg至500mg。在单位剂型中可包含的提取物或组合物的具体量可选自50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg和800mg。
给药方案
需要向对象施用的根据本发明第一方面使用的提取物或根据本发明的组合物的量将取决于多种因素。例如，当对象是人时，所需量将取决于所进行的或将要进行的运动类型、运动的持续时间、人的健康水平以及还有诸如对象的年龄、性别和体重的因素。
对于根据方法1.1(参见下文实施例1)制造的液体提取物，根据本发明的水果提取物的推荐日剂量为0.5g至20g且更优选2g至7g。日剂量可为约3g。对于人而言，在人进行运动的每一天中，典型的剂量方案可为每千克体重约70mg至285mg，优选地约25mg至100mg。
对于根据方法1.2(参见下文实施例1)制备的粉末提取物，推荐日剂量可为10mg至500mg，且更优选地为约85mg至约150mg。对于人而言，在人进行运动的每一天中，典型的剂量方案可为每千克体重约1mg至2.25mg。
根据本发明第三方面的优选组合物包含水溶性番茄提取物(例如，以在前面段落中所讨论的量)和膳食硝酸盐源，所述膳食硝酸盐源每剂量提供25mg至250mg的硝酸盐，优选地每剂量50mg至150mg的硝酸盐，且最优选地每剂量约100mg的硝酸盐。最优选的是，在含有低水平硝酸盐的组合物中包含硝酸盐。优选地，所述组合物每剂量包含小于400mg的硝酸盐。
根据本发明第三方面的最优选组合物包含水溶性的番茄提取物(例如，量为每剂量约3g液体提取物)和膳食硝酸盐源(例如，每剂量约100mg硝酸盐)以及叶酸。可包含的叶酸为每剂量10μg至500μg，优选为每剂量50μg至400μg，更优选为每剂量10μg至300μg；且最优选为每剂量约200μg。
优选的是，对象在运动之前接受一定剂量的提取物(以及任选的硝酸盐和叶酸)。优选地，在运动之前的任何时间口服使用提取物(以及任选的硝酸盐和叶酸)。例如，如果打算在下午或晚上进行运动，那么可在早上或午餐时间服用一定剂量。优选地，所述剂量在运动前0至5小时且更优选地在运动前1.5至3小时进行服用。
因此，根据本发明的第四方面，提供了包含根据本发明第三方面的组合物的剂型，所述组合物包含25mg至250mg的硝酸盐。
优选的是，所述剂型包含约100mg的硝酸盐。
所述剂型可包含10μg至500μg的叶酸，优选地每剂量50μg至400μg，更优选地每剂量10μg至300μg；且最优选地每剂量约200μg。
在给药方案的标题下，剂型可包含如上所述的茄科水果水溶性提取物。
用于人类消耗的优选组合物
提取物或组合物可作为食品补充剂或食品添加剂提供，或者可被并入食品(例如功能性食品或营养食品)中。
凝胶产品
消耗用含水凝胶产品作为食品补充剂代表了根据本发明的优选组合物。可将这样的凝胶包装起来使得可在运动之前将包装撕开并使用凝胶。
凝胶产品含有如上定义的茄科水果水溶性提取物。优选地，所述凝胶包含如上面所讨论的膳食硝酸盐源或内源性一氧化氮前体，并且最优选地还包含叶酸或其衍生物。凝胶产品可另外地包含一种或更多种电解质、碳水化合物、抗氧化剂、防腐剂、调味剂和甜味剂。
凝胶应包含形成可食用凝胶的合适试剂，其具有从包装中挤出的恰当稠度并且容易使用。
可使用本领域已知的许多合适的凝胶剂。例如，可使用结冷胶(例如kelcogel-f)。在一些实施方案中，凝胶可包含两种凝胶剂。例如其可包含结冷胶和黄原胶。
在wo2007/083117中限定并根据所公开方法制造了优选的凝胶(例如，如在说明书第19页至22页描述的)。应理解，如在wo2007/083117中所公开的，根据本发明的凝胶可以是等张的，但不需要供本发明来使用。例如，下文和实施例中所讨论的优选产品不是等张的。本领域技术人员应理解，可根据需要容易地调整产品的张力。
根据本发明使用的最优选凝胶产品可具有以下范围的成分：
给予人类运动员的典型剂量会是10ml至200ml的上述凝胶，优选20ml至150ml的凝胶，更优选30ml至100ml的凝胶，更优选40ml至80ml的凝胶且最优选约60ml的凝胶。
应理解，配制用于口服使用的凝胶之本领域技术人员可调整或替换多种上述成分。例如，麦芽糖糊精可用作能量来源，并且当在这种情况下时，可将水的量降低高达50％。
可选择调味剂以制备所选味道的凝胶。例如，优选的凝胶具有香蕉味和芒果味。或者，可使用黑醋栗、橙子或热带风味调味剂(tropicalflavour)。
粉末产品
根据本发明的提取物和组合物还可以以用于重构成溶液的粉末形式提供。因此，其还可包含水溶性赋形剂(例如糖)、缓冲剂(例如柠檬酸盐缓冲剂和磷酸盐缓冲剂)，并且可包含由碳酸盐(例如碳酸氢盐，如碳酸氢钠或碳酸氢铵)和固体酸(例如柠檬酸或酸柠檬酸盐)形成的泡腾剂。
根据方法1.2(下文)制备的粉末提取物优选地以粉末产品使用。
可使用粉末混合物来填充小袋。优选的小袋混合物会包含膳食硝酸盐源，并且最优选的小袋混合物会含有叶酸。典型的小袋粉末可包含：
用于这样的小袋混合物的示例性调味剂包括柠檬调味剂和浆果调味剂。
可将这样的小袋粉末分成10g至150g，更优选约25g至75g且最优选分成50g量的剂量单位并密封在小袋中。在使用时，可将粉末与50ml至250ml的水混合并在运动开始之前使用。
或者，可将粉末配制(例如，通过将粉末与任选使用的结合剂进行压缩)成可分散片剂(也称作fizz片剂)。典型的可分散片剂可制成含有以下量的成分：
这样的片剂可以是1g至30g，优选2至20g，且最优选地配制成10g的片剂。在使用时可将10g的片剂溶解在50ml至250ml的水中并在运动开始之前使用。
食品棒
根据本发明使用的提取物或根据本发明第三方面的组合物还可以以粉末形式提供以并入到快餐食品棒(例如水果棒、坚果棒和谷物棒)中。对于以快餐食品棒形式提供而言，可将所述提取物或组合物与任何一种或更多种选自以下的成分混合：干燥的水果(例如晒干的番茄、葡萄干和小葡萄干)，花生或谷类(例如燕麦和小麦)。
优选的食品棒可制成包含以下量的成分：
例如，调味剂可以是苹果和黑醋栗、巧克力或蓝莓。
应理解，食物棒的尺寸可以改变，这会取决于多种因素(包括棒a中包含的水溶性提取物和任选的硝酸盐和叶酸的量，并且棒通常可以是10g至200g，优选20g至60g且最优选约40g。应该在运动之前摄入食物棒以达到最佳效果。
实施例5中限定了包含根据本发明的提取物的最优选产品。
本发明的提取物或组合物或其制剂可连同施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。
有效性的指标
可参照多个不同参数来评估包含本发明提取物的组合物提供有益效果的能力。
下文的实施例提供了用于评估血小板聚集或初期凝血的合适方案的细节，可针对其中的任一项进行研究以评价治疗有效性。实施例中描述的
凝血酶生成能力的测量是通常用于评估血液疾病或抗血栓治疗功效的标准方案，并且可通过自动凝血计进行或手动地进行。
源于循环细胞的微粒是促凝血能力和炎症的指标，并且可通过流式细胞术方法进行最准确的测定，但是也存在其他方法。
最常见地，通过elisa或通过自动化系统(例如luminex)进行il-6的测量。il-6是最广泛接受的炎症生物标志物之一。
因为涉及到多个系统，所以从运动中恢复的评估是复杂的。然而，简单的健康测量对于监视恢复相当不错，一些最常用的测量包括：测量血浆去甲肾上腺素水平；在运动环节之前和之后监测肌肉强度和力量；运动后评估肌肉酸痛(例如，使用经过验证的问卷来测量doms-延迟性肌肉酸痛(delayedonsetmusclesoreness)的程度)；记录睡眠障碍(例如，使用测量睡眠期间肢体运动的设备)；评估压力和疲劳(例如，使用poms-心境状态量表(profileofmoodstates)-或经验证用于运动员的修改的poms问卷)；监测运动期间的运动自觉量(ratesofperceivedexertionduringexercise)(例如，使用经验证的问卷系统)；监测活动期间的心脏速率以及监测整体情绪(例如，使用经修改的poms问卷)。研究中已证明了这些变量是有效恢复的可靠指标。还证明了doms与循环il-6水平有关。
本发明的另一些方面
根据本发明的又一个方面，提供了促进从剧烈运动中恢复的方法，所述方法包括向有治疗需要的对象施用具有抑制血小板凝集活性的茄科水果水溶性提取物。
根据本发明的再一个方面，提供了预防运动诱发的全身性炎症或降低其严重程度的方法，所述方法包括向有治疗需要的对象施用具有抑制血小板聚集活性的茄科水果水溶性提取物。
根据本发明的再一个方面，提供了具有抑制血小板聚集活性的茄科水果水溶性提取物用于在对象中治疗或预防运动诱发的全身性炎症的用途。
根据本发明的再一个方面，提供了具有抑制血小板聚集活性的茄科水果水溶性提取物在制备用于在对象中治疗或预防运动诱发的全身性炎症的药物中的用途。
根据本发明的再一个方面，提供了具有抑制血小板聚集活性的茄科水果水溶性提取物在用于促进从剧烈运动中恢复的用途。
根据本发明的再一个方面，提供了具有抑制血小板聚集活性的茄科水果水溶性提取物在制备用于促进从剧烈运动中恢复的药物中的用途。
附图说明
现将通过以下实施例并参照附图来举例说明本发明，但本发明不受实施例限制，其中：
图1：示出了如实施例3中所讨论的，用水溶性番茄提取物(wstc，water-solubletomatoextract)孵育富含血小板的血浆对响应于凝血酶和肾上腺素的血小板聚集的影响。
图2：示出了如实施例3中所讨论的，用水溶性番茄提取物(wstc)处理对暴露于凝血酶和肾上腺素的血小板中微粒释放的影响。
图3：示出了如实施例3中所讨论的，用水溶性番茄提取物(wstc)处理对暴露于经凝血酶和肾上腺素活化的血小板和微粒后il-6的内皮细胞释放的影响。“con-”表示未经活化血小板-白细胞悬液处理的对照huvec细胞。“con+”表示经血小板-白细胞悬液处理且使用盐水处理的huvec细胞。wstc表示经活化血小板-白细胞悬液孵育且使用wstc进行处理的huvec细胞。
图4：示出了如实施例4中所讨论的，用水溶性番茄提取物(wstc)+膳食硝酸盐(no3)，以及水溶性番茄提取物(wstc)+膳食硝酸盐+叶酸孵育富含血小板的血浆对响应于凝血酶和肾上腺素的血小板聚集的影响。
图5：示出了如实施例4中所讨论的，用水溶性番茄提取物(wstc)+膳食硝酸盐(no3)，以及水溶性番茄提取物+膳食硝酸盐+叶酸处理对暴露于凝血酶和肾上腺素的血小板中微粒释放的影响。
图6：示出了如实施例4中所讨论的，用水溶性番茄提取物(wstc)+膳食硝酸盐(no3)，以及水溶性番茄提取物+膳食硝酸盐+叶酸处理对暴露于经凝血酶和肾上腺素活化的血小板和微粒后il-6的内皮细胞释放的影响。“con-”表示未经活化血小板-白细胞悬液处理的对照huvec细胞。“con+”表示用血小板-白细胞悬液处理且使用盐水处理的huvec细胞。wstc+no3和wstc+no3+叶酸表示经活化血小板-白细胞悬液孵育且分别使用wstc+no3或wstc+no3+叶酸进行处理的huvec细胞。
图7：健康对象(n＝3)在基线处(补充前)，运动前(补充后)以及运动后的血小板源微粒计数。p＝安慰剂补充。ff＝wstc、膳食硝酸盐和叶酸的优选组合，如实施例6中所讨论的。
图8：健康对象(n＝3)在基线处(补充前)，运动前(补充后)以及运动后的血浆凝血酶产生能力(nm)。p＝安慰剂补充。ff＝wstc、膳食硝酸盐和叶酸的优选组合，如实施例6中所讨论的。
图9：健康对象(n＝3)在基线处(补充前)，运动前(补充后)以及运动后的循环血浆il-6浓度(pg/ml)。p＝安慰剂补充。ff＝wstc、膳食硝酸盐和叶酸的优选组合，如实施例6中所讨论的。
具体实施方式
实施例1
通过以下方案制备了具有抑制血小板聚集活性的番茄的水溶性提取物：
1.1根据本发明可使用的液体(浆液)提取物是按照wo2010/049707的实施例2和图2的方案制备的。
1.2根据本发明可使用的粉末提取物(糖含量低)是按照wo2010/049707的实施例3和图4的方案制备的。
实施例2
实施例2提供了制备根据本发明第三方面的优选组合物的方法，所述组合物包含水溶性番茄提取物、膳食硝酸盐源和叶酸源的组合。
2.1水溶性的番茄提取物应如实施例1中概述地获得和制备。浓度为430μg/ml的该提取物的溶液通过将实施例1.1中所述的提取物进行稀释，或者通过将实施例1.2中所述的粉末状提取物溶解在去离子水中来制备。将所得的430μg/ml溶液缓冲至ph7.4以供实验方案使用，在实验方案中将其进一步稀释十倍以得到43μg/ml的最终工作浓度。该浓度代表了在摄取最优选单位剂量(3g液体提取物(1.1)，150mg粉末提取物(1.2))约3小时后，提取物中抗血小板化合物的最大计算循环血浆浓度。
2.2富含膳食硝酸盐的提取物来自diananaturals，france。其包含约60brix的水溶性唐莴苣提取物，所述提取物含有约20g/l水平的无机硝酸盐和小于150mg/l水平的无机亚硝酸盐。通过将原提取物稀释于去离子水中制备了硝酸盐浓度为186mg/ml的该提取物的溶液。将所得溶液缓冲至ph7.4以供实验方案使用，在实验方案中将其进一步稀释十倍以得到18.6mg/ml的最终工作浓度。唐莴苣提取物的该浓度相当于372ng/ml硝酸盐的最终工作浓度。基于其中膳食硝酸盐已以植物提取物的形式消耗的公布数据，可在消耗100mg剂量的膳食硝酸盐3小时之后在血浆中获得该372ng/ml浓度的硝酸盐(cermakn等，intjsportnutrexercmetab2012，22，64-71)。
2.3叶酸的来源是来自供应商dmsk的folicacidep/bp。这种材料是不溶于水的，因此通过将其溶解在稀酸中制备了50ng/ml浓度的这种材料的溶液。制备好后便将所得溶液成功地缓冲至ph7.4而不发生材料沉淀，并用于实验方案中，其中将其进一步稀释十倍以得到5ng/ml的最终工作浓度。这对应于补充有供应200μg叶酸的ukrda的多种维生素/矿物质补充剂(navarrom等，jacn，2003，22，124-132)3小时后的典型血浆叶酸浓度。
2.4使用如上所述获得并制备的组分，通过将等量的2.1中所述制备的提取物溶液与2.2中所述制备的膳食硝酸盐溶液进行混合制备了混合物。当在实验方案中将这种混合物稀释十倍时，得到了最终浓度为43mg/ml的提取物和最终浓度为372ng/ml的膳食硝酸盐。这些量代表了在从5g唐莴苣提取物中摄取100mg膳食硝酸盐和3g糖浆提取物(1.1)3小时后，预期在血浆中循环的各成分的近似浓度。
2.5使用如上所述获得并制备的组分，通过将等量的2.1中所述制备的提取物溶液、2.2中所述制备的膳食硝酸盐溶液与2.3中所述制备的叶酸溶液混合制备了混合物。当在实验方案中将这种混合物稀释十倍时，得到最终浓度为43mg/ml的提取物、372ng/ml的膳食硝酸盐和5ng/ml的叶酸。这些量表示在摄取3gwstc糖浆浓缩物、5g唐莴苣提取物中的100mg膳食硝酸盐、以及200μg叶酸3小时后，预期在血浆中循环的各成分的近似浓度。该活性成分混合物代表了根据本发明第三方面的优选组合物。可向该混合物中添加凝胶剂和其它赋形剂以制出体积为60ml的最终凝胶产品。
实施例3
本发明是基于这样的研究，其出乎意料地证实了水溶性番茄提取物调节三种生物学系统，这三种生物学系统受剧烈运动影响，并且代表由剧烈运动所导致的炎症应答的不同方面。这三种生物系统是：血小板——已知由于运动诱发的凝血酶和肾上腺素释放到血液中以及循环一氧化氮的耗竭而被剧烈运动强烈活化的凝血系统的一部分；源于循环血浆细胞的微粒，其为血小板和白细胞激活及炎症的指标；以及内皮细胞细胞因子释放，特别是细胞因子il-6，其为经验证的炎症的最佳标志物之一。可以认为，剧烈运动诱发导致全身性炎症的连锁反应，其以血小板活化和血小板-白细胞微粒释放开始，随后由于暴露于经活化血细胞及所产生微粒而发生内皮细胞细胞因子释放。这种全身性炎症可导致从运动中恢复的延迟并且难以保持表现改进所需的高强度运动环节。
本发明人研究了不同量的水溶性番茄提取物组分在预防凝血酶和肾上腺素诱导的血小板聚集，血小板和白细胞中促凝血微粒和促炎微粒的释放，以及内皮细胞细胞因子释放中的功效。所使用的凝血酶和肾上腺素的水平与在高强度运动期间血液中测得的水平相一致。
3.1.方法
3.1.1用作处理溶液的番茄提取物和对照溶液的制备
为了制备适合在检验其生物活性的实验中使用的番茄提取物的溶液，将如实施例1中所述制备的62°brix的液体番茄提取物如实施例2.1中所述稀释至430μg/ml的浓度。制备磷酸盐缓冲盐水(pbs，sigma-aldrichuk)作为对照溶液。
3.1.2测定抑制血小板聚集之活性的方法
设计了以下描述的实验方案以比较由凝血酶类似物trap(thrombinreceptoractivatingpeptide，凝血酶受体激活肽)和肾上腺素(与剧烈运动负荷有关)的组合引发的血小板聚集在将血小板与所制备的提取物或对照一起孵育后实现的抑制程度。
静脉采血(phlebotomy)和血液样品
从未服用药物、具有正常血小板功能、年龄为18岁至60岁的男性和女性健康人类志愿者中采集了用于体外研究的血液。对象声明他们在提供血液样品之前至少10天没有摄入过药物或已知影响血小板功能的补充剂。在通过硅化针单次静脉穿刺到肘前静脉内后，将血液收集到柠檬酸化的塑料血液收集管中(sarstedtmonovettes，柠檬酸钠的最终浓度13mmol/l)。从采血时间开始将所有血液保持在37℃。
富血小板血浆的制备
通过将柠檬酸化血液在200×g下离心15分钟得到富血小板血浆(platelet-richplasma，prp)，并在使用前用贫血小板血浆将其调节至320±20×109/l的标准血小板数。prp用于两小时内的血小板功能测量。
血小板激动剂
下述激动剂用于血小板功能测量。trap，最终浓度为2nmol/l；肾上腺素，最终浓度为0.15μmol/l(均来自sigma-aldrich，poole，uk)。在临使用之前将原液稀释到温热生理盐水(0.9％nacl)中来制备激动剂，并混合以得到组合的trap/肾上腺素激动剂。在这些浓度下，两种激动剂都不能单独诱发血小板的聚集反应。然而，在组合时，肾上腺素对trap的增强作用导致了强烈的血小板响应。
将处理溶液(3.1.1)与prp一起孵育
将180μlprp与20μl制备的处理溶液或对照溶液在37℃下在低滞留离心管中一起孵育10分钟。
血小板聚集和聚集抑制的测量
在与血小板抑制剂一起孵育后，将prp样品转移到玻璃比色皿中并在血小板聚集仪(aggram，helenabiosciences，sunderland，uk)上监测由组合的trap/肾上腺素激动剂诱导的聚集程度10分钟。由生成的聚集曲线计算每个prp样品的曲线下面积，并通过将这些prp样品的曲线下面积与对照样品的曲线下面积进行比较计算了由所述处理溶液所实现的聚集抑制。结果示于图1。
3.1.3测定源于细胞的微粒释放的方法
设计了下述实验方案以比较在所制备的提取物或对照的存在下，在暴露于凝血酶和肾上腺素(与剧烈运动负荷有关)的组合之后，由完整血小板释放的源于血小板的微粒的数目。
静脉采血和血液样品
如上在3.1.2中所描述的，从未服用药物、具有正常血小板功能、年龄为18岁至60岁的男性和女性健康人类志愿者中采集了用于体外研究的血液。
贫血小板血浆的制备
在10分钟的收集中，在室温下将柠檬酸化的全血以2000g离心20分钟以分离贫血小板血浆(platelet-poorplasma，ppp)。
激动剂的制备
用于以设计成模拟剧烈运动的方式刺激血小板活化的激动剂也是凝血酶与肾上腺素的组合，并且如上述3.1.2中所述制备了这些激动剂。
提取物和对照溶液的制备
如上文3.1.2所述制备了用于与制备的ppp一起孵育的处理溶液和对照溶液。
将处理溶液与ppp一起孵育
将180μlppp与20μl制备的处理溶液或对照溶液在37℃下在低滞留离心管中一起孵育10分钟。
测量用凝血酶-肾上腺素处理之前和之后的微粒
通过允许对溶液/悬浮液中的标记颗粒进行定量的流式细胞术检测了源于血小板的微粒。通过添加trap/肾上腺素的组合激动剂或pbs活化了经处理溶液或对照溶液预处理的ppp样品，并使其静置10分钟。然后将活化样品与不同的荧光标记抗体一起孵育。将抗cd61-percp单克隆抗体(bdbioscience，sanjose，ca，usa)用于检测源于血小板的微粒。将抗cd45-pe(bdpharmingen，bdbioscience)单克隆抗体用于标记lmp。将与pe和percp缀合的同种型对照(igg1，bdbioscience)用于限定背景噪音。在室温下将25μl的活化ppp用5μl各抗体在黑暗中一起孵育20分钟，然后添加470μl的冷(4℃)facsfiow(facsfiowsheathfluid，bdbioscience)。
使这些样品通过facscalibur流式细胞仪并在微粒门内(在＜1μ，通过1μ珠测定)对抗体标记的颗粒进行计数。在以高流率计数100秒之后用cellquest软件(第2版：bdbiosciences)获得数据并对其进行分析。通过读取体积计算出每个样品中的微粒浓度，读取体积通过读取时间乘以样品流率来估算。结果表示为微粒数目/μlppp，并示于图1中。
3.1.4测量与番茄提取物处理溶液和对照溶液一起孵育的内皮细胞中的il-6释放的方法.
处理提取物和对照提取物的制备
如上文3.1.2所述制备了用于与细胞悬液一起孵育的处理溶液和对照溶液。
在处理提取物和对照提取物的存在下，制备活化的血小板-白细胞悬液和未活化的对照悬液
将450μl柠檬酸化全血等分至2个12ml低滞留管中。向每个管中添加由原始原液稀释十倍的4.5ml的经稀释裂解试剂(haemolyse，sigma-aldrichuk)，将管加盖并充分混合，并在室温下静置10分钟。然后将溶血样品以400g离心10分钟。将4.5ml的上清液移除并弃去。向沉淀中添加250μlhepes-mg缓冲液，混合并转移至离心管(eppendorff)中。用另外的250μlhepes-mg缓冲液洗涤管，并转移洗涤液以得到约1ml的体积。将悬液混合，然后如前进行离心。将900μl的上清液移除并弃去。向每个管中剩余的100μl中添加250μlhepes-mg缓冲液并将悬液充分混合。使用希森美康血液学分析仪(sysmexhaematologyanalyser，sysmexuk)对悬液中的细胞进行计数，并调整最终悬液体积以得到3.3×10^3/μl至3.4×10^3/μl的白细胞细胞计数。
向一种悬液中添加一定量的trap/肾上腺素激动剂使得原液被稀释十倍，并且产生了活化细胞悬液。向第二种悬浮液中添加pbs和10μl前列腺素e2溶液以将细胞保持在未活化状态。
内皮细胞培养物的制备
在t75cm瓶的ebm-2培养基(lonza，switzerland)中培养了人脐静脉内皮细胞(huvec)(lonza，switzerland)，所述培养基中添加有对所述培养基特定的由生长因子和抗生素组成的egm-2bullet-kit补充剂。在5％co2的存在下，将细胞保持在37℃。每2天更换该培养基，并且总是在细胞融合之前进行传代培养。
在约75％融合时，将细胞传代培养到6孔板中。首先将t75瓶中的培养基弃去，并用约2ml的d-pbs(lonza，switzerland)将剩余的单层细胞洗涤三次。在这之后立即添加2ml胰蛋白酶(lonza，switzerland)以便使细胞层与瓶壁分开。然后在显微镜下检查该瓶(t75)以确保从烧瓶底部移除所有细胞。2分钟后，添加约2ml胎牛血清(foetalbovineserum，fbs)以抑制细胞被胰蛋白酶消化。之后，测量剩余的体积并添加填充6孔板所需的剩余部分的培养基(每孔2ml)。将板维持在37℃，直至细胞100％融合1至2天，之后进行进一步的处理。
内皮细胞的处理
在emb-2中用如上所述制备的处理溶液或对照溶液将融合的huvec培养24小时。孵育前在细胞培养基中将处理溶液和对照溶液稀释，并以足以达到使所制备原液稀释十倍的量添加。
在处理24小时后，将培养基收集到每孔等份的3个孔中，在液氮中快速冷冻并在-80℃下储存。将新鲜的培养基添加到细胞中以进行进一步处理。将细胞用3ng/ml的tnf-α或1ml如上所述的活化血小板-白细胞悬液再孵育24小时，维持其中一个孔没有刺激物以便进行对照。
测定释放的il-6的方法
通过制造商说明书(biosource，uk)所述，通过elisa检测了il-6。简言之，将1：2稀释的细胞培养物上清液(100μl)孵育1小时，然后将孔用洗涤缓冲液洗涤4至5次并填充100μl抗il-6缀合物和50μl溶液a。在室温下孵育1小时后，再次洗涤孔并向每个孔填充200μl发色团并孵育15分钟。通过添加100μl的终止液终止反应。在450nm处读取吸光度值。通过测定试剂盒中提供的不同il-6标准(浓度为16pg/ml至1690pg/ml)获得了标准曲线。
实验3.1.4的结果示于图3中。
3.2结果
所述实验的结果以图表形式示于图1、图2和图3中。
3.3结论
所进行的实验表明，茄科水果的水溶性提取物能够抑制依赖于剧烈运动的血小板活化，其特征为凝血酶和肾上腺素介导的活化的增加，并且这种增加基本上不受已知抗血小板药物影响。此外，提取物的这种基本作用导致了血小板微粒释放的抑制，这是血小板活化的结果。血小板微粒构成了循环细胞微粒群体的约70％，并且被确认为在整个身体中运行的重要炎症信号传导系统。其还是高度促凝血的并且能够在停止运动后加快凝血酶释放并维持促凝血状态和促炎状态多个小时。证明由凝血酶和肾上腺素产生的血小板和白细胞微粒对内皮细胞的作用是使内皮细胞中的il-6释放增加。用生理学相关量的根据本发明的提取物溶液对内皮细胞进行预处理显示出抑制这种il-6释放，导致血管内皮细胞的炎症状态降低。在另一些研究中已经证明循环il-6的抑制影响恢复时间并延迟肌肉酸痛的发作。因此，在剧烈运动前用茄科水果的水溶性提取物进行预处理有助于促进运动后的恢复。
实施例4
本发明人还测试了实施例2中所述的根据本发明第三方面的优选组合物在预防实施例3中测试的生物系统活化中的功效。
4.1方法
4.1.1用作处理溶液的水溶性番茄提取物与膳食硝酸盐源和叶酸的组合的制备，和对照溶液的制备
为了用于测试茄科水果水溶性提取物与膳食硝酸盐和叶酸的组合的生物活性的实验，使用了实施例2.4和2.5中描述的优选制剂。制备pbs用作对照溶液。
4.1.2测定抑制血小板聚集之活性的方法
准确详细地遵循3.1.2中描述的实验方案，不同之处在于使用如4.1中所述的处理溶液。结果示于图4中。
4.1.3分析源于细胞的微粒之释放的方法
准确详细地遵循3.1.3中描述的实验方案，不同之处在于使用如4.1中所述的处理溶液。结果示于图5中。
4.1.4测量与番茄提取物处理溶液和对照溶液一起孵育的内皮细胞中的il-6释放的方法
准确详细地遵循3.1.3中描述的实验方案，不同之处在于使用如4.1中所述的处理溶液。结果示于图6中。
4.2结果
所描述的实验结果以图表形式示于图4、图5和图6中。
4.3结论
通过实施例4中所进行的实验，本发明人能够证明在添加或不添加叶酸的情况下，茄科水果水溶性提取物与膳食硝酸盐提取物之组合在生物活性方面的显著改善。在对暴露于活化血小板、白细胞和增加水平的相关微粒后的内皮细胞il-6释放、血小板聚集以及血小板微粒产生的影响方面，提取物与膳食硝酸盐和叶酸两者的组合经检测是最有效的。对于抑制运动诱发的血小板聚集和微粒释放，这种优选组合的功效是单独使用wstc之功效的两倍以上；而对于暴露于活化血小板和白细胞后内皮细胞中的il-6生成的抑制，其功效为几乎三倍。
这些结果表明，虽然茄科水果的水溶性提取物单独就出乎意料且有益地影响运动诱发的全身性炎症，但是可通过将其与膳食硝酸盐和叶酸组合来进一步实质性和创造性地增加其功效。
实施例5
鉴于所获得的有关显示出最佳整体功效的水溶性番茄提取物与一氧化氮源之组合的知识，本发明人继续开发出组合物，其可在剧烈运动之前和期间用于适当地递送这些组合。
5.1凝胶
根据wo2007/083117中公开的方法(如在说明书第19至22页描述的)制造了凝胶产品，不同之处在于没有将凝胶产品(见下文)设计为等张的。
根据本发明供使用的最优选的凝胶产品可包含：
＊调味剂可为香蕉和芒果。或者也可以使用黑醋栗(blackcurrent)、橙子或热带风味调味剂。
可使用例如凝胶包装机(例如由universalpack制造的)将凝胶包装到层压箔小袋中以确保保质期。典型的凝胶尺寸范围为约40ml至约100ml(例如，其可为60ml)。
5.2小袋粉末
可将粉末混合物制成包含以下量的成分：
在控制灰尘和湿度的合适工厂条件下，通过常规干混技术，例如使用螺条混合器或类似装置可制备这样的粉末混合物。可加入试剂(例如防结块剂)以确保所得粉末的自由流动。应当在严格防尘和控制湿度的条件下包装到合适的容器(例如桶或小袋)中。
可将粉末分成50g的剂量单位并密封在小袋中。在使用时将粉末与50ml至250ml的水混合并在运动开始前摄入。
5.3fizz片剂
可将可分散片剂(也称为fix片剂)制备成包含以下量的成分：
还可通过常规的干混技术(例如使用螺条混合器或类似装置)制备fizz片剂，其中整个过程在相对湿度小于10的控制大气条件下进行。可通过一系列能够根据期望片剂尺寸施加大约5吨至10吨压力的压片机由混合的干成分进行片剂的压制。必须在控制湿度的条件下将其包装到单独的小袋或多管中，并且单独的包装应包含足够的干燥剂材料以确保保质期和片剂稳定性。将这些片剂制成10g片剂。在使用时将片剂溶解在50ml至250ml的水中并在开始运动前摄入。
5.4食品棒
可将食物棒制成包含以下量的成分：
＊调味剂可以是例如苹果和黑醋栗、巧克力或蓝莓。
用于制备食物棒的适当方法包括将果汁加热到约100℃以除去部分水分，然后以干燥成分混合并进行巴氏灭菌。然后可将混合器内容物清空到托盘或输送带上，并使用工业辊将其轧制成合适高度，通常为10mm至15mm。在此过程中可采用风扇来冷却该混合物，在此之后，可使用机械剪床将棒切割成所需尺寸。可通过flowrap将棒单独地包装到铝箔中以保持新鲜度。
40g棒是合适的剂量单位并应在运动前摄入。
实施例6
本发明人还测试了如实施例5中所述以凝胶形式制造的根据本发明的优选组合物在预防与在70％最大摄氧量下进行规定时间的运动相关的血浆il-6水平增加、血小板和凝血系统活化中的功效。
6.1方法
6.1.1对象
募集了三名18岁至55岁的健康男性对象，其最大摄氧量在之前已被确定。
6.1.2补充剂
如实施例5中所述制备了两种测试凝胶。将凝胶包装于60ml体积的箔包中。处理凝胶(ff)含有3g水溶性番茄提取物(wstc)、相当于约100mg膳食硝酸盐的5.4g唐莴苣汁浓缩物、和约200μg叶酸。安慰剂凝胶含有3g葡萄糖浆代替这种混合物。
6.1.3运动方案
所有的对象均进行了两种运动方案，间隔至少72小时。对象在研究机构中都处于禁食状态，并使用柠檬酸三钠作为抗凝剂采集基线血样。给予对象规定早餐，其中摄入了单个测试凝胶，随机分配为处理(ff)或安慰剂(p)。90分钟后，取出预测试血液样品。然后让对象在70％最大摄氧量下在跑步机上跑步20分钟。在平板运动(treadmillrun)结束后，对象在90％最大摄氧量下跑步直至筋疲力竭。采集运动后的血样，然后给予对象小吃午餐并让其自由离开。对象在72小时后返回到机构并重复试验日，以并入剩余的测试凝胶。
6.1.5样品分析
在20分钟的收集中，在室温下将柠檬酸化全血以2000g离心20分钟以分离贫血小板血浆。将等分试样冷冻用于测定凝血酶产生能力，其为凝血系统的活性指标，其使用基于荧光的测定法(凝血酶产生测定法，technoclone，uk)来测量并用于测量血浆il6(如3.1.4中所述，通过来自biosource，uk的elisa进行)。将剩余的贫血小板血浆立即用于测定循环微粒，其为循环血小板的活性指标(如3.1.3中描述的)。
6.2结果
所述实验的结果以图表形式示于图7、图8和图9中。
6.3结论
通过实施例6中所进行的实验，本发明人能够证明与安慰剂相比，在20分钟的中度至剧烈运动后wstc、膳食硝酸盐和叶酸的组合在降低血小板和凝血系统的活化中的功效。与安慰剂相比，对于ff处理而言，这种凝血活化的减少伴随着循环血浆il6的降低。
在本实验中使用了血小板微粒计数作为血小板活化的指标。在ff或p测试组摄入测试凝胶后，基线微粒计数未显著改变。然而，运动后，与ff组的1.2倍相比，安慰剂组中循环血小板微粒的数目增加了1.9倍。即，与安慰剂相比，ff处理似乎使运动诱发的血小板微粒释放减少了约70％。
在摄入p凝胶之后，凝血酶产生能力没有从基线改变，但在摄入ff凝胶之后(运动前)降低了19％。这可能是由于对血小板功能的急性抑制。在p试验组中，运动后的凝血酶产生能力增加了2.2倍。在ff测试组中，与运动前水平相比，运动后的凝血酶产生能力增加了1.4倍；这表示从基线凝血酶产生能力1.1倍的增长。因此，尽管进行安慰剂处理的运动伴随着凝血酶产生能力从基线增加超过120％，但是ff处理有效地将这种增加限制至从基线增加13％。
基线il6水平没有受到任一凝胶的摄入(运动前)的影响。运动后安慰剂组中的循环il6水平增加了4.5倍，而在ff组中，该水平增加了2.6倍。因此，ff处理后的运动导致的血浆il-6增加仅为安慰剂处理后运动后所观察到的血浆il-6增加的42％。
总之，摄入ff处理显著降低了血小板微粒的运动相关释放以及运动诱发的全身性il6水平和血浆凝血酶产生能力的相关增加。这些结果表明，wstc、膳食硝酸盐和叶酸的优选组合可有益地影响运动诱发的全身性炎症，因此证明了根据本发明的组合物会促进从运动中恢复。
以下内容对应于母案申请中的原始权利要求书，现作为说明书的一部分并入此处：
1.具有抑制血小板聚集之活性的茄科(solanaceae)水果水溶性提取物，其用于在对象中治疗、减少、尽可能降低或预防运动诱发的全身性炎症。
2.根据项1所述应用的水溶性水果提取物，其中改善了对象从运动中的恢复。
3.根据项1或2所述应用的水溶性水果提取物，其包含番茄提取物的活性级分，所述级分包含基本上热稳定的无色水溶性化合物，所述化合物具有预防血小板聚集的活性并且分子量小于1000道尔顿。
4.根据项1至3中任一项所述应用的水溶性番茄提取物：
(a)其是基本上热稳定的；
(b)其是无色的或稻草色的；
(c)其是水溶性的；
(d)其由分子量小于1000的组分组成；且
(e)其包含选自以下的一种或更多种抑制血小板聚集的化合物：
(i)糖基化酚酸或酚酯或其衍生物；
(ii)糖基化类黄酮；和
(iii)核苷。
5.根据项4所述应用的水溶性水果提取物，其包含以下中的每一种：糖基化酚酸或酚酯或其衍生物；糖基化类黄酮；和核苷。
6.根据前述项中任一项所述应用的水溶性水果提取物，其包含为糖基化肉桂酸或其衍生物的糖基化酚酸或酚酯。
7.根据项6所述应用的水溶性水果提取物，其中所述糖基化肉桂酸或其衍生物选自包含以下的组：咖啡酰-4-o-奎尼酸、咖啡酰-4-o-葡糖苷、香豆酰-4-o-糖苷(葡萄糖苷/半乳糖苷)和香豆酰-4-o-糖苷(二糖)。
8.根据项1至5中任一项所述应用的水溶性水果提取物，其包含一种或更多种选自以下的糖基化酚酸或酚酯：咖啡酸葡糖苷；对香豆酸己糖/二氢山萘酚己糖；阿魏酸糖苷；和对香豆酸衍生物。
9.根据前述项中任一项所述应用的水溶性水果提取物，其包含选自槲皮素-3-o-葡糖苷和/或芦丁的糖基化类黄酮。
10.根据前述项中任一项所述应用的水溶性水果提取物，其包含一种或更多种选自包括以下的组的核苷：amp、尿苷、腺苷、鸟苷或gmp。
11.根据项1至10中任一项所述应用的水溶性水果提取物，用于促进从在对应于大于约60％最大摄氧量的强度下进行的运动中恢复。
12.如项3至11中任一项所限定的茄科水果水溶性提取物，其用于促进对象从运动中恢复。
13.组合物，其包含：
(a)具有抑制血小板聚集之活性的茄科水果水溶性提取物，其中所述提取物包含：
(i)分子量小于1000的组分；和
(ii)具有血小板聚集抑制活性的核苷、糖基化酚酸或酚酯或其衍生物、或者糖基化类黄酮中的一种或更多种；以及
(b)膳食硝酸盐的源或内源性一氧化氮的前体。
14.根据项13所述的组合物，其中所述提取物(a)如项3至11中任一项所限定。
15.根据项13或14所述的组合物，其中所述膳食硝酸盐的源(b)选自来自唐莴苣、芝麻菜、菠菜、大黄、草莓和莴苣的水溶性提取物。
16.根据项13或14所述的组合物，其中所述内源性一氧化氮的前体是瓜氨酸、谷氨酰胺或精氨酸。
17.根据项13至16中任一项所述的组合物，其包含叶酸或其代谢物。
18.根据项17所述的组合物，其包含选自5-甲氧基四氢叶酸或四氢叶酸的叶酸代谢物。
19.根据项1至12中任一项所述应用的水溶性提取物或根据项13至18中任一项所述的组合物，其为营养品、饮料、食品或食品补充剂的形式。
20.根据项1至12中任一项所述应用的水溶性提取物或根据项13至18中任一项所述的组合物，其被配制为凝胶、粉末、食物棒或可分散片剂。
21.剂型，其包含如项13至20中任一项所限定的组合物或提取物，并且包含25mg至250mg硝酸盐。
22.根据项21所述的剂型，其包含10μg至500μg叶酸。
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！