专利名称：水果提取物的制作方法
技术领域：
本发明涉及预防血小板聚集并可用作抗血栓剂的水果提取物以及制备所述提取物的方法。已明确，摄入水果和蔬菜是可降低心血管疾病风险的重要预防性措施。因此，已经进行了相当多的尝试来鉴定在预防心脏病方面起作用的来源于水果和蔬菜的化合物。人们已表现出对抑制血小板聚集的药剂特别有兴趣。当血小板在循环系统内聚集时，形成大至足以阻塞血管的血栓。然而，在发生完全聚集(full aggregation)之前，血小板可以以活化状态循环。在这种状态下，血小板粘性大大增加，并且它们可彼此粘结，与其它血细胞粘结或者与血液成分(如富脂质乳糜微粒)粘结。这使得形成微聚集体，降低血液流动性、影响局部血流和全身循环。降低血小板聚集性有助于维持血液呈流动和低凝固状态。这通过防止循环内形成微聚集体和防止血小板与血管壁或脂肪斑相粘结而有助于使血流正常化。鉴于此，人们公认，能够抑制血小板聚集的药剂可用于预防冠状动脉疾病(例如心肌梗塞和中风)以及预防患有心肌梗塞、中风或不稳定型心绞痛的患者中进一步的血栓栓塞事件。此外，这些药剂可用于预防血管成形术和旁路手术后的再狭窄。此外，这些药剂还可用于治疗由血栓栓塞性疾病(例如心肌梗塞)与溶栓治疗相结合而引起的的冠状动脉疾病。有多种已知的作用于血小板产生和起作用的不同阶段的抗血小板聚集剂。阿司匹林(乙酰水杨酸)是应用和研究得最广泛的。双嘧达莫和噻氯匹定也被使用。阿司匹林的抗血小板活性归因于不可逆地抑制血小板环氧合酶，由此防止血栓烷A2( —种引起血小板聚集的化合物)的合成。吲哚布芬是血小板环氧合酶的可逆抑制剂。一些化合物是血栓烷 A2合酶的直接抑制剂，例如吡吗格雷，或者用作血栓烷受体的拮抗剂，例如磺曲苯。国际专利申请WO 99/55350公开了表现出抑制血小板聚集能力的来自多种水果的水溶性提取物。认为出乎意料的是，发现抗血小板聚集活性是水溶性的，因为相比较而言，当时本领域中已知的活性提取物是脂溶性化合物(例如番茄红素)。发现这些水溶性提取物具有预防或降低血小板聚集的显着效力，并且已经作为具有健康益处的营养补充剂经食品标准局(Food Standards Agency)批准在欧洲上市。通过质谱(MS)和核磁共振(NMR)谱对WO 99/55350中水果提取物的活性成分进行了分析，发现其含有具有血小板聚集抑制活性的核苷混合物。本发明是基于本发明人的以下认识水溶性水果提取物内的核苷可能不是这些提 取物内唯一预防抗血小板聚集的化合物。因此，他们付出了相当多的努力来将WO 99/55350 中所述水溶性提取物中的活性剂进行进一步分级和表征，以试图提高这些提取物抑制血小板聚集的功效并且开发出加工水果以用于此用途的新方法。现已发现，可按照得到对血小板聚集具有最佳有益作用的水溶性提取物的方法加工茄科(Solanaceae)水果。这一新认识使得本发明人能够开发出具有抑制血小板聚集功效的新的水果提取物以及制备所述水果提取物的方法。
因此，本发明的第一个方面提供制备茄科家族水果提取物的方法，其中对水果进行加工以优化提取物的血小板聚集抑制活性，所述方法包括(a)制备勻浆水果的初始混合物；(b)从水果固体中分离出水溶性级分；(c)过滤所述水溶性级分；以及
(d)浓缩滤过液(filtration permeate)中的活性剂。本发明人决定分析WO 99/55350中所述水果提取物中的活性化合物(参见实施例 1)。本发明人出乎意料地发现，天然存在于植物中的许多化合物均有效抑制血小板聚集。这使他们认识到可对WO 99/55350中所述方法进行调整以开发出这样的方法其将得到所述活性剂成分被保留(即在水果加工过程中活性化合物的损失尽可能最小)或者所述活性剂在生产水果提取物过程中实际上被富集的提取物。经过反复试验后，他们确立了本发明第一个方面的方法的步骤，得到可有效降低血小板聚集并且包含存在于水果中之多种活性水溶性化合物的水果提取物。(a)制备初始混合物将整个水果(优选番茄)的果肉(具有或不具有果皮)均质化以形成果泥。或者，可将可商购的番茄泥用作制备初始混合物的原料。在用于制备提取物的原料是番茄泥的情形下，其优选是通过“冷破碎”(“cold-break”)方法而不是“热破碎”(“hot-break”)方法制得的。术语“冷破碎”和“热破碎”是番茄加工领域众所周知的，并且可商购的番茄泥通常是作为热破碎或冷破碎的果泥而销售的。冷破碎果泥可通过包括将番茄均质化然后进行将番茄加热至不超过约60°C的温度的热处理步骤的方法制得， 相比较而言，热破碎果泥是使均质化番茄经历约95°C温度的热处理，参见例如Anthon等， J. Agric. Food Chem. 2002,50,6153-6159 应当通过用水或水溶液(优选去矿物质水)稀释来调节这些果泥的稠度(不论是来自新鲜水果还是可商购的果泥)以形成“初始混合物”。本发明人发现，如果稀释所述初始混合物以使其包含少于33%的固体并且更优选少于20%的固体时，则可在最终水果提取物中实现最佳活性。在本发明的一个优选实施方案中，所述初始混合物包含约10%至 15%的固体(例如13%的固体)。本发明人发现，初始混合物的维持温度可对提取物活性具有显著影响。因此，优选维持温度不超过35°C，并且更优选不超过30°C。本发明人还发现，初始混合物的pH也影响根据本发明方法制得的提取物的活性。 混合物的PH应该是酸性的，优选低于pH 5. 5，在一个优选实施方案中，pH应该不高于约 4. 2。必要时，可通过添加柠檬酸来调节pH。此外，本发明人发现，还应该控制初始混合物的褐变指数(browning index)以优化最终提取物的活性。因此，初始混合物的褐变指数(定义为可溶性部分在420nm处的吸光度)在4%固体时优选不超过0.4AU。褐变指数是通过形成类黑精类(melanoidins)(基于糖类和氨基酸的多种组成的聚合缀合物)而引起的可见褐变的指标，其可通过以下步骤来测量在室温下以3500rpm将50mL初始混合物样品离心10分钟，取出一部分上清液，将其稀释至4%固体(用折光仪测量)，并且用分光光度计测量该溶液在420nm处的吸光度。本发明人还发现，如果控制初始混合物的温度、PH和褐变指数中的至少之一(如上文所述)，则根据本发 明方法的水果提取物的抗聚集活性提高。优选控制这些控制步骤的至少两个(例如温度和PH ；或者温度和褐变指数)，更控制优选温度、pH和褐变指数，如上文所述。最优选在pH小于4. 2时将初始混合物的温度维持在不高于30°C，并且褐变指数不超过0. 4AU。(b)从水果固体中分离出水溶性级分可利用多种标准技术从水溶性级分中除去水不溶性固体。 在此方法的该步骤中，优选从初始混合物中除去大颗粒(即粒径大于500μ )的水不溶性固体。所述固体可利用以下来除去(a)倾析器(例如Westfalia GEA倾析器)；(b)离心分离步骤(例如旋转盘式离心机)；或者(c)配有尺寸可调喷嘴的分离器(例如Westfalia MSB-15分离器，利用坯料 (blanks)和粒径0. 45的喷嘴的混合)。或者，可使固体沉降，并简单地手动倾析出水溶性级分。无论使用哪种方法，本发明人发现，对于在水溶性级分中保留最佳生物活性而言， 操作温度不应超过60°C。此外，优选通过设备的流速必须使得暴露于此60°C的时间不超过 60秒。理想地，应当在所述分离步骤之后冷却所得水溶性级分。当待贮存所述级分时，优选在分离之后立即将其冷却至< 8°C。在一个优选实施方案中，本发明方法的步骤(C)可使用倾析器，其运行温度为 40-45 "C。任选地，可在所述分离步骤之后进行二次澄清步骤(例如使用Alfa Lavaal澄清器)以产生澄清的水溶性级分，其中所有余留的不溶性物质的粒径均< 500μ，并且离心下来的固体(即在室温下以3500rpm离心10分钟后可肉眼观察到沉淀的物质)的体积占所述级分的< 1%。本发明人发现，如果所述澄清级分(不论是如何产生的)含有少于10%的总固体并且更优选含有约8%或更少的固体时，最终产物将维持最大活性组分浓度。(c)水溶性级分的过滤为了除去非常细小的颗粒物质(< 500μ)(例如蛋白质和大的聚合物物质如一些果胶)，应当然后过滤所述水溶性级分并保留滤过液。过滤可以一步式完成，或者在一系列过滤步骤中进行，从相对粗过滤步骤开始以除去较大颗粒的番茄皮和/或番茄肉的其它水不溶性碎片。然后可进行进一步的过滤步骤以得到基本上澄清的溶液，例如能在不损失固体的情形下通过0. 2 μ滤器的溶液。在一个优选实施方案中，本发明方法的步骤(C)包括微滤步骤，其使用配有陶瓷膜滤器的过滤单元(例如配有陶瓷膜滤器(例如Pall Membralox Ρ19-30多元件单元)的 Tetra Alcros错流过滤MF单元)。还可以使用螺旋卷式膜(Spiral-wound membrane)作为陶瓷膜的替代物。还可以使用超滤来替代微滤。可以接受多种孔径，例如1. 4μ，0. 1 μ ；但是本发明人发现，当使用0.1 μ的孔径时，滤过液对生物活性成分的富集最多(即生物活性成分损失尽可能小并尽可能除去非生物活性成分)。为了保持最佳生物活性，在此过滤步骤过程中，温度应当不高于约35°C，并且应当在除去过滤膜后立即将滤过液冷却至< 8°C。最终透过液的褐变指数应当不超过0. 4AU。本发明人发现，当最初的未过滤物质含有< 10%的固体并且当最终透过液含有约的固体和<0. 4AU的褐变指数时，生物活性成分的回收最大并且生物活性成分在过滤
透过液中达到最大富集(相对于未过滤物质而言)。根据步骤(a)-(c)除去的固体具有以下作用除去果皮和种子碎片、大分子量蛋白质和果胶以及类胡萝卜素(例如番茄红素)/在果胶和蛋白质存在下在水溶液中以液滴形式稳定化的其它脂质。因此，所述方法提供了制备作为水溶性提取物并且还基本上不含番茄红素的番茄提取物的方法。所述方法(特别是小心控制暴露于> 35°C (优选> 30°C )的温度的时间长度) 还确保所制得的不含番茄红素的水溶性提取物不发生导致产生可视褐变的化学降解反应 (Maillard反应)，如< 0. 4AU的褐变指数值所表明的。这保证氨基酸_糖复合物和类黑精聚合物(其可络合一些生物活性成分)的形成保持在最小水平。因此，所述方法得到其中生物活性成分含量被优化的提取物。在本发明方法的一个优选实施方案中，所述番茄提取物是基本上不含番茄红素并且能够通过0. 2 μ滤器而不损失固体的水溶性提取物，并且其褐变指数值< 0. 4AU。(d)浓缩透过液中的活性物质然后将水性滤过液进行进一步的浓缩/过滤步骤，以提供含有抑制血小板聚集的化合物的生物活性浓缩物。经过大量实验后，本发明人确定，如果要保留最终提取物的峰值生物活性或者要实现将生物活性物质富集在最终浓缩产物中，则需要小心控制浓缩步骤。发现其原因在于随着固体浓度增加，热依赖性和PH依赖性降解反应的进程加速。因此，他们认识到温度控制以及暴露于温度的时间对于浓缩提取物而言比对于稀提取物更关键。有几种方法可用于浓缩/富集水溶性物质_条件是提取物温度不允许升高至使得提取物中活性物质降解，并且不允许升高至高于约60°C (对稀级分而言)和低于40°C (对更浓的样品而言)。利用蒸发技术讲行浓缩减压下溶液的蒸发可以在温度不超过60°C的条件下进行。优选使用多效蒸发仪，以便当液体通过蒸发仪时可降低温度，保证更浓的材料不暴露于超过40°C的温度，而更稀的材料则可耐受高达60°C的温度。利用蒸发，可将水溶性提取物浓缩至高达70 %固体，例如至20 %固体，至50 %固体，或者至65%固体。在一个最优选的实施方案中，在步骤(d)浓缩之后，最终提取物包含 60-62%的固体。温度效应可通过测量褐变指数来定量。温度应当足够低，使得最终浓缩产物应当不超过0. 8AU。在步骤(a)、(b)、(c)之后并且利用步骤(d)的蒸发仪形成的最终浓缩物优选褐变指数< 0. 8AU, pH 4. 0-4. 3 和密度 1. 15-1. 20。
利用膜处理讲行浓缩或者，也可使用允许水通过膜而将所有其它成分保留在膜内的膜处理。具体技术的实例是反渗透或纳滤。此二者都可以用于在低温下(< 40°C )操作而将水溶性提取物浓缩至所需程度。干燥技术还可以使用干燥技术来从水溶性提取物中除去水。合适的干燥技术包括含有或不含有载体物质(例如马铃薯淀粉、木薯淀粉、麦芽糊精)的喷雾干燥、含有或不含有载体材料的真空鼓式干燥、或者含有或不含有载体材料的滚筒干燥。低糖水果提取物的制备上述方法被设计用于制备含有原始存在于水溶性提取物中的所有要素的浓缩物。在本发明的一个优选实施方案中，本发明第一个方面的方法可适于获得富集(例如25-35倍)有生物活性成分的浓缩物。将生物活性成分富集在水溶性提取物中可通过除去构成其干物质含量的最主要部分的可溶性糖来实现。低糖水果提取物可通过在上述步骤(a)、(b)和(C)之后，然后在上述最后浓缩步骤(d)之前在方法中使用另外一个步骤来制得。除去可溶性糖可通过以下步骤实现(1)沉淀，例如通过向溶液中添加乙醇至最终浓度为90%，这将导致游离葡萄糖、 果糖和蔗糖沉淀；(2)通过消化，通过酶(例如葡萄糖氧化酶)部分地除去游离糖；(3)通过微生物(细菌或酵母)处理；或者 (4)通过对提取物成分进行树脂介导的分离来从水溶性提取物中除去游离糖。优选通过对提取物成分进行树脂介导的分离来从水溶性提取物中除去游离糖 (上述(4))。本发明人开发了一种方法，其中应用食品级树脂(Amberlite FPX66)吸附除了游离糖、有机酸和盐之外的所有提取物成分。这些物质不被树脂吸附并且可在通过树脂之后弃掉。然后通过用乙醇/水混合物(例如50%乙醇或80%乙醇)洗脱来从树脂中回收被吸附到树脂上的提取物成分(其包括氨基酸、生物活性成分和褐变反应产物(Maillard 降解产物))。可通过减压下蒸发(例如在防爆的常规蒸发仪中，或者在旋转式离心浓缩器中)或者反渗透来从所得溶液中除去乙醇。除去糖后，可应用上述步骤(d)中所述的程序调节产物浓度。所得低糖提取物优选为含有初始基质中< 糖和> 95%生物活性成分的浓缩水溶液。水果提取物根据本发明第一个方面的方法制备的提取物代表具有出乎意料的预防血小板聚 集功效的新型水果提取物。因此，根据本发明的第二个方面，提供了根据本发明第一个方面的方法制得的能够抑制血小板聚集的水果提取物。本发明第二个方面的提取物可用于治疗(特别是预防)其发生特征在于不适当血小板聚集的疾病状态。本发明人证明本发明的提取物特别可用于
(a)预防或减少高凝状态(hypercoagulable state)或血栓前状态 (prothrombotic state)状态的发生，例如通常与例如糖尿病、炎性肠病、高血脂相关的；(b)预防或减少动脉粥样硬化的发生；(c)预防冠状动脉疾病(例如心肌梗塞和中风并且预防患有心肌梗塞、中风或不稳定型心绞痛的患者中的进一步血栓-溶栓事件)的发生；(d)预防血管成形术和旁路手术之后再狭窄的形成；(e)治疗由血栓_溶栓疾病(比如心肌梗塞)与溶栓治疗相结合而引起的冠状动脉疾病；(f)预防或减少深度静脉血栓的风险；(g)有益于循环以维持良好的循环健康；(h)维持心血管系统中的健康血流。应当理解，本发明的提取物具有通过降低血小板聚集来维持心血管和心脏健康、 有益于循环和/或使血流正常化或以其它方式有益于血流(例如在上述(g)和(h)中所述)的一般健康益处。实际上提取物的这些用途是非常有利的，本发明进一步提供了根据本发明方法制得的水果提取物，其用作使患者血流正常化或以其它方式有益于血流的药物。本发明还提供了包含糖基化酚酸或酚酯或其衍生物、糖基化类黄酮、以及核苷的水果提取物，其用作使患者血流正常化或以其它方式有益于血流的药物。包含本发明提取物的组合物可用作药物产品，并且还代表有益的功能性食品或 “营养品”。因此，所述组合物的优选用途是用作药物和功能性食品或饮料(如下文所述)。优选的本发明水果提取物是来自成熟的(即红色的)番茄的水性提取物并且是水溶性的。本文所用的术语“水溶性”意指在室温下(例如在25°C)可溶解的番茄提取物。 还发现所述提取物在非常低的温度下(例如在低至4°C的温度下)可溶于水。所述提取物不包含或包含可忽略不计的浓度的番茄红素。例如，所述提取物包含小于0. 5wt% (干重)的番茄红素，例如小于0. lwt%、或小于0. 05wt%、或小于0. 01wt%, 或小于0. 005wt%、或小于0. OOlwt %、或小于0. 0005wt%、或小于0. OOOlwt % (干重)的番茄红素。所述提取物基本上不含不溶于水的颗粒物质。因此，例如，它们包含小于0.5wt% (干重)的不溶于水的颗粒物质，例如小于0. Iwt %、或小于0. 05wt %、或小于0. Olwt %、或小于0. 005wt%、或小于0. 001wt%、或小于0. 0005wt%、或小于0. OOOlwt% (干重)的不溶于水的颗粒物质。在一个实施方案中，所述提取物不包含不溶于水的颗粒物质。本文所用的术语“活性级分”指从番茄提取物中分离出来的能够降低血小板聚集的级分。本发明人的研究(参见实施例1)证明可制得这样的水果提取物其中多种生物活性剂被富集或维持在提取物中，其随后可用于预防或治疗特征在于不适当的血小板聚集的医学病症。开发了本发明第一个方面的方法以维持所述生物活性剂。本发明人已确定了根据本发明制备的提取物包含多种生物活性分子，其包括(A)本发明提取物中的生物活性酚类化合物
本发明人已证实，水果中包含多种基于酚及其衍生物的分子并且具有预防血小板聚集的功效(参见实施例1)。已发现，尤其是肉桂酸及其衍生物可特别有效抑制血小板聚集。因此，设计本发明第一个方面的方法以保证提取物包含如式I所示的肉桂酸或其衍生物
权利要求
1.一种制备茄科(Solanaceae)水果提取物的方法，其中对所述水果进行加工以优化所述提取物的血小板聚集抑制活性，所述方法包括以下步骤(a)制备勻浆水果的初始混合物；(b)从水果固体中分离出水溶性级分；(c)过滤所述水溶性级分；以及(d)浓缩滤过液中的活性剂。
2.权利要求1的方法，其中维持所述初始混合物的温度不超过35°C。
3.权利要求1或2的方法，其中所述初始混合物的pH不超过5.5。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述初始混合物的褐变指数在4%固体时不超过0. 4AU，其中所述褐变指数定义为可溶性部分在420nm处的吸光度。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(b)将所述级分与粒径>500μ的不溶性固体分开。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(b)不包括将所述级分的温度升至高于 60°C的程序。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(c)得到会通过0.2μ滤器而不损失固体的溶液。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(d)不包括将所述级分的温度升至高于 60°C的程序。
9.前述权利要求中任一项的方法，包括在步骤(c)之后从所述水溶性提取物中除去游离糖的额外步骤。
10.根据权利要求9的方法，其中所述糖通过对提取物组分进行树脂介导的分离而除去。
11.一种制备基本上如实施例2或3所述的水果提取物的方法。
12.根据权利要求1-11中任一项的方法制得的水果提取物。
13.一种水果提取物，包含(a)糖基化酚酸或酚酯或其衍生物；(b)糖基化类黄酮；以及(c)核苷。
14.权利要求13的水果提取物，其中所述糖基化酚酸或酚酯是糖基化肉桂酸或其衍生物。
15.权利要求14的水果提取物，其中所述糖基化肉桂酸或其衍生物选自咖啡酰-4-0-奎宁酸、咖啡酰-4-0-葡糖苷、香豆酰-4-0-糖苷(葡萄糖/半乳糖)或香豆酰-4-0-糖苷(二糖)。
16.权利要求13的水果提取物，其中所述糖基化肉桂酸或酚酯选自咖啡酸葡糖苷；对香豆酸己糖/ 二氢山奈酚己糖；阿魏酸糖苷；以及对香豆酸衍生物。
17.权利要求13-16中任一项的水果提取物，其中所述糖基化类黄酮是槲皮素-3-0-葡糖苷或芦丁。
18.根据权利要求13-17中任一项的水果提取物，其中所述核苷选自包括AMP、尿苷、腺苷、鸟苷或GMP的组。
19.权利要求13-18中任一项的水果提取物，其中所述提取物包含表1中所述16种化合物中的每一种。
20.权利要求13-18中任一项的水果提取物，其中所述提取物包含表2中所述32种化合物中的每一种。
21.基本上如实施例2或3所定义的水果提取物。
22.权利要求12至21中任一项的水果提取物，用作治疗或预防以不适当血小板聚集为特征之医学病症的药物。
23.权利要求22的水果提取物，其中所述治疗或预防以不适当血小板聚集为特征的医学病症是用于选自以下的目的通过减少血小板聚集来维持心脏健康；有益于循环；以及使血流正常化或者以其它方式有益于血流。
全文摘要
本发明提供了制备茄科(Solanaceae)水果提取物的方法，其中将水果加工以优化所述提取物的血小板聚集抑制活性。所述方法包括制备匀浆水果的初始混合物；从水果固体中分离出水溶性级分；过滤所述水溶性级分；以及浓缩滤过液中的活性剂。本发明还提供了通过所述方法生产的水果提取物；以及含有糖基化酚酸或酚酯或其衍生物、糖基化类黄酮和核苷的水果提取物。本发明的提取物可用作用于治疗或预防以不适当血小板聚集为特征的医学病症的药物。特别地，所述药物可用于通过减少血小板聚集来维持心脏健康；有益于循环和/或使血流正常化或以其它方式有益于血流。
文档编号A61K36/81GK102271697SQ200980148421
公开日2011年12月7日 申请日期2009年11月2日 优先权日2008年10月31日
发明者尼亚夫·奥肯尼迪 申请人:普罗维斯天然产物有限公司