本发明属于精细化工
技术领域：
，涉及一种灵芝发酵物及其制备方法和应用。
背景技术：
：随着生活水平的不断提高，人们越来越注重美容护肤，也越来越关注美容护肤化妆品的功效和成分。近年来，中草药来源的提取物或活性物质，具有稳定、功效持久及毒副作用低的优势，作为美容护肤化妆品的添加剂，深受人们的青睐。灵芝源远流长，被《神农本草》称为“神芝”，被《本草纲目》列为上品，灵芝中含有各种活性成分，包括多糖、三萜、多肽、甾醇、多炔、生物碱和氨基酸等。现代皮肤学研究表明，灵芝提取物不仅能诱导细胞因子的分泌，进而提高细胞有丝分裂和增长的能力，加快衰老细胞的脱落，促进新陈代谢，而且能增加表皮层和真皮层的厚度，帮助改善脸部肌肤的组织结构，从肌肤深层延缓衰老。中药发酵技术主要是将发酵工程等现代生物技术应用于传统中药的研究，在中药发酵过程中加入多种有益菌种，获得的发酵物不仅包含了药材本身的活性物质，而且还含有微生物的次级代谢产物，增强了发酵产物的功效。cn105147587a公开了一种灵芝发酵原浆的制备方法，所述制备方法包括：将灵芝干粉、水和葡萄酒酵母菌混合得到初始体系，对所述初始体系进行发酵培养，得到灵芝发酵原浆，所述灵芝发酵原浆具备美白、抗衰老、清除自由基和抑制酪氨酸酶的功能，但不具备抑制炎症因子产生的功能。cn108004282a公开了一种制备灵芝子实体发酵物的方法，所述方法包括：将灵芝子实体与水混合，打制成灵芝浆液；在所述灵芝浆液中接种酿酒酵母，进行发酵获得灵芝发酵液；在所述灵芝发酵液中接种保加利亚乳杆菌，进行二次发酵，即获得灵芝子实体发酵物。所述灵芝子实体发酵物营养价值高，具备抗氧化性和美白效果，但其对酪氨酸酶活性的抑制率较低。cn105935143a公开了一种灵芝酵素的制作方法，通过灵芝萃取、液体培养基制备、单体发酵、混合发酵和酶解进行灵芝酵素的制备，提高了灵芝酵素中灵芝多糖和三萜类有效活性成分的含量。综上所述，提供一种抗氧化性强、美白效果好以及能够抑制炎症因子产生的灵芝发酵物及其制备方法，对于制备化妆品和灵芝发酵领域均具有重要意义。技术实现要素：针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种灵芝发酵物及其制备方法和应用，所述灵芝发酵物抗氧化性强、美白效果好，还能够抑制炎症因子产生。为达上述目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种灵芝发酵物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)酶解：向灵芝提取液中加入蛋白酶，进行酶解反应，随后对蛋白酶进行灭活，获得灵芝水解液；(2)发酵：向灵芝水解液中接种微生物，并加入培养基，进行发酵反应，发酵反应结束后进行灭菌，取清液，即获得灵芝发酵物。本发明中的制备方法，将酶解反应与发酵反应相结合，对灵芝提取液进行酶解，获得富含多种活性物质的灵芝水解液，后续发酵过程中的微生物能够以活性物质为底物合成多种次级代谢产物，增加活性物质的种类，从而制备出抗氧化性强、美白效果好以及能够抑制炎症因子产生的灵芝发酵物。优选地，步骤(1)所述灵芝提取液由热水浸提灵芝药材获得。优选地，步骤(1)所述蛋白酶包括淀粉酶。优选地，所述淀粉酶包括α-淀粉酶和/或β-淀粉酶。优选地，所述α-淀粉酶与所述灵芝提取液的质量比为(0.05～2):100，包括但不限于0.1:100、0.5:100、1:100、1.5:100或1.7:100。优选地，所述β-淀粉酶与所述灵芝提取液的质量比为(0.05～2):100，包括但不限于0.1:100、0.5:100、1:100、1.5:100或1.7:100。优选地，步骤(1)所述酶解反应的ph为4.0～6.5，包括但不限于4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.5、5.8、6.0、6.2或6.4，优选为5.0～6.5。优选地，步骤(1)所述酶解反应的温度为28～40℃，包括但不限于30℃、32℃、34℃、36℃或38℃，优选为28～35℃。优选地，步骤(1)所述酶解反应的时间为2～8h，包括但不限于3h、4h、5h、6h或7h，优选为2～5h。优选地，步骤(1)所述酶解反应的搅拌转速为100～250rpm，包括但不限于120rpm、140rpm、160rpm、200rpm、220rpm或240rpm，优选为150～250rpm。优选地，步骤(1)所述灭活的温度为80～120℃，包括但不限于85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃或115℃，优选为80～100℃。优选地，步骤(1)所述灭活的时间为20～35min，包括但不限于22min、24min、26min、28min、30min、32min或34min，优选为20～30min。优先地，步骤(2)所述微生物包括乳酸菌。优选地，所述乳酸菌包括乳酸乳球菌(lactococcuslactis)和/或植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)。优选地，所述乳酸乳球菌包括lactococcuslactisatcc13675。优选地，所述植物乳杆菌包括lactobacillusplantarumatcc8014。优选地，所述乳酸菌的菌液浓度为105～108cfu/ml，包括但不限于106cfu/ml或107cfu/ml，优选为105～107cfu/ml。优选地，步骤(2)所述培养基包括mrs肉汤培养基。优选地，所述灵芝水解液、乳酸菌菌液和mrs肉汤培养基的投加量比为(1～100)ml:(1～5)ml:(0.1～5)g，包括但不限于20ml:1ml:2g、30ml:3ml:3g或80ml:4ml:4g，优选为(1～30)ml:(1～5)ml:(1～5)g。优选地，步骤(2)所述的微生物包括酵母菌。优选地，所述酵母菌包括酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)和/或乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)。优选地，所述酿酒酵母包括saccharomycescerevisiaeatcc9763。优选地，所述乳酸克鲁维酵母包括kluyveromyceslactisatcc10689。优选地，所述酵母菌的菌液浓度为105～108cfu/ml，包括但不限于106cfu/ml或107cfu/ml，优选为105～107cfu/ml。优选地，步骤(2)所述培养基包括ypd培养基。优选地，所述灵芝水解液、酵母菌菌液和ypd培养基的投加量比为(1～100)ml:(1～5)ml:(0.1～5)g，包括但不限于20ml:1ml:2g、30ml:3ml:3g或80ml:4ml:4g，优选为(1～30)ml:(1～5)ml:(1～5)g。优选地，所述发酵反应需加入去离子水。优选地，所述去离子水的体积为所述灵芝水解液体积的3～5倍。优选地，步骤(2)所述发酵反应的温度为25～40℃，包括但不限于28℃、30℃、32℃、34℃、36℃或38℃，优选为28～35℃。优选地，步骤(2)所述发酵反应的时间为36～120h，包括但不限于42h、48h、64h、70h、96h、102h、108h或114h，优选为36～96h。优选地，步骤(2)所述灭菌的温度为100～121℃，包括但不限于105℃、110℃、115℃或120℃，优选为115～121℃。优选地，步骤(2)所述灭菌的时间为20～30min，包括但不限于22min、24min、26min或28min。优选地，步骤(2)所述取清液为通过离心获取上清液。优选地，所述离心的离心半径为6～15cm，包括但不限于7cm、8cm、9cm、12cm、13cm或14cm，优选为8～12cm，进一步优选为8～11cm。优选地，所述离心的时间为10～30min，包括但不限于12min、14min、16min、18min、24min、26min或28min，优选为10～20min。优选地，所述离心的转速为3000～4700rpm，包括但不限于3200rpm、3400rpm、3600rpm、3800rpm、4200rpm、4400rpm或4600rpm，优选为3500～4700rpm。本发明中，作为优选的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)向灵芝提取液中加入α-淀粉酶和β-淀粉酶，其中，α-淀粉酶、β-淀粉酶与灵芝提取液的质量比为(0.05～2):(0.05～2):100，调节ph至4.0～6.5，温度至28～40℃，搅拌转速至100～250rpm，酶解反应2～8h，随后于80～120℃下对淀粉酶灭活20～35min，获得灵芝水解液；(2)向灵芝水解液中接种酿酒酵母和乳酸克鲁维酵母的混合菌并加入ypd培养基和3～5倍于灵芝水解液体积的去离子水，所述混合菌的菌液浓度为105～108cfu/ml，所述灵芝水解液、混合菌菌液和ypd培养基的投加量比为(1～100)ml:(1～5)ml:(0.1～5)g，25～40℃下发酵36～120h，于100～121℃下灭菌20～30min，离心半径6～15cm、3000～4700rpm下离心10～30min，取上清液，即获得酵母菌发酵液；向灵芝水解液中接种乳酸乳球菌和植物乳杆菌的混合菌并加入mrs肉汤培养基和3～5倍于灵芝水解液体积的去离子水，所述混合菌的菌液浓度为105～108cfu/ml，所述灵芝水解液、混合菌菌液和mrs肉汤培养基的投加量比为(1～100)ml:(1～5)ml:(0.1～5)g，25～40℃下发酵36～120h，于100～121℃下灭菌20～30min，离心半径6～15cm、3000～4700rpm下离心10～30min，取上清液，即获得乳酸菌发酵液；(3)将所述酵母菌发酵液和所述乳酸菌发酵液混合，即获得所述灵芝发酵物。第二方面，本发明提供一种灵芝发酵物，所述灵芝发酵物由第一方面所述的制备方法制备得到。优选地，所述灵芝发酵物包括乳酸菌发酵液和/或酵母菌发酵液。优选地，所述灵芝发酵物按重量份包括1～100份乳酸菌发酵液和/或1～100份酵母菌发酵液。优选地，所述灵芝发酵物按重量份包括1～100份乳酸菌发酵液，包括但不限于2份、10份、15份、20份、30份、40份、50份、60份、70份或80份。优选地，所述灵芝发酵物按重量份包括1～100份酵母菌发酵液，包括但不限于2份、10份、15份、20份、30份、40份、50份、60份、70份或80份。本发明中，通过将酵母菌发酵液和乳酸菌发酵液混合能够显著提升灵芝发酵物的美白抗衰老效果。优选地，所述乳酸菌包括乳酸乳球菌和/或植物乳杆菌。优选地，所述乳酸乳球菌包括乳酸乳球菌atcc13675。优选地，所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌atcc8014。优选地，所述酵母菌包括酿酒酵母和/或乳酸克鲁维酵母。优选地，所述酿酒酵母包括酿酒酵母atcc9763。优选地，所述乳酸克鲁维酵母包括乳酸克鲁维酵母atcc10689。优选地，所述灵芝发酵物中灵芝酸a的含量高于100μg/ml。优选地，所述灵芝发酵物中蛋白质含量高于0.61mg/ml。优选地，所述灵芝发酵物中蛋白质的分子量小于5000u。第三方面，本发明提供第二方面所述的灵芝发酵物在制备化妆品中的应用。第四方面，本发明提供一种化妆品，所述化妆品包括第二方面所述的灵芝发酵物。优选地，所述灵芝发酵物在所述化妆品中的质量百分比为15％～25％，包括但不限于17％、18％、19％、20％、22％或24％。优选地，所述化妆品还包括霍霍巴油、甘油、苯甲酸钠、山梨酸钾、对羟基苯乙酮或水中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述化妆品的剂型包括水剂、乳剂、精华、啫喱或喷雾剂中的任意一种。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明的制备方法将酶解反应与发酵反应相结合，充分利用蛋白酶酶解和微生物转化的优点，能够制备抗氧化性强、美白效果好且能够抑制炎症因子产生的灵芝发酵物；(2)本发明的灵芝发酵物，灵芝酸a的含量在89μg/ml以上，最高为137μg/ml，分子量小于5000u的蛋白的含量在0.5mg/ml以上，最高为0.96mg/ml，对酪氨酸酶活性的抑制率在62％以上，最高为84.6％，羟自由基清除率在47％以上，最高为79.5％，dpph自由基清除率高于50％，最高为84.6％，能抑制炎症因子il-1β和tnf-α的产生；(3)本发明的化妆品具有显著的美白抗衰老的功效，具有广泛的应用前景。具体实施方式为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。本发明实施例和对比例中，α-淀粉酶购买于阿拉丁，货号：a109181-500g；β-淀粉酶购买于夏盛集团，货号：fdg-2258-1kg；mrs肉汤培养基和ypd培养基均购买于广东环凯微生物科技有限公司。实施例1本实施例提供一种灵芝发酵物制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)取100g粉碎后灵芝药材，加入1500ml去离子水，100℃水浴加热2h，过滤，取残渣再加入1500ml去离子水，100℃水浴加热2h，过滤，合并两次提取液，在60℃下减压浓缩至1000ml，即得到灵芝提取液；(2)取100g灵芝提取液，加入2gα-淀粉酶、0.05gβ-淀粉酶和400ml去离子水，混合均匀，调节ph至6.5，于40℃、250rpm下酶解2h，随后在120℃下灭酶20min，获得水解液；(3)将100ml水解液、5ml乳酸乳球菌菌液(108cfu/ml)、5gmrs肉汤培养基和400ml去离子水混合，40℃下发酵36h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20min，然后在离心半径为15cm，转速为3000rpm下，离心30min，取离心后的上清液，即获得乳酸乳球菌发酵液。实施例2本实施例提供一种灵芝发酵物制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)取100g粉碎后灵芝药材，加入1500ml去离子水，100℃水浴加热2h，过滤，取残渣再加入1500ml去离子水，100℃水浴加热2h，过滤，合并两次提取液，在60℃下减压浓缩至1000ml，即得到灵芝提取液；(2)取100g灵芝提取液，加入0.05gα-淀粉酶、2gβ-淀粉酶和400ml去离子水，混合均匀，调节ph至4.0，于28℃、100rpm下酶解8h，随后在80℃下灭酶35min，获得水解液；(3)将1ml水解液、1ml植物乳杆菌菌液(105cfu/ml)、0.1gmrs肉汤培养基和5ml去离子水混合，25℃下发酵120h，发酵结束后将发酵液在100℃下灭菌30min，然后在离心半径为6cm，转速为4700rpm下，离心10min，取离心后的上清液，即获得植物乳杆菌发酵液。实施例3本实施例提供一种灵芝发酵物制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)取100g粉碎后灵芝药材，加入1500ml去离子水，100℃水浴加热2h，过滤，取残渣再加入1500ml去离子水，100℃水浴加热2h，过滤，合并两次提取液，在60℃下减压浓缩至1000ml，即得到灵芝提取液；(2)取100g灵芝提取液，加入1gα-淀粉酶、1gβ-淀粉酶和400ml去离子水，混合均匀，调节ph至5.5，于32℃、200rpm下酶解4h，随后在90℃下灭酶25min，获得水解液；(3)将20ml水解液、1ml植物乳杆菌菌液(106cfu/ml)、2gmrs肉汤培养基和80ml去离子水混合，30℃下发酵96h，发酵结束后将发酵液在100℃下灭菌25min，然后在离心半径为11cm，转速为4500rpm下，离心20min，取离心后的上清液，即获得植物乳杆菌发酵液。实施例4本实施例提供一种灵芝发酵物制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)取100g粉碎后灵芝药材，加入1500ml去离子水，100℃水浴加热2h，过滤，取残渣再加入1500ml去离子水，100℃水浴加热2h，过滤，合并两次提取液，在60℃下减压浓缩至1000ml，即得到灵芝提取液；(2)取100g灵芝提取液，加入1gα-淀粉酶、1gβ-淀粉酶和400ml去离子水，混合均匀，调节ph至5.5，于32℃、200rpm下酶解4h，随后在90℃下灭酶25min，获得水解液；(3)将20ml水解液、1ml乳酸乳球菌菌液(106cfu/ml)、2gmrs肉汤培养基和80ml去离子水混合，30℃下发酵96h，发酵结束后将发酵液在100℃下灭菌25min，然后在离心半径为11cm，转速为4500rpm下，离心20min，取离心后的上清液，即获得乳酸乳球菌发酵液。实施例5本实施例提供一种灵芝发酵物制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)取100g粉碎后灵芝药材，加入1500ml去离子水，100℃水浴加热2h，过滤，取残渣再加入1500ml去离子水，100℃水浴加热2h，过滤，合并两次提取液，在60℃下减压浓缩至1000ml，即得到灵芝提取液；(2)取100g灵芝提取液，加入1gα-淀粉酶、1gβ-淀粉酶和400ml去离子水，混合均匀，调节ph至5.5，于32℃、200rpm下酶解4h，随后在90℃下灭酶25min，获得水解液；(3)将20ml水解液、1ml酿酒酵母菌液(106cfu/ml)、2gypd培养基和80ml去离子水混合，30℃下发酵96h，发酵结束后将发酵液在100℃下灭菌25min，然后在离心半径为11cm，转速为4500rpm下，离心20min，取离心后的上清液，即获得酿酒酵母发酵液。实施例6本实施例提供一种灵芝发酵物制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)取100g粉碎后灵芝药材，加入1500ml去离子水，100℃水浴加热2h，过滤，取残渣再加入1500ml去离子水，100℃水浴加热2h，过滤，合并两次提取液，在60℃下减压浓缩至1000ml，即得到灵芝提取液；(2)取100g灵芝提取液，加入1gα-淀粉酶、1gβ-淀粉酶和400ml去离子水，混合均匀，调节ph至5.5，于32℃、200rpm下酶解4h，随后在90℃下灭酶25min，获得水解液；(3)将20ml水解液、1ml乳酸克鲁维酵母菌液(106cfu/ml)、2gypd培养基和80ml去离子水混合，30℃下发酵84h，发酵结束后将发酵液在100℃下灭菌25min，然后在离心半径为11cm，转速为4500rpm下，离心20min，取离心后的上清液，即获得乳酸克鲁维酵母发酵液。实施例7本实施例与实施例3相比，区别仅在于将步骤(2)所述植物乳杆菌菌液替换为植物乳杆菌和乳酸乳球菌的混合菌液，且所述混合菌液中植物乳杆菌菌液(106cfu/ml)和乳酸乳球菌菌液(106cfu/ml)的比例为8:2，混合菌液的加入量与实施例3植物乳杆菌菌液的加入量相同，其它与实施例3也相同。实施例8本实施例与实施例3相比，区别仅在于将步骤(2)所述植物乳杆菌菌液替换为植物乳杆菌和乳酸乳球菌的混合菌液，且所述混合菌液中植植物乳杆菌菌液(106cfu/ml)和乳酸乳球菌菌液(106cfu/ml)的比例为5:5，混合菌液的加入量与实施例3植物乳杆菌菌液的加入量相同，其它与实施例3也相同。实施例9本实施例与实施例3相比，区别仅在于将步骤(2)所述植物乳杆菌菌液替换为植物乳杆菌和乳酸乳球菌的混合菌液，且所述混合菌液中植植物乳杆菌菌液(106cfu/ml)和乳酸乳球菌菌液(106cfu/ml)的比例为2:8，混合菌液的加入量与实施例3植物乳杆菌菌液的加入量相同，其它与实施例3也相同。实施例10本实施例与实施例5相比，区别仅在于将步骤(2)所述酿酒酵母菌液替换为酿酒酵母菌和乳酸克鲁维酵母菌的混合菌液，且所述混合菌液中酿酒酵母菌液(106cfu/ml)和乳酸克鲁维酵母菌液(106cfu/ml)的比例为8:2，混合菌液的加入量与实施例5酿酒酵母菌液的加入量相同，其它与实施例5也相同。实施例11本实施例与实施例5相比，区别仅在于将步骤(2)所述酿酒酵母菌液替换为酿酒酵母菌和乳酸克鲁维酵母菌的混合菌液，且所述混合菌液中酿酒酵母菌液(106cfu/ml)和乳酸克鲁维酵母菌液(106cfu/ml)的比例为5:5，混合菌液的加入量与实施例5酿酒酵母菌液的加入量相同，其它与实施例5也相同。实施例12本实施例与实施例5相比，区别仅在于将步骤(2)所述酿酒酵母菌液替换为酿酒酵母菌和乳酸克鲁维酵母菌的混合菌液，且所述混合菌液中酿酒酵母菌液(106cfu/ml)和乳酸克鲁维酵母菌液(106cfu/ml)的比例为2:8，混合菌液的加入量与实施例5酿酒酵母菌液的加入量相同，其它与实施例5也相同。实施例13本实施例提供一种混合发酵物，即将实施例3制备的发酵物与实施例4制备的发酵物按重量比8:2进行混合。实施例14本实施例提供一种混合发酵物，即将实施例3制备的发酵物与实施例4制备的发酵物按重量比5:5进行混合。实施例15本实施例提供一种混合发酵物，即将实施例3制备的发酵物与实施例4制备的发酵物按重量比2:8进行混合。实施例16本实施例提供一种混合发酵物，即将实施例3制备的发酵物与实施例5制备的发酵物按重量比8:2进行混合。实施例17本实施例提供一种混合发酵物，即将实施例3制备的发酵物与实施例5制备的发酵物按重量比5:5进行混合。实施例18本实施例提供一种混合发酵物，即将实施例3制备的发酵物与实施例5制备的发酵物按重量比2:8进行混合。实施例19本实施例提供一种混合发酵物，即将实施例3制备的发酵物与实施例6制备的发酵物按重量比8:2进行混合。实施例20本实施例提供一种混合发酵物，即将实施例3制备的发酵物与实施例6制备的发酵物按重量比5:5进行混合。实施例21本实施例提供一种混合发酵物，即将实施例3制备的发酵物与实施例6制备的发酵物按重量比2:8进行混合。实施例22本实施例提供一种混合发酵物，即将实施例4制备的发酵物与实施例5制备的发酵物按重量比8:2进行混合。实施例23本实施例提供一种混合发酵物，即将实施例4制备的发酵物与实施例5制备的发酵物按重量比5:5进行混合。实施例24本实施例提供一种混合发酵物，即将实施例4制备的发酵物与实施例5制备的发酵物按重量比2:8进行混合。实施例25本实施例提供一种混合发酵物，即将实施例4制备的发酵物与实施例6制备的发酵物按重量比8:2进行混合。实施例26本实施例提供一种混合发酵物，即将实施例4制备的发酵物与实施例6制备的发酵物按重量比5:5进行混合。实施例27本实施例提供一种混合发酵物，即将实施例4制备的发酵物与实施例6制备的发酵物按重量比2:8进行混合。实施例28本实施例提供一种混合发酵物，即将实施例5制备的发酵物与实施例6制备的发酵物按重量比8:2进行混合。实施例29本实施例提供一种混合发酵物，即将实施例5制备的发酵物与实施例6制备的发酵物按重量比5:5进行混合。实施例30本实施例提供一种混合发酵物，即将实施例5制备的发酵物与实施例6制备的发酵物按重量比2:8进行混合。对比例1(1)取100g粉碎后灵芝药材，加入1500ml去离子水，100℃水浴加热2h，过滤，取残渣再加入1500ml去离子水，100℃水浴加热2h，过滤，合并两次提取液，在60℃下减压浓缩至1000ml，即得到灵芝提取液；(2)取100g灵芝提取液，加入1gα-淀粉酶和400ml去离子水，混合均匀，调节ph至5.5，于32℃、200rpm下酶解4h，随后在90℃下灭酶25min，获得水解液；(3)将20ml水解液、2gmrs肉汤培养基和80ml去离子水混合。对比例2(1)取100g粉碎后灵芝药材，加入1500ml去离子水，100℃水浴加热2h，过滤，取残渣再加入1500ml去离子水，100℃水浴加热2h，过滤，合并两次提取液，在60℃下减压浓缩至1000ml，即得到灵芝提取液；(2)取100g灵芝提取液，加入1gβ-淀粉酶和400ml去离子水，混合均匀，调节ph至5.5，于32℃、200rpm下酶解4h，随后在90℃下灭酶25min，获得水解液；(3)将20ml水解液、2gypd培养基和80ml去离子水混合。对比例3(1)取100g粉碎后灵芝药材，加入1500ml去离子水，100℃水浴加热2h，过滤，取残渣再加入1500ml去离子水，100℃水浴加热2h，过滤，合并两次提取液，在60℃下减压浓缩至1000ml，即得到灵芝提取液；(2)取100g灵芝提取液，加入1gα-淀粉酶、1gβ-淀粉酶和400ml去离子水，混合均匀，调节ph至5.5，于32℃、200rpm下酶解4h，随后在90℃下灭酶25min，获得水解液；(3)将20ml水解液、2gmrs肉汤培养基和80ml去离子水混合。对比例4(1)取100g粉碎后灵芝药材，加入1500ml去离子水，100℃水浴加热2h，过滤，取残渣再加入1500ml去离子水，100℃水浴加热2h，过滤，合并两次提取液，在60℃下减压浓缩至1000ml，即得到灵芝提取液；(2)取100g灵芝提取液，加入1gα-淀粉酶、1gβ-淀粉酶和400ml去离子水，混合均匀，调节ph至5.5，于32℃、200rpm下酶解4h，随后在90℃下灭酶25min，获得水解液；(3)将20ml水解液、2gmrs肉汤培养基和80ml去离子水混合，在30℃下，发酵96h，100℃下灭菌25min，然后在离心半径为11cm，转速为4500rpm下，离心20min，取上清液。对比例5(1)取100g粉碎后灵芝药材，加入1500ml去离子水，100℃水浴加热2h，过滤，取残渣再加入1500ml去离子水，100℃水浴加热2h，过滤，合并两次提取液，在60℃下减压浓缩至1000ml，即得到灵芝提取液；(2)取100g灵芝提取液，加入1gα-淀粉酶、1gβ-淀粉酶和400ml去离子水，混合均匀，调节ph至5.5，于32℃、200rpm下酶解4h，随后在90℃下灭酶25min，获得水解液；(3)将20ml水解液、2gypd培养基和80ml去离子水混合，在30℃下，发酵96h，100℃下灭菌25min，然后在离心半径为11cm，转速为4500rpm下，离心20min，取上清液。试验例1成分分析以实施例1-30和对比例1-5制备的样品进行试验。分别取5ml样品液置于透析袋(mwco，3.5～5ku)中，将透析袋置于去离子水中透析6h，将透析液浓缩，然后用双缩脲法测定蛋白浓度，即取1.0ml透析液，加入2.0ml双缩脲试剂，充分混匀，室温下放置15min，在波长540nm处测定吸光值，以牛血清蛋白为对照，计算样品液中蛋白质的浓度。分别取5ml样品液置于圆底烧瓶中，并加入浓盐酸使反应体系中的盐酸浓度为2mol/l，沸水浴中反应3h，将反应液减压蒸干后用甲醇溶解，并定容至5ml，采用hplc-elsd法测定样品中灵芝酸a的含量。检测结果如表1所示。表1如表1所示，与对比例1-5相比，实施例1-30制备的灵芝发酵物中灵芝酸a的含量和小分子蛋白的含量均显著提高，说明本发明通过研究发酵反应过程，并控制关键因素微生物种类、菌液浓度和添加量以及发酵时间，实现了灵芝有效成分的富集。试验例2红细胞溶血性评价红细胞溶血实验是兔眼刺激性实验的替代方法之一，基本原理是通过测定血红蛋白溶出量及变性程度来评价化学品对眼组织细胞的损伤，国际上主要将红细胞溶血实验用于评价化妆品及原料等化学品的眼刺激性研究。以实施例1-30和对比例1-5制备的样品进行红细胞溶血实验，本实验依照欧洲替代方法验证中心的红细胞溶血实验测试方法及分级标准，分级标准如表2所示，其中hd50为50％红细胞发生溶血时的样品浓度，di为蛋白质变性指数，l/d为hd50与di的比值。表2l/d分级l/d>100无刺激性10<l/d≤100微刺激性1<l/d≤10轻度刺激性0.1<l/d≤1中毒刺激性l/d≤0.1重度刺激性实验结果如表3所示。表3表3表明，本发明制备得到的灵芝发酵物均无刺激性。试验例3抑制酪氨酸酶活性评价抑制酪氨酸酶活性能力在一定程度上反应物质的美白能力，酪氨酸酶活性抑制率越大，表明美白能力越强，以实施例1-30和对比例1-5制备的样品进行试验。按表4准确吸取样品溶液、ph值为6.8的磷酸盐缓冲溶液(pbs)和质量分数为0.1％的多巴溶液，充分混合，于30℃孵育5min后，分别加入相应体积的酪氨酸酶溶液(活度为100u/ml)，在30℃下孵育10min，迅速转移至比色皿中，在475nm处测定吸光度。表41组2组3组4组样品溶液(ml)001.01.0磷酸盐缓冲溶液(ml)2.02.51.01.5多巴溶液(ml)1.01.01.01.0酪氨酸酶溶液(ml)0.500.50总体积(ml)3.53.53.53.5按公式(1)计算样品溶液对酪氨酸酶的相对抑制率(i)。i＝[(a1-a2)-(a3-a4)]/(a1-a2)×100％(1)式中，a1、a2、a3和a4分别为1组-4组溶液的吸光度。结果如表5所示。试验例4羟自由基的清除能力评价以实施例1-30和对比例1-5制备的样品进行试验。将1.0mlfeso4溶液(9.0mmol/l)、1ml水杨酸-乙醇溶液(9.0mmol/ml)和1.0ml样品溶液混合，再加入1.0mlh2o2(8.8mmol/ml)，37℃水浴30min，以无水乙醇为空白对照，于510nm处测定其吸光度，按公式(2)计算各样品溶液对羟自由基的清除率(y)，结果如表5所示。y＝[1-(a1-a2)/a3]×100％(2)式中，a1为样品反应体系的吸光度，a2为不加h2o2的样品的吸光度(以无水乙醇代替h2o2)，a3为空白对照无水乙醇的吸光度。试验例5dpph自由基清除能力评价清除dpph自由基能力在一定程度上反应物质的抗氧化能力，自由基清除率越大，表明抗氧化能力和抗衰老能力越强，因此，可以通过对样品清除dpph自由基能力的研究来判断其抗衰老效果，以实施例1-30和对比例1-5制备的样品进行试验。分别向试管中加入质量浓度为45.8mg/l的dpph测试液2.0ml和0.25ml待测样品，用无水乙醇补充总体积至3ml，摇匀，避光反应30min后，用1cm比色皿在517nm波长处测定吸光度，记为a1；分别向试管中加入无水乙醇2ml和等量的待测样品，用无水乙醇补充总体积至3ml，在517nm波长处测定吸光度并记为a2；向试管中加入dpph测试液2ml和无水乙醇1ml，在517nm波长处测定吸光度并记为a3，按公式(3)计算待样品的dpph自由基清除率，结果如表5所示。t＝[1-(a1-a2)/a3]×100％(3)式中，t为dpph自由基清除率。试验例6抗炎能力评价以实施例1-30和对比例1-5制备的样品进行试验。将小鼠巨噬细胞264.7分别置于添加了1ml样品、10％胎牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem培养基中，在二氧化碳培养箱中培养，温度为37℃，二氧化碳浓度为5％，空气湿度为95％，孵育1小时后，用脂多糖(100ng/ml)诱导24h，用elisa试剂盒测定细胞培养上清液中il-1β和tnf-α的浓度，结果如表5所示。表5如表5所示，与对比例1-5制备的样品相比，实施例1-30所制备样品的酪氨酸酶活性抑制率、羟自由基清除率和dpph自由基清除率均较高，其中，酪氨酸酶抑制率最高为84.6％，羟自由基清除率最高为79.5％，dpph自由基清除率最高为84.6％，且细胞培养体系中炎症因子il-1β和tnf-α的浓度较低，说明本发明的发酵物具有抑制酪氨酸酶活性、清除羟基自由基和dpph自由基的活性，还能抑制炎症因子il-1β和tnf-α的产生；通过对比可知，单一发酵物的对酪氨酸酶活性抑制率、羟自由基清除率和dpph自由基清除率均低于相应的混合发酵物，说明本发明将利用乳酸菌和酵母发酵获得的灵芝发酵液混合能够提高灵芝发酵物的酪氨酸酶活性抑制率、羟自由基清除率和dpph自由基清除率，即本发明的乳酸菌发酵液和酵母菌发酵液间存在协同增效作用，提高了灵芝发酵物的美白与抗氧化功效。应用例1本应用例提供一种含有本发明灵芝发酵物的精华液，其具体配方如表6所示。表6组分名称质量分数(％)水余量样品15霍霍巴油20甘油5苯甲酸钠0.2山梨酸钾0.2对羟基苯乙酮0.2样品为实施例17的样品。制备方法：依次按配方比例称取各组分原料，在常温下搅拌混合均匀即可。应用例2本应用例提供一种含有本发明灵芝发酵物的精华液，其具体配方如表7所示。表7样品由实施例20制备的样品。制备方法：依次按配方比例称取各组分原料，在常温下搅拌混合均匀即可。应用例3本应用例提供一种精华液，其具体配方如表8所示。表8组分名称质量分数(％)水余量样品20霍霍巴油20甘油5苯甲酸钠0.2山梨酸钾0.2对羟基苯乙酮0.2样品为对比例3制备的样品。制备方法：依次按配方比例称取各组分原料，在常温下搅拌混合均匀即可。应用试验例1选取志愿者60名，年龄在20～45岁，男女各半，将志愿者均分为2组，第1组志愿者左侧脸部使用应用例1制备的护肤精华液，右侧使用应用例3制备的护肤精华液，第2组志愿者左侧脸部使用应用例2制备的护肤精华液，右侧使用应用例3制备的护肤精华液，每天早午晚各使用一次，每次各涂抹1g产品于脸部，并按摩2分钟，持续使用28天，使用28天后观察左脸和右脸的肤色。使用过程中对皮肤白度和紧致度的改善情况进行评价，其中最高分为5分，最低分为1分，结果如表9所示，所示结果为得到所有结果的平均值。表9评级指标应用例1应用例2应用例3白度4.54.43.6紧致度3.94.03.3结果表明，使用者认为使用应用例1和2制备的精华液后，皮肤白度和紧致度得到显著改善，优于使用应用例3制备的精华液，说明本发明的灵芝发酵物应用到化妆品中具有显著的美白抗衰老的功效。综上所述，本发明的制备方法将酶解与发酵相结合，充分发挥蛋白酶酶解和微生物转化的优点，能够制备抗氧化性强、美白效果好且能够抑制炎症因子产生的灵芝发酵物，所述发酵物，灵芝酸a的含量在89μg/ml以上，最高为137μg/ml，分子量小于5000u的蛋白的含量在0.5mg/ml以上，最高为0.96mg/ml，对酪氨酸酶活性的抑制率在62％以上，最高为84.6％，羟自由基清除率在47％以上，最高为79.5％，dpph自由基清除率高于50％，最高为84.6％，还能抑制炎症因子il-1β和tnf-α的产生。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。当前第1页12