一种组合物及其抗菌应用的制作方法

[0001]
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种组合物及其抗菌应用。


背景技术：

[0002]
先天免疫响应是后生生物应对微生物侵染的重要防御机制，而起始先天免疫响应的主要生物过程依赖于宿主的模式识别受体对微生物配体的识别。肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein，pgrp)是一种重要的模式识别受体，能够识别病原生物表面的病原相关分子识别模式，实现对外来病原体的识别，进而启动先天免疫反应，激活toll途径、imd(immune deficiency)途径、jak-stat等途径来产生抗菌肽以及细胞免疫等途径清除病原物达到免疫的目的。
[0003]
肽聚糖是大多数细菌细胞壁的必需成分，是由双糖单位、四肽尾还有肽桥聚合而成的多层网状大分子结构。肽聚糖识别蛋白是高度保守的识别肽聚糖的关键模式识别受体。有研究发现，昆虫中的一些pgrps具有抗菌作用，例如杨青泰等学者(杨青泰.肽聚糖识别蛋白参与埃及伊蚊的抗细菌免疫反应[d].山西农业大学,2018)发现aapgrp-lc参与埃及伊蚊的抗细菌免疫反应。这可以为一些特种经济昆虫养殖过程中的疾病防治，提供重要的科学依据，并有望代替抗生素，作为新的抑菌药物。
[0004]
目前，还没有胞外多糖、多糖组合物等影响肽聚糖识别蛋白基因表达的相关报道。


技术实现要素：

[0005]
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了一种组合物及其抗菌应用。
[0006]
本发明的技术方案如下文所示。
[0007]
本发明一方面提供了一种组合物，包括甘露糖、半乳糖和葡萄糖，其中甘露糖、半乳糖和葡萄糖的摩尔比为7:1.7～4.7:1～2或9:2.7:1。
[0008]
根据本发明的一些实施方式，甘露糖、半乳糖和葡萄糖的摩尔比为7:1.7:1、7:2.7:1、7:3.7:1、7:4.7:1、7:2.7:2、7:2.7:1.5、6:2.7:1或9:2.7:1。优选为7:2.7:1。
[0009]
根据本发明的一些实施方式，所述组合物来源于胞外多糖。
[0010]
根据本发明的一些实施方式，所述胞外多糖由甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成，其中甘露糖、半乳糖和葡萄糖的摩尔比为7:1.7～4.7:1～2或9:2.7:1；优选为7:1.7:1、7:2.7:1、7:3.7:1、7:4.7:1、7:2.7:2、7:2.7:1.5、6:2.7:1或9:2.7:1；更优选为7:2.7:1。
[0011]
根据本发明的一些实施方式，所述胞外多糖是由肠炎沙门氏杆菌(salmonella enteritidis)产生。
[0012]
根据本发明的一些实施方式，所述胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0013]
1)将活化后的肠炎沙门氏杆菌在lb液体培养基中培养16～18h，离心，取发酵液；
[0014]
2)向步骤1)的发酵液中加入变性剂，混匀后，离心，取上清液；
[0015]
3)将步骤2)的上清液浓缩，并加入预冷的醇类溶剂，静置，取沉淀，即为所述胞外
多糖的粗品。
[0016]
根据本发明的一些实施方式，所述胞外多糖的制备方法，还包括采用阴离子交换柱对步骤3)得到的胞外多糖的粗品进行纯化的步骤；优选的，根据在纯化过程中，取分离峰最高的组分进行浓缩、脱盐和冻干。
[0017]
根据本发明的一些实施方式，纯化过程中，使用的洗脱液为0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l、0.4mol/l的nacl溶液。
[0018]
根据本发明的一些实施方式，所述阴离子交换柱为deae-52纤维素阴离子交换柱。
[0019]
根据本发明的一些实施方式，所述醇类溶剂为无水乙醇。
[0020]
本发明的又一方面提供了上述组合物在制备肽聚糖识别蛋白基因表达的诱导剂中的应用。
[0021]
本发明的又一方面提供了上述组合物在制备抗菌药物、免疫增强剂中的应用。
[0022]
根据本发明的一些实施方式，所述抗菌药物为抗革兰氏阴性菌药物，更进一步地，所述药物为抗肠炎沙门氏杆菌药物。
[0023]
本发明人研究发现，肠炎沙门氏杆菌分泌的胞外多糖的主要成分eps5可以显著诱导果蝇s2细胞dmpgrp-ld的表达，从而激活dmpgrp-ld相关联的免疫反应，最终起到抵御细菌的作用。通过对eps5成分分析，发现其由甘露糖、半乳糖和葡萄糖以7:2.7:1的比例复合而成，在此基础上，改变甘露糖、半乳糖和葡萄糖的复合比例，发现在一定范围内的配比，也可以诱导dmpgrp-ld的表达。本发明虽然是在肠炎沙门氏菌胞外多糖的基础上进行研究的，但配制的不同比例化学品甘露糖、半乳糖和葡萄糖的溶液也能诱导pgrp-ld表达，说明只要是满足本发明请求保护的单糖组成和配比范围就可以诱导pgrp-ld的表达。
[0024]
在昆虫的先天免疫中，有些肽聚糖识别蛋白能够利用细菌独有的肽聚糖识别入侵细菌，并将细菌入侵信号传递给下游的抗菌肽合成途径，启动抗菌肽基因的转录和合成；本发明的组合物能够使肽聚糖识别蛋白基因的表达上调，因此，有望成为提高机体免疫的药物或代替抗生素成为新的抗菌药物。
[0025]
本发明的组合物制备简单，可以直接复配得到，也可以从细菌胞外多糖中提取得到。方法简单，利于大规模生产。
附图说明
[0026]
图1为sgrna1和sgrna2敲除pgrp-ld对果蝇dmpgrp-ld蛋白的影响；
[0027]
图2为敲除果蝇s2细胞dmpgrp-ld后肠炎沙门氏杆菌的增殖情况图；
[0028]
图3为在果蝇s2细胞中过表达dmpgrp-ld后肠炎沙门氏杆菌的增殖情况图；
[0029]
图4为肠炎沙门氏杆菌胞外粗多糖的柱层析洗脱结果图；
[0030]
图5为肠炎沙门氏杆菌胞外多糖eps5的气相色谱-质谱联用分析结果图；
[0031]
图6为肠炎沙门氏杆菌胞外多糖eps5的高效凝胶渗透色谱分析结果图；
[0032]
图7不同浓度的肠炎沙门氏杆菌胞外多糖eps5对果蝇s2细胞dmpgrp-ld表达量的影响图；
[0033]
图8为不同比例化学品甘露糖、半乳糖和葡萄糖溶液对果蝇s2细胞dmpgrp-ld表达量的影响图。
具体实施方式
[0034]
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案和技术效果做进一步说明和阐释，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
[0035]
实施例1 dmpgrp-ld基因对肠炎沙门氏杆菌的增殖情况的影响
[0036]
1、构建pac-dmpgrp-ld sgrna-cas9质粒
[0037]
(1)设计2对果蝇dmpgrp-ld的sgrna，在正向sgrna的5’端加上ttcg之后，将sgrna引物退火合成双链。sgrna的引物序列如表1所示。
[0038]
表1 sgrna的引物序列
[0039][0040]
(2)按分子克隆常规方法将sgrna插入到pac-sgrna-cas9载体，得到pac-dmpgrp-ld sgrna-cas9重组质粒。
[0041]
2、构建piex-4-dmpgrp-ld-his重组质粒
[0042]
(1)设计引物及pcr反应；构建piex-4-dmpgrp-ld-his重组质粒所用到的引物如表2所示。
[0043]
表2 pcr反应时的引物序列
[0044][0045]
pcr反应：以果蝇s2细胞cdna为模板，利用引物dmpgrp-ld-f和dmpgrp-ld-r进行第一轮pcr扩增，随后用第一轮pcr产物为模板，用引物dmpgrp-ld-f-his和dmpgrp-ld-r进行第二轮pcr扩增。
[0046]
(2)按分子克隆常规方法将上述克隆到的目的片段插入到piex-4载体，得到piex-4-dmpgrp-ld-his重组质粒。
[0047]
3、验证敲除效率
[0048]
(1)验证敲除效率：实验组与对照组各设立3个生物学重复，实验组中将pac-dmpgrp-ld sgrna-cas9质粒与piex-4-dmpgrp-ld-his质粒共转染进果蝇s2细胞，具体按转染试剂(hd transfection reagent promega,madison,wi cat#e2311)说明书进行。
[0049]
对照组为pac-egfp sgrna-cas9质粒与piex-4-dmpgrp-ld-his质粒共转染进果蝇s2细胞，对照组与实验组后续操作相同。
[0050]
(2)收集相应的细胞样品，用western blot检测dmpgrp-ld的蛋白水平变化，内参蛋白为tubulin(tuba1a)，以确定敲除效率。
[0051]
结果如图1所示，其中，从左至右泳道1、2为对照组，泳道3、4为转染sgrna1的质粒对dmpgrp-ld的敲除效果，泳道5、6为转染sgrna2的质粒对dmpgrp-ld的敲除效果。可以看出，与对照组相比，实验组中dmpgrp-ld的蛋白水平显著下降，表明本发明中的2个pac-dmpgrp-ld sgrna-cas9质粒均具有较高的敲除效率，尤其是含sgrna2的质粒敲除效率更高，所以后续检测敲除dmpgrp-ld后肠炎沙门氏杆菌的增殖情况这一实验中采用的是sgrna2。
[0052]
4、检测敲除dmpgrp-ld后肠炎沙门氏杆菌的增殖情况
[0053]
(1)细胞转染：实验组与对照组各设立3个生物学重复，在实验组，将本发明中的pac-dmpgrp-ld sgrna-cas9质粒转染进果蝇s2细胞，具体操作按转染试剂(hd transfection reagent promega,madison,wi cat#e2311)说明书进行。
[0054]
对照组中则将pac-egfp sgrna-cas9质粒转染进果蝇s2细胞，其他操作相同，后续操作也均相同。
[0055]
(2)加菌处理：上述果蝇s2细胞转染48h后用野生型或是sfgfp标记的肠炎沙门氏杆菌处理，具体操作如下：向上述6孔板中每孔加入50nm水溶性胆固醇，孵育30min后加入细菌悬浮液；28℃攻菌1.5h，清洗细胞移除胞外细菌，再继续培养3h后攻野生型菌的细胞收集待用，攻sfgfp标记的荧光菌的细胞制片后进行激光共聚焦显微镜观察。
[0056]
(3)利用trizol试剂对攻野生型菌的细胞进行rna抽提。
[0057]
(4)通过琼脂糖凝胶电泳和nanodrop检测rna的质量和浓度。检测合格的rna样品用于后续操作。
[0058]
(5)用takara公司提供的反转录试剂盒(primescripttm rt reagent kit with gdna eraser)对检测合格的rna样品进行反转录，操作步骤参照试剂盒说明书。
[0059]
(6)肠炎沙门氏杆菌侵染效率的检测：用qpcr技术检测基因组dna中果蝇dmrp49基因和肠炎沙门氏杆菌invc基因的拷贝数。
[0060]
dmrp49基因的引物序列为f：gacagtatctgatgcccaaca(seq id no:8)；r：cttcttggaggagacgccgt(seq id no:9)；
[0061]
invc基因的引物序列为f：tcaagaatagagcgaatttcatcc(seq id no:10)；r：tgctttttatcgattccatgaccc(seq id no:11)。
[0062]
最后分别算出实验组与对照组中invc基因与dmrp49基因的拷贝数，即可直观看出
肠炎沙门氏杆菌的增殖情况。
[0063]
用荧光显微镜观察果蝇s2细胞中sfgfp标记的荧光菌的个数，统计肠炎沙门氏杆菌的增殖情况。
[0064]
如图2所示，为敲除果蝇s2细胞dmpgrp-ld后肠炎沙门氏杆菌的增殖情况图，其中，a图为qpcr结果，可以看出敲除dmpgrp-ld基因的实验组(dmpgrp-ld-sgrna)中肠炎沙门氏杆菌的invc基因的拷贝数明显高于对照组(egfp-sgrna)。b图为荧光显微镜下果蝇s2细胞中的荧光菌的个数，可以明显看出，敲除dmpgrp-ld基因的实验组(ld-sgrna)，荧光菌的数量明显较对照组(egfp-sgrna)增多；c图为每个细胞中细菌的个数统计图，可以看出实验组(pgrp-ld-sgrna)中侵染细胞的肠炎沙门氏杆菌显著增加。综上，对dmpgrp-ld进行敲除后肠炎沙门氏杆菌的数量显著增加，说明dmpgrp-ld在抵抗肠炎沙门氏杆菌的过程中发挥着重要的作用。
[0065]
5、检测过表达dmpgrp-ld基因后肠炎沙门氏杆菌的增殖情况
[0066]
(1)细胞转染：对照组中将piex4-egfp质粒转染进果蝇s2细胞，实验组则转染构建的piex-4-dmpgrp-ld-his重组质粒，具体操作按转染试剂(hd transfection reagent promega,madison,wi cat#e2311)说明书进行。
[0067]
(2)后续操作同“4、检测敲除dmpgrp-ld后肠炎沙门氏杆菌的增殖情况”中的步骤“(2)、(3)、(4)和(5)”。
[0068]
如图3所示，为在果蝇s2细胞中过表达dmpgrp-ld后肠炎沙门氏杆菌的增殖情况图，其中，a图为qpcr结果，可以看出过表达dmpgrp-ld基因的实验组(dmpgrp-ld)中肠炎沙门氏杆菌的invc基因的拷贝数明显低于对照组(egfp)。b图为荧光显微镜下果蝇s2细胞中sfgfp标记的荧光菌的个数，可以明显看出，过表达除dmpgrp-ld基因的实验组(dmpgrp-ld)，荧光菌的数量明显较对照组(piex4)少；c图为每个细胞中细菌的个数统计图，可以看出实验组(dmpgrp-ld)中侵染细胞的肠炎沙门氏杆菌显著减少。综上，用本发明中的piex-4-dmpgrp-ld-his质粒对果蝇dmpgrp-ld进行过表达，检测肠炎沙门氏杆菌的增殖情况，发现，过表达果蝇dmpgrp-ld后，肠炎沙门氏杆菌的数量显著减少，说明dmpgrp-ld可以抑制肠炎沙门氏杆菌的增殖。
[0069]
实施例2胞外多糖的提取及鉴定
[0070]
1)在lb固体培养基中活化肠炎沙门氏杆菌，然后挑取单菌落，置于含有lb液体培养基的ep管中培养16h～18h；对上述菌液进行扩大培养，即按照2％接种量接种上述菌液到更大的三角瓶中进行培养16h～18h；将得到的发酵液5,000r/min离心10min，以实现菌体和发酵液分离，保留发酵液，弃掉菌体沉淀。
[0071]
2)按5(发酵液)：1(变性剂)向发酵液中加入变性剂，混匀后10,000r/min离心10min，取其上清液。
[0072]
3)将步骤2)的上清液浓缩，加入预冷的无水乙醇至乙醇终浓度为70％～75％，轻轻摇动置于4℃冰箱中，静置过夜后在4℃以下10,000r/min离心10min，弃其上清液，烘干沉淀，得到粗多糖。
[0073]
4)以蒸馏水，0.1、0.2、0.3、0.4mol/l nacl溶液为洗脱液，用deae-52纤维素阴离子交换柱纯化粗多糖，依据不同浓度的洗脱液所形成的峰值可将粗多糖划分为eps1、eps2、eps3、eps4、esp5、eps6六个多糖组分，取分离峰最高的eps5进行浓缩、脱盐、冻干。
[0074]
5)采用气相色谱-质谱联用法分析eps5的单糖组成及比例；通过高效凝胶渗透色谱法测定eps5的分子量和纯度。
[0075]
如图4所示，为肠炎沙门氏杆菌胞外粗多糖的柱层析洗脱结果图。可以看出，用deae-52纤维素阴离子交换柱纯化粗多糖后，依据不同浓度的洗脱液所形成的峰值可将粗多糖划分为eps1、eps2、eps3、eps4、esp5、eps6六个多糖组分，其中eps5峰值最高，为胞外多糖的主要成分。
[0076]
如图5所示，为肠炎沙门氏杆菌胞外多糖eps5的气相色谱-质谱联用分析结果图，图中，上曲线为标准品；下曲线为eps5样品；其对应的单糖分析如表3所示，可以看出，eps5主要由甘露糖、半乳糖和葡萄糖以7:2.7:1的比例复合而成。
[0077]
如图6所示，为肠炎沙门氏杆菌胞外多糖eps5的高效凝胶渗透色谱分析结果图，其对应的计算结果如表4所示。
[0078]
表3肠炎沙门氏杆菌胞外多糖主要成分eps5的单糖组成分析
[0079][0080]
表4肠炎沙门氏杆菌胞外多糖主要成分eps5的分子量分析
[0081][0082]
实施例3不同浓度的胞外多糖eps5对dmpgrp-ld表达量的影响
[0083]
(1)果蝇s2细胞铺板后，待密度长到80％-90％时，分别将一系列浓度的胞外多糖eps5加到6孔板中，一个浓度做3个重复。以不加胞外多糖eps5处理作为对照。
[0084]
(2)处理3h后收集细胞，qpcr检测果蝇s2细胞dmpgrp-ld的表达量。
[0085]
(3)利用trizol试剂对上述收集到的细胞进行rna抽提。
[0086]
(4)通过琼脂糖凝胶电泳和nanodrop检测rna的质量和浓度。检测合格的rna样品用于后续操作。
[0087]
(5)用takara公司提供的反转录试剂盒(primescript
tm rt reagent kit with gdna eraser)对检测合格的rna样品进行反转录，操作步骤参照试剂盒说明书。反转录得到的cdna用于下一步的qpcr检测。
[0088]
(6)利用qpcr技术检测果蝇s2细胞dmpgrp-ld的表达量，以果蝇dmrp49为内参基因，所用引物如表5所示。
[0089]
表5 qpcr引物序列
[0090][0091]
如图7所示，为不同浓度的胞外多糖eps5对dmpgrp-ld表达量的影响图，可以看出，用胞外多糖eps5处理果蝇s2细胞3h后，dmpgrp-ld表达量显著上调，当胞外多糖eps5浓度为4μg/ml时，对dmpgrp-ld表达量的促进达到峰值。
[0092]
实施例4不同比例的甘露糖、半乳糖和葡萄糖溶液对dmpgrp-ld表达量的影响
[0093]
(1)用双蒸水将甘露糖、半乳糖和葡萄分别以7:4.7:1、7:3.7:1、7:1.7:1、7:2.7:2、9:2.7:1、7:2.7:1.5、8:2.7:1、7:2.7:0.5、6:2.7:1、0:1:0、1:0:0和0:0:1的摩尔比例配成12种不同的糖溶液。
[0094]
(2)将果蝇s2细胞铺到6孔板中，待密度长到80％-90％时，将上述12种糖溶液分别添加到6孔板中，使每个孔中糖的总浓度为4μg/ml。
[0095]
(3)处理3h后收集细胞，用于后续检测细胞中dmpgrp-ld的表达量。
[0096]
dmpgrp-ld的表达量的测定方法同实施例3。
[0097]
如图8所示，为不同比例的甘露糖、半乳糖和葡萄糖溶液对果蝇s2细胞dmpgrp-ld表达量的影响图；可以看出，当把甘露糖、半乳糖和葡萄糖三者比例调整为7:4.7:1、7:3.7:1、7:1.7:1、7:2.7:2、9:2.7:1、7:2.7:1.5或6:2.7:1后，依然可以显著诱导dmpgrp-ld的表达。当只用甘露糖、半乳糖或者葡萄糖处理细胞时，dmpgrp-ld表达量均没有显著变化。
[0098]
尽管已参照具体实施方式公开了本发明，但是显而易见的是，在不背离本发明的真正精神和范围的情况下，本领域的其他技术人员可以设计本发明的其它实施方式和变化，所附权利要求书目的在于被解释为包括所有这样的实施方式和等价的变化。此外，本文引用的所有参考文献的内容据此引入本文以供参考。