[0001]
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种猪源3型链球菌荚膜多糖亚单位疫苗的制备方法及其应用。
背景技术：
[0002]
猪链球菌是一种人畜共患的急性、热性传染病，可引起猪脑膜炎、关节炎和败血症，给养猪业造成严重的经济损失。根据荚膜多糖抗原性的差异，猪链球菌分为35个血清型（1
ꢀ-
34型，1/2型），其中1/2，1，2，7，9型分离率较高，不同血清型菌株之间的致病力不同，其中猪2型链球菌临床分离率最高，其他血清型研究报道较少。但近年来猪3型链球菌发病呈现增长趋势，已成为区域优势血清型菌株。
[0003]
疫苗免疫接种被认为是防控猪链球菌病的最经济及最有效手段，商品化疫 苗的推广应用为有效防控中国猪链球菌病疫情发挥了重要作用。目前，我国商品化猪链球菌疫苗包括：猪败血性链球菌病活疫苗（st171株），猪链球菌病灭活疫苗（马链球菌兽疫亚种+猪链球菌2型），猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病二联灭活疫苗（lt株+md0322株+sh0165株），猪链球菌病蜂胶灭活疫苗（马链球菌兽疫亚种+猪链球菌2型），猪链球菌病灭活疫苗（2型，ha9801 株），猪链球菌病灭活疫苗（马链球菌兽疫亚种+猪链球菌2型+猪链球菌7型）。市场上出售的这 6 种疫苗（1 种活苗和 5 种灭活苗），涉及到的菌株 5 种，均已2型链球菌为主。由于不同血清型猪链球菌菌株之间缺乏交叉保护性，因此迫切需要研制猪3型链球菌疫苗以便用于猪场防疫。
[0004]
荚膜多糖是细菌的保护性抗原和毒力因子，是细菌结构变化最少的表面抗原，具有较好的免疫原性，是最适宜做疫苗成分的靶抗原之一，纯化的荚膜多糖制备的疫苗具有较好的效果。
技术实现要素：
[0005]
本发明旨在提供一种猪3型链球菌荚膜多糖亚单位疫苗，其特征在于包含3型链球菌荚膜多糖与完全弗氏佐剂载体的联合物，其中3型链球菌荚膜多糖和完全弗氏佐剂按1：1混合，3型链球菌荚膜多糖的含量为5mg/ml。
[0006]
本发明进一步公开了猪3型链球菌荚膜多糖亚单位疫苗在预防猪3型链球菌感染诱发疾病中的应用，实验结果显示本发明可提供同源菌株的攻毒保护，可诱导机体产生高滴度抗体水平，降低生猪3型链球菌临床发病率。
[0007]
本发明更加详细的描述如下：本发明中的猪3型链球菌荚膜多糖，可通过以下制备工艺制备：（1）将猪3型链球菌菌种（本实验室分离鉴定菌株）接种于装有5ml胰蛋白胨大豆肉汤培养基 （tsb）的试管中，置于恒温培养摇床培养12h，制作种子液以备扩大培养用；所述的tsb液体培养基成分如下：胰蛋白胨 1.5%（g/100ml，大豆蛋白胨 0.5%（g/100ml），氯化钠 0.5%（g/100ml）用蒸馏水配制而成，调节ph为7.2
±
0.2，经121℃压力蒸汽灭菌后使用。
[0008]
（2）将种子菌液接种于500mltsb液体培养基中，在恒温培养摇床中振荡培养12-14h；（3）4℃低温离心收集菌泥，然后用pbs溶解并高压蒸汽灭菌，收集所有上清液；（4）加入结晶状无盐卵清溶菌酶，悬浮液37℃培养6~8h，离心除去沉淀；（5）向裂解液中加入蛋白酶k，55℃作用2h，同期加入终浓度为0.1m的cacl2，搅拌1h；（6）把所得上清液用0.22μm纤维膜过滤；（7）所得液体电炉上加热浓缩，当液体变浑浊时，停止加热，迅速转移至室温条件的水浴锅或者4℃冰箱降温；（8）按照体积比(v/v)加入无水乙醇，最终浓度比为30%，4℃冰箱过静止夜；（9）离心收集上清液，加入无水乙醇使其终浓度为80% (v/v)，封口膜密封后，4℃冰箱静止过夜；（10）离心弃全部上清液，得白色沉淀，用冷冻冻干机干燥后收集，即得荚膜多糖。
[0009]
本发明提供的所述亚单位疫苗的制备方法，荚膜多糖和完全弗氏佐剂是按1：1混合乳化得到；本发明提供的猪3型链球菌荚膜多糖亚单位疫苗经肌肉注射免疫后可激发机体产生抗3型链球菌荚膜多糖的抗体。
[0010]
本发明公开的猪源3型链球菌荚膜多糖亚单位疫苗的生理、生化特性如下：（1）本发明的3型链球菌荚膜多糖的含量为5mg/ml；（2）本发明为油乳剂型且肌肉注射方式。
[0011]
本发明针对近年来猪3型链球菌临床上呈现优势流行趋势现象，主要解决了现有的商品化猪链球菌疫苗缺乏交叉保护性问题，重点考察了荚膜多糖作为亚单位疫苗的可能性，主要难点在于疫苗用菌种筛选与荚膜多糖的提取与纯化。
[0012]
本发明公开的猪源3型链球菌荚膜多糖亚单位疫苗所具有的积极效果在于：（1）本发明的荚膜多糖亚单位疫苗对3型链球菌的保护率为75%；（2）本发明可诱导机体产生高滴度igg、igm抗体水平；（3）本发明可使仔猪3型链球菌的发病率降低约60%。
具体实施方式
[0013]
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。其中猪3型链球菌由本实验室分离鉴定并保存于本实验室（具体分离鉴定方法详见：猪源3型链球菌分离鉴定及生物学特性研究，动物医学进展，2020，41（9）：11-15）。
[0014]
猪3型链球菌具体特性：灰白色、半透明、边缘整齐的β溶血环的光滑型圆形小菌落；携带srta、orf2、gapdh、abpb、ssna、lmb、znua、gdhgdh、epf、mrp毒力基因；生长曲线显示该菌株在9h～10h时生长达到峰值(log cfu=9.4)）；药敏试验结果表明分离株对阿莫西林、头孢类等敏感，对氟苯尼
考、林可霉素等耐药；对小鼠表现强致病力，用细菌数为1
×
109cfu/ml菌株于感染后12h内致死率达100%。
[0015]
实施例1 猪3链球菌荚膜多糖的制备 1、粗糖的提取将3型链球菌接种于tsb液体培养基中，培养致对数期，离心后pbs清洗，并悬浮于pbs液中，121℃高压，收集所有上清液。加入结晶状无盐卵清溶菌酶，悬浮液37℃培养6~8h，离心除去沉淀，向裂解液中加入蛋白酶k，55℃作用2h，同期加入终浓度为0.1m的cacl2，搅拌1h。把所得上清液用0.22μm纤维膜过滤。所得液体电炉上加热浓缩，当液体变浑浊时，停止加热，迅速转移至室温条件的水浴锅或者4℃冰箱降温。按照体积比(v/v)加入无水乙醇，最终浓度比为30%，4℃冰箱过静止夜。25000
×
g离心30min，白色沉淀废弃，收集上清液，加入无水乙醇使其终浓度为80% (v/v)，封口膜密封后，4℃冰箱静止过夜，25000
×
g离心30 min。倾去全部上清液，得白色沉淀，用冷冻冻干机干燥后收集。
[0016]
200ml tsb培养基培养3型链球菌，通过上述方法提取荚膜多糖，经过冷冻冻干机干燥后得到白色粉末状粗制荚膜多糖0.0887g。苯酚硫酸法测定荚膜多糖含量，用不同浓度葡萄糖制作标准品，以横坐标表示od值，纵坐标是样品浓度绘制标准曲线，得出y=0.0106x线性方程，通过紫外分光光度计测得待测多糖在490nm处吸光度为0.3227，算出粗制荚膜多糖含量为34.21%。
[0017]
2、荚膜多糖纯化精确称量烘干的白色物质。取其中5mg白色粉末溶于用5ml双蒸水中，及时加入dna和rna酶，浓度为100 mg/ml，在37℃持续作用过夜。取样稀释50倍，用核酸蛋白仪测核酸含量，核酸含量：0.0986mg/ml，蛋白含量0.0951mg/ml。
[0018]
精确称量烘干的荚膜多糖5mg溶于5ml双蒸水中，并加入蛋白酶k，检测蛋白含量。将样品梯度稀释，加20ul到96孔板的样品孔中。各孔加入200ul bca工作液，37℃放置15-30min。用酶标仪测定a560nm，根据标准曲线计算出蛋白浓度。提纯后再用紫外分光光度计在490nm处的吸光度计算出多糖含量为71.12%。
[0019]
实施例2猪源3型链球菌荚膜多糖亚单位疫苗制备将实施例1获得的纯化后荚膜多糖用灭菌pbs稀释至100ug/ml，与完全弗氏佐剂按1：1混合均匀，即制备成荚膜多糖亚单位疫苗，经无菌检验后用于后续免疫。
[0020]
实施例3猪源3型链球菌荚膜多糖疫苗免疫保护率试验40只小鼠随机分成4组，荚膜多糖亚单位疫苗试验组，商品疫苗（2+7型）阳性对照组，攻毒对照组，空白对照组。荚膜多糖亚单位疫苗试验组小鼠肌肉注射荚膜多糖亚单位疫苗0.2ml，商品疫苗（2+7型）阳性对照小鼠肌肉注射2、7型链球菌通用疫苗0.2ml，攻毒对照组与空白对照组分别小鼠肌肉注射pbs溶液0.2ml进行空白免疫。间隔14d加强免疫1次，然后用腹腔注射致死量浓度的猪3型链球菌，进行攻毒。动物试验期间，观察小鼠精神状态，记录每组小鼠死亡情况，计算保护率；本发明的荚膜多糖疫苗对3型链球菌的保护率为75%，商品疫苗（2+7型）对3型链球菌交叉保护率为37.5%，空白攻毒对照组死亡率100%。
[0021]
实施例4猪源3型链球菌荚膜多糖疫苗抗体滴度试验检测具体步骤：将特异性抗小鼠的igg、igm抗体预包被在高亲和力的酶标板上，采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术检测小鼠igg、igm抗体，首先将标准品和待测样本加入到酶标板孔中进行孵育。推荐两步稀释。第一步，10μl样本加990μl 1
×
检测缓冲液。第二步，10μl第一步稀释的混合样本加990μl 1
×
检测缓冲液。首先用300 μl 1
×
洗液洗涤1次并在滤纸上拍干，可浸泡30 s后倒去洗液，这一步的目的是平衡酶标板；然后向酶标孔中按照标准品浓度从高到底的顺序依次加入提前倍比稀释的标准品；然后在空白孔中加入待测的小鼠血清，孵育2 h后弃掉孔中液体用1
ꢀ×
洗液洗涤5次，彻底洗去未结合的物质，然后加入100 μl检测抗体放入37 ℃恒温培养箱中孵育。将孔中液体倒出后用1
×
洗液再次洗涤5次并在滤纸上拍干，每孔加入100 μl显色底物tmb，放入培养箱中避光反应，然后加入终止液终止反应。立即使用酶标仪在450 nm波长下测定吸光值。根据说明书中的计算方法计算小鼠血清中igg和igm的浓度。
[0022]
以igg、igm浓度为横坐标，od值为纵坐标绘制标准曲线，分别得出igg线性方程为y=0.0352x-0.0208。igm线性方程为y=0.0467x-0.0332。算出小鼠血清中igg、igm的含量分别为0.1912
±
0.01458mg/ml、0.8211
±
0.07718mg/ml。经过spss分析，在p<0.05置信区间，本发明实验组igg、igm抗体含量与其他组存在显著性差异，说明可诱导机体产生高滴度抗体水平。
[0023]
实施例5猪源3型链球菌荚膜多糖疫苗猪场应用情况如下：针对3型链球菌阳性某猪场，选择4-5周龄断奶仔猪60头，实验组和对照组各30头，其中实验组肌肉注射本发明产品2ml，空白对照注射生理盐水，试验周期45天，观察仔猪临床表现并对死亡仔猪或关节液细菌分离。结论：空白对照组发病率15%，实验组发病率5%，即相比空白对照组，本发明可使仔猪3型链球菌的发病率下降60%。