本发明涉及一种抗冠状病毒的组合物及其制备方法和用途，属于医药技术领域。
背景技术：
新型冠状病毒(sars-cov-2)导致的新冠肺炎(covid-19)是严重的公共卫生事件，爆发至今已造成巨大的人员伤亡和经济损失，但是目前临床上尚无疗效明确的针对sars-cov-2的特效药物。临床上主要采用抗病毒药物治疗covid-19，如法维拉韦、磷酸氯喹、洛匹那韦和利托那韦片等，此外，大多数病人还接受抗生素、干扰素、给氧、糖皮质激素和中药等药物治疗，但均不是新型冠状病毒针对性的特效药物。目前，部分潜在抗病毒药物已通过快速评审通道，但临床试验还未结束，有效性待明确。
2020年10月22日，美国fda批准其抗病毒药物瑞德西韦(商品名：veklury)上市，它适用于治疗12岁以上，体重至少40公斤，需要住院治疗的新冠肺炎患者。在2020年5月，fda给予瑞德西韦紧急使用授权，允许医疗人员对新冠肺炎住院患者使用。然而，瑞德西韦的疗效却饱受争议。10月15日，世界卫生组织公布了瑞德西韦、羟氯喹等药物的临床试验结果，称这些药物对于降低新冠肺炎致死率“几乎无效”。因此，迫切需要研发具有自主知识产权的新型抗病毒药物。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种抗冠状病毒的组合物。
为达到本发明的第一个目的，以重量计，所述抗冠状病毒的组合物包括：蜂蜜5～100份，刺梨5～100份，土茯苓1～50份，青柠檬1～30份，车前草1～30份，核桃1～30份，地苦胆1～30份，灵芝1～30份和复活草1～30份。
在一种具体实施方式中，所述组合物包括：蜂蜜10～50份，刺梨10～50份，土茯苓5～30份，青柠檬5～30份，车前草2～10份，核桃2～10份，地苦胆2～10份，灵芝2～10份和复活草2～10份。
在一种具体实施方式中，所述组合物包括：蜂蜜20～40份，刺梨20～40份，土茯苓10～30份，青柠檬5～15份，车前草3～10份，核桃2～5份，地苦胆2～5份，灵芝2～5份和复活草2～5份。
在一种具体实施方式中，所述组合物的制备方法包括：取蜂蜜、刺梨、土茯苓、青柠檬、车前草、核桃、地苦胆、灵芝和复活草，粉碎或切片后，经醇提、渗漉后，收集提取液或渗滤液，加入蜂蜜混合均匀，制备成口服制剂；或取所述蜂蜜、刺梨、土茯苓、青柠檬、车前草、核桃、地苦胆、灵芝和复活草经发酵或浸泡制得口服制剂。
在一种具体实施方式中，所述的口服制剂为酒剂、口服液或酊剂。
本发明的第二个目的是提供一种上述抗冠状病毒的组合物的制备方法。
为达到本发明的第二个目的，所述方法包括：取蜂蜜、刺梨、土茯苓、青柠檬、车前草、核桃、地苦胆、灵芝和复活草，粉碎或切片后，经醇提、渗漉后，收集提取液或渗滤液，加入蜂蜜混合均匀，制备成口服制剂；或取所述蜂蜜、刺梨、土茯苓、青柠檬、车前草、核桃、地苦胆、灵芝和复活草经发酵或浸泡制得口服制剂。
在一种具体实施方式中，所述的口服制剂为酒剂、口服液或酊剂。
本发明的第三个目的是提供上述抗冠状病毒的组合物在制备预防和/或治疗冠状病毒引起的疾病的药物中的用途。
在一种具体实施方式中，所述冠状病毒包括新型冠状病毒sars-cov-2、严重急性呼吸综合征sars、中东呼吸综合征mers或人肠道冠状病毒。
在一种具体实施方式中，所述冠状病毒为新型冠状病毒sars-cov-2。
有益效果：
1)本发明的组合物采用常用药材和食材经科学组方而成，用于抗冠状病毒。
2)本发明提供的组合物所用材料均来源于纯天然中草药或常规食品，具有来源广泛，价格低廉，绿色健康，安全无毒副作用等特点，适于大量推广和使用。
3)本发明的抗冠状病毒的组合物具有优异的抗新型冠状病毒sars-cov-2活性。
具体实施方式
为达到本发明的第一个目的，以重量计，所述抗冠状病毒的组合物包括：蜂蜜5～100份，刺梨5～100份，土茯苓1～50份，青柠檬1～30份，车前草1～30份，核桃1～30份，地苦胆1～30份，灵芝1～30份和复活草1～30份。
在一种具体实施方式中，所述组合物包括：蜂蜜10～50份，刺梨10～50份，土茯苓5～30份，青柠檬5～30份，车前草2～10份，核桃2～10份，地苦胆2～10份，灵芝2～10份和复活草2～10份。
在一种具体实施方式中，所述组合物包括：蜂蜜20～40份，刺梨20～40份，土茯苓10～30份，青柠檬5～15份，车前草3～10份，核桃2～5份，地苦胆2～5份，灵芝2～5份和复活草2～5份。
在一种具体实施方式中，所述组合物的制备方法包括：取蜂蜜、刺梨、土茯苓、青柠檬、车前草、核桃、地苦胆、灵芝和复活草，粉碎或切片后，经醇提、渗漉后，收集提取液或渗滤液，加入蜂蜜混合均匀，制备成口服制剂；或取所述蜂蜜、刺梨、土茯苓、青柠檬、车前草、核桃、地苦胆、灵芝和复活草经发酵或浸泡制得口服制剂。
在一种具体实施方式中，所述的口服制剂为酒剂、口服液或酊剂。
本发明的第二个目的是提供一种上述抗冠状病毒的组合物的制备方法。
为达到本发明的第二个目的，所述方法包括：取蜂蜜、刺梨、土茯苓、青柠檬、车前草、核桃、地苦胆、灵芝和复活草，粉碎或切片后，经醇提、渗漉后，收集提取液或渗滤液，加入蜂蜜混合均匀，制备成口服制剂；或取所述蜂蜜、刺梨、土茯苓、青柠檬、车前草、核桃、地苦胆、灵芝和复活草经发酵或浸泡制得口服制剂。
在一种具体实施方式中，所述的口服制剂为酒剂、口服液或酊剂。
本发明的第三个目的是提供上述抗冠状病毒的组合物在制备预防和/或治疗冠状病毒引起的疾病的药物中的用途。
在一种具体实施方式中，所述冠状病毒包括新型冠状病毒sars-cov-2、严重急性呼吸综合征sars、中东呼吸综合征mers或人肠道冠状病毒。
在一种具体实施方式中，所述冠状病毒为新型冠状病毒sars-cov-2。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法；在本发明中，所述的刺梨、土茯苓、青柠檬、车前草、核桃、地苦胆、灵芝和复活草，可以为鲜品也可以是干燥后的干品。
实施例1
取蜂蜜50g、刺梨50g、土茯苓30g、青柠檬20g、车前草8g、核桃5g、地苦胆5g、灵芝5g、复活草5g，加入上述组方总重量4倍的水，在15-40℃，避光，密封条件下，发酵30天，过滤，收集药液，即得。
实施例2
取蜂蜜60g、刺梨40g、土茯苓25g、青柠檬20g、车前草15g、核桃10g、地苦胆10g、灵芝10g、复活草10g，加入上述组方总重量4倍的水，在15-40℃，避光，密封条件下，发酵30天，过滤，收集药液，即得。
实施例3
取蜂蜜20g、刺梨30g、土茯苓20g、青柠檬10g、车前草5g、核桃5g、地苦胆5g、灵芝5g、复活草5g，加入上述组方总重量4倍的水，在15-40℃，避光，密封条件下，发酵30天，过滤，收集药液，即得。
对比例1
取蜂蜜50g、刺梨50g、土茯苓30g、青柠檬20g、车前草8g、核桃5g、地苦胆5g、灵芝5g、复活草5g，粉碎成粗粉，以50°的白酒浸润，并以1ml/min的流速进行渗漉提取，收集2倍处方重量的渗漉液，加入蜂蜜5g，混匀，即得。
对比例2
取蜂蜜50g、刺梨50g、土茯苓30g、青柠檬20g、车前草8g、核桃5g、地苦胆5g、灵芝5g、复活草5g，粉碎成粗粉，以50°的白酒浸润，并以3ml/min的流速进行渗漉提取，收集3倍处方重量的渗漉液，加入蜂蜜20g，混匀，即得。
对比例3
取蜂蜜60g、刺梨60g、土茯苓40g、青柠檬30g、车前草10g、核桃10g、地苦胆10g、灵芝10g、复活草10g，加入药材总重量6倍的水，浸泡半小时，提取2次，每次2小时，过滤，合并提取液，加入蜂蜜10g，混匀，即得。
对比例4
取蜂蜜35g、刺梨30g、土茯苓20g、青柠檬10g、车前草7g、核桃4g、地苦胆4g、灵芝4g、复活草4g，加入上述组方总重量4倍的水，置阴凉处发酵30天，过滤，收集发酵液，即得。
对比例5
取蜂蜜35g、刺梨100g、土茯苓20g、青柠檬10g、车前草7g、核桃4g、地苦胆4g、灵芝4g、复活草4g，加入上述组方总重量4倍的水，置阴凉处发酵30天，过滤，收集发酵液，即得。
对比例6
取蜂蜜35g、刺梨30g、土茯苓80g、青柠檬10g、车前草7g、核桃4g、地苦胆4g、灵芝4g、复活草4g，加入上述组方总重量4倍的水，置阴凉处发酵30天，过滤，收集发酵液，即得。
对比例7
取蜂蜜35g、刺梨30g、土茯苓20g、青柠檬50g、车前草7g、核桃4g、地苦胆4g、灵芝4g、复活草4g，加入上述组方总重量4倍的水，置阴凉处发酵30天，过滤，收集发酵液，即得。
对比例8
取蜂蜜35g、土茯苓20g、青柠檬10g、车前草7g、核桃4g、地苦胆4g、灵芝4g、复活草4g，加入上述组方总重量4倍的水，置阴凉处发酵30天，过滤，收集发酵液，即得。
对比例9
取蜂蜜35g、刺梨30g、青柠檬10g、车前草7g、核桃4g、地苦胆4g、灵芝4g、复活草4g，加入上述组方总重量4倍的水，置阴凉处发酵30天，过滤，收集发酵液，即得。
对比例10
取蜂蜜35g、刺梨30g、土茯苓20g、青柠檬10g、核桃4g、地苦胆4g、灵芝4g、复活草4g，加入上述组方总重量4倍的水，置阴凉处发酵30天，过滤，收集发酵液，即得。
对比例11
取蜂蜜35g、刺梨30g、土茯苓20g、青柠檬10g、车前草7g、核桃4g、地苦胆4g、复活草4g，加入上述组方总重量4倍的水，置阴凉处发酵30天，过滤，收集发酵液，即得。
对比例12
取蜂蜜35g、刺梨30g、土茯苓20g、车前草7g、核桃4g、地苦胆4g、灵芝4g、复活草4g，加入上述组方总重量4倍的水，置阴凉处发酵30天，过滤，收集发酵液，即得。
对比例13
取灵芝100g，加入上重量4倍的水，置阴凉处发酵30天，过滤，收集发酵液，即得。
对比例14
取车前草100g，加入上重量4倍的水，置阴凉处发酵30天，过滤，收集发酵液，即得。
试验例1
抗新型冠状病毒研究
(1)细胞毒性实验
将冻存在液氮罐中的veroe6细胞取出，按照标准步骤进行复苏。细胞经传代两次后，取对数生长的细胞，按照每孔2000个接种于96孔板中，边孔加生理盐水填充，每孔100微升培养基，细胞贴壁后，将各实施例中的发酵液用培养基稀释到一定浓度，加到细胞中，培养72小时。每孔加20微升mtt(5mg/ml)，作用4小时后，使用排枪吸除液体，每孔加150微升的dmso，摇床震荡约10分钟后，使用酶标仪测570的吸光光度值；据数据吸光度计算抑制率，然后计算半数细胞毒性浓度cc50。
(2)空斑减少中和实验(prnt)
1)veroe6细胞，24孔板每孔种20万个细胞，过夜培养使其贴壁。
2)将每个血清样品，分别用含2％灭活fbs的dmem培养基，按2倍梯度逐级稀释，起始稀释倍数为5倍，总共6个浓度梯度，即5、10、20、40、80、160。每个稀释后的样品的体积为125μl。具体方法为：①将36个血清样品(6个免疫组×6只动物/组)离心，使液体都流到ep管底部；②在含50μl血清的离心管中，加入含2％灭活fbs的dmem培养基200μl，混匀，即得稀释5倍的样品；取出其中125μl，加入至加入125μl含2％灭活fbs的dmem培养基中，即得稀释10倍的样品；再以此类推，逐级稀释，分别获得稀释20、40、80、160倍的样品。
3)用含2％灭活fbs的dmem培养基将sars-cov-2病毒稀释至400pfu/ml。
4)将稀释好的血清样品和sars-cov-2病毒等体积混合，37度孵育1小时；同时，采用含2％灭活fbs的dmem培养基作为空白对照组，与sars-cov-2病毒等体积混合，平行试验，37度孵育1小时。
5)弃掉vero细胞的培养基，然后将热孵育后的病毒-血清混合物加入到细胞中，每孔200μl。
6)培养箱孵育1小时，期间每15分钟摇一下培养板。
7)1小时后弃掉含有病毒的培养基，并用pbs清洗一遍。
8)65-100度加热熔化浓度为5％的低熔点琼脂糖，待其冷却至略微不烫手(约40-60度)时，用37度预热的含2％灭活fbs的dmem培养基将其稀释至浓度为1％。然后每孔(步骤7中的24孔板)加250μl。
9)培养箱培养48小时。
10)弃掉培养基，用4％多聚甲醛固定15分钟，然后用0.2％的结晶紫染色。
11)统计空斑数量
根据空斑数，计算半数有效浓度ec50。选择指数si＝cc50/ec50。体外实验结果见表1。
表1发酵液抗新冠病毒活性研究
注：表格中的半数细胞毒性浓度和半数有效浓度数值，为培养基稀释发酵液的百分比；空斑减少中和实验在发酵液无细胞毒性情况下进行；选择指数si＝cc50/ec50。
细胞毒性实验和空斑减少中和实验结果见表1。由表可知，实施例1-3的选择指数6.40～50.00，高于对比例的2.53～5.70，其中实施例1的发酵液对veroe6细胞的半数抑制浓度cc50＝6.00％，对sars-cov-2的半数有效浓度ec50＝0.12％，选择指数为50，而其他实施例中，选择指数均远低于实施例1。表明，实施例1的发酵液具有优异的抗sars-cov-2活性。