右旋氯胺酮在制备治疗脱髓鞘疾病药物中的应用的制作方法

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本发明涉及右旋氯胺酮在制备治疗脱髓鞘疾病药物中的应用，属于医药领域。


背景技术：

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多发性硬化(multiple sclerosis,ms)是一种自身免疫性中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，其病理特征为中枢神经系统内淋巴细胞浸润、少突胶质细胞破坏所致脱髓鞘、小胶质细胞和(或)星形胶质细胞再生形成影斑，严重时可合并神经细胞凋亡从而在临床上导致多种异质性表现，病变可累及大脑、脊髓、脑干、小脑等多部位，以白质受累为主。ms是影响年轻人最常见的非创伤性致残疾病，并在机体功能、经济和生活质量方面产生巨大影响。在发达和发展中国家中，ms的发病率和患病率均在增加，其某些特定致病因素与环境，遗传和感染等有关，但ms的根本致病机制尚不明确。ms发病机制的研究进展对其治疗具有重要意义。
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实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,eae)是一种以特异性致敏cd4
+
t细胞为主导的，以中枢神经系统内小血管周边大量单核细胞弥漫浸润及脱髓鞘为特点的自身免疫系统疾病。eae动物模型是目前国内外公认的研究ms的经典模型，为研究ms的发病机制、治疗和预防复发创造了有利条件。由于ms的发病机制复杂，近年来，有研究认为，坏死性凋亡参与了ms的发病机制。坏死性凋亡(necroptosis)是一种程序性细胞死亡，参与器官发育、组织稳态稳定、炎症和疾病发病机制的可调节性坏死途径。它是由toll样受体和死亡受体激活，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα，tnf-α)、干扰素和dna损伤诱导，进一步激活受体相互作用蛋白1(receptor-interacting protein，rip1)、rip3及蛋白激酶样结构域蛋白(mixed lineage kinase domain-like,mlkl)。随后将磷酸化的mlkl从单体形式转化为寡聚形式，以激活下游信号传导级联并诱导程序性细胞死亡。因此，深入了解ms发病的分子作用机制，寻求可作为临床中诊断药物靶点和分子标记物的关键基因，对ms的尽早诊断和积极治疗尤为重要。
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目前用于ms的药物疗法主要分为两类：疾病修饰疗法和对症疗法。疾病修饰疗法通常是通过免疫调节或免疫抑制作用起效，例如干扰素-β、联苯胺酮、芬戈莫德、那他珠单抗等。对症疗法的主要目的是缓解患者临床症状，减少疾病带来的痛苦，主要包括用于急性期大剂量激素冲击治疗、缓解神经性疼痛的药物、抗惊厥药、抗胆碱能药等。但这些药物的使用可能受其副作用限制，不良反应较多。因此，进一步探究ms发病机制并且开发更有效、耐受性良好且能够减缓疾病进展的药物对ms的治疗具有十分重要的临床意义。


技术实现要素：

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本发明的目的在于提供一种右旋氯胺酮的新用途，将其用于制备治疗脱髓鞘疾病药物，解决现有技术所述的诱导脱髓鞘疾病的药物针对性较差，药物治疗不确切或价格昂贵或毒副作用较大的问题。
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所述右旋氯胺酮的给药剂量取决于多种因素如性别、年龄、体重、sirs炎症程度或
给药途径并有临床医师判断，其药物的用量分为每公斤体重10、20mg两个浓度，便于观察药物的量效关系。经试验验证，右旋氯胺酮的有效剂量10～20mg每公斤体重。
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本发明所述右旋氯胺酮可单独使用腹腔内注射给药。
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本发明所述右旋氯胺酮作为已知化合物可通过本领域已知方法制备或从市场购买上获得。
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本发明的有益效果：在eae小鼠模型中，小鼠急性期会出现后肢瘫痪，体重下降，缓解后运动功能障碍；同时脑和脊髓组织发生大量的坏死样凋亡；给予10、20mg/kg盐酸艾司氯胺酮(右旋氯胺酮)后，能延缓病情及疾病的发生发展；主要以脊髓组织中rip3和mlkl磷酸化水平降低，表明右旋氯胺酮可以缓解eae导致的坏死性凋亡。
附图说明
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图1为盐酸艾司氯胺酮(10mg/kg、20mg/kg)对eae模型动物神经功能评分的影响。
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图2为盐酸艾司氯胺酮(10mg/kg、20mg/kg)对eae模型动物体重的影响。
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图3为盐酸艾司氯胺酮(20mg/kg)对小鼠脑组织损伤及p-mlkl表达的影响。
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图4为盐酸艾司氯胺酮(20mg/kg)对小鼠脊髓组织p-rip3及p-mlkl表达的影响。
具体实施方式
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下面结合具体实施例本发明作进一步的详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。
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盐酸艾司氯胺酮的主要成分为右旋氯胺酮，因此，本发明实施例以盐酸艾司氯胺酮为例进行详细说明，实际使用过程中右旋氯胺酮与其他人体可接受的辅料混合制备得到的药物也可以用于本发明。
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实施例1
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本实施例通过动物试验进一步验证盐酸艾司氯胺酮在制备治疗脱髓鞘疾病药物中的应用，具体试验过程如：
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1、实验动物和试剂：
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spf级雌性雄性c57bl/6小鼠，6-8周，体重18-22g，购自厦门大学实验动物中心。
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盐酸艾司氯胺酮注射液购自恒瑞医药。
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mbp抗体、p-rip3抗体、p-mlkl抗体购自美国sigma公司。
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2、实验方法
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将小鼠按随机数字表法分为normal组，eae组，盐酸艾司氯胺酮10mg/kg组、20mg/kg组。每组12只(6只用于检验脑及脊髓组织，6只用于观察动物存活)。eae组小鼠胸腹部皮下注射接种mog和结核菌素/cfa(终浓度为4mg/ml)混合液：腹侧2-4个点，共200ng/只。建模后当天及第2天，腹腔注射百日咳毒素(ptx)，400ng/只小鼠，加强免疫反应。盐酸艾司氯胺酮10mg/kg组每次小鼠接受免疫前20min腹腔注射10mg/kg给药，连续三天，盐酸艾司氯胺酮20mg/kg组每次小鼠接受免疫前20min腹腔注射20mg/kg给药，连续三天。
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随后进行小鼠神经功能评分观察、脑和脊髓组织损伤及p-rip3、p-mlkl表达检测；本实验动物处置方法符合动物伦理学标准。
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3、检测指标与方法
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3.1小鼠神经功能评分
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建模后至30天持续观察小鼠存活情况，并进行统计学分析。
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发病动物的神经功能症状评估：由两名实验员采取双盲法每天早晚(8∶00和16∶00)两次对各实验组小鼠进行体重测量、神经功能评分。
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神经功能评分标准如下：
[0030][0031][0032]
注：症状评估介于两标准之间者以土0.5计；“每日积分均值”＝当天评分的均值总/实验组动物数量。
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3.2小鼠体重变化情况
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建模后至30天持续观察小鼠体重变化情况，并进行统计学分析。
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3.3小鼠脑组织损伤检测
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建模后30天，利用免疫荧光多重染色检测小鼠脑组织mbp、
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p-mlkl表达情
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3.4小鼠脊髓组织损伤检测
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建模后30天，利用western blot染色检测小鼠脊髓组织p-rip3、p-mlkl表达情况。
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4、统计学分析：采用graphpad prism 8.0(graph pad software,san diego california usa,www.graphpad.com)进行统计学处理。正态分布计量资料以均数
±
标准误(mean
±
sem)表示，两组间比较采用t检验，三组及以上比较采用单因素方差分析，重复测量数据采用重复测量方差分析，组间两两比较采用bonferroni post-hoc检验；非正态分布计量资料以中位数[四分位数间距](m[iqr])表示，组间比较采用mann-whitney u检验。
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5、实验结果
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①
结果显示，以免疫0天起作为评分第1天，连续记录30天各组小鼠神经功能评分，如图1结果显示，normal组小鼠活动正常，精神状态良好，没有出现任何临床症状；与normal组相比，eae组小鼠在免疫第10天起开始出现临床症状，首发症状为毛色暗淡、尾部瘫痪、运动迟缓或轻度步态异常表明，达高峰时严重出现双后肢瘫痪，随后逐渐缓解，与eae模型组相比，盐酸艾司氯胺酮组小鼠均能延缓病情，表现为发病开始时间显著延后能够显著缓解模型动物神经功能损伤，且呈一定的剂量依赖关系。
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②
连续记录30天各组小鼠体重变化，结果如图2所示，由图可以看出：eae组小鼠在
发病期间体重下降幅度大，盐酸艾司氯胺酮组小鼠均能缓解小鼠体重下降，且成一定剂量依赖关系。
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③
利用免疫荧光多重染色检测小鼠脑组织mbp、p-mlkl表达情况，结果如图3所示，由图可以看出：eae组小鼠p-mlkl表达量增加，mbp表达水平降低且髓鞘形态不规整。而盐酸艾司氯胺酮20mg/kg组小鼠p-mlkl表达量较eae组小鼠低，mbp表达水平正常且髓鞘形态规整。
[0045]
④
利用western blotting检测脊髓组织p-rip3、p-mlkl的表达，结果如图4所示，由图可以看出：与normal组比较，eae小鼠30天脊髓组织中p-rip3及p-mlkl表达明显增加，而盐酸艾司氯胺酮20mg/kg组小鼠脊髓组织中p-rip3及p-mlkl表达明显减少。
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众所周知，tnf-α是免疫调节细胞因子，其调节各种生理和病理功能，包括细胞凋亡，增殖，炎症和癌症。ms患者血清中的tnf-α表达水平升高，这与疾病严重程度相关。tnf-α诱导的少突胶质细胞死亡形态类似坏死性凋亡，并通过tnf受体1信号通路激活ripk1。由tnf-α引起的细胞坏死样凋亡可以由膜表面受体，如tnfr1,toll样受体4(toll-like receptor 4,tlr4)，toll样受体3(toll-like receptor3,tlr3)以及干扰素生成调节受体(interferon production regulator receptors,ifnrs)等起始。这些受体与配体结合后通过下游接头蛋白含有tir结构域的衔接子诱导干扰素-β(tir-domain-containing adapter-inducing interferon-β,trif)等促进rip1与rip3，通过rhim-rhim结构域相互作用，使得rip3发生多聚化和磷酸化。磷酸化的rip3可以使下游mlkl磷酸化，磷酸化的mlkl向细胞膜的转运导致坏死，并释放损伤相关的分子模式(damage associated molecular patterns，damps)。
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大量研究表明，坏死性凋亡可能与包括ms在内的各种神经退行性疾病的发病机制有关。在ms脑标本的皮质病变中观察到rip1、rip3和mlkl的激活，目前用于评判tnf-α诱导的细胞坏死性凋亡，生物标记物包括p-rip3和p-mlkl等。其含量的高低与细胞发生坏死性凋亡成正相关关系。因此若能降低组织中这些生物标志物水平，可对eae诱导的脱髓鞘损伤起到保护作用。
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综上所述，在eae小鼠模型中，盐酸艾司氯胺酮可通过抑制p-rip3和p-mlkl表达，缓解脑及脊髓组织发生坏死性凋亡，从而对脱髓鞘疾病发挥保护作用。
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根据上述说明书的揭示及教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改；因此，本发明并不局限于以上揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更应当视为本发明的权利要求的保护范围。此外，虽然本发明中使用了某些特定术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制，采用与其相同或相似方法及组分而得到的其他药液及其制备和应用方法均在本发明保护范围内。