一种天然小分子化合物Berbamine在抑制牛肠道病毒感染中的用途

本发明属于天然小分子化合物berbamine用途的
技术领域：
，具体地，本发明涉及天然小分子化合物berbamine在抑制牛肠道病毒感染中的用途的
技术领域：
。
背景技术：
：牛肠道病毒感染是由小rna病毒科肠道病毒属的牛肠道病毒(bovineenterovirus，bev)引起的一种临床上以发热、咳嗽、呼吸困难、腹泻和繁殖障碍为主要特征的传染病。牛肠道病毒主要引起发热、腹泻、呼吸困难和繁殖障碍等一系列呼吸道及胃肠道疾病，单独感染或与其他病原体发生混合感染或继发感染，严重危害养牛业，造成十分严重的经济损失。且目前尚无针对牛肠道病毒的的诊断试剂和疫苗，因此，寻求新型抗病毒方法和策略显得尤为重要。小檗胺(berbamine，bbm)是存在于小檗属植物中的一种双苄基异喹啉类生物碱。小檗属植物产于我国，约200余种，土名三棵针。其根、根皮和茎皮中含有多种生物碱，其中最主要的为小檗碱。已知小檗胺的医疗作用主要有升高白细胞。用于各种原因引起的白细胞减少症，在癌症患者进行放疗、化疗中，同时还能防止白细胞减少。技术实现要素：针对现有技术存在的不足，本发明提供天然小分子化合物berbamine在预防和/或治疗牛肠道病毒相关疾病中的应用，本发明证实天然小分子化合物berbamine能够有效抑制牛肠道病毒病毒的增殖，且对细胞的毒性较小，从而为有效预防和/或治疗牛肠道病毒感染引发的症状提供了新的途径和选择，具有开发成预防和/或治疗牛肠道病毒感染药物的前景。具体的，本发明涉及以下技术方案：本发明的第一个方面，提供天然小分子化合物berbamine在制备预防和/或治疗牛肠道病毒感染药物中的应用。根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗牛肠道病毒病毒相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。同时，所述预防和/或治疗牛肠道病毒感染药物中，天然小分子化合物berbamine取不低于10μmol/l的药物浓度。本发明的第二个方面，提供天然小分子化合物berbamine在制备抗牛肠道病毒的药物中的应用。本发明的第三个方面，提供天然小分子化合物berbamine在制备抑制和/或杀灭牛肠道病毒的药物中的应用。根据本发明，不仅公开了天然小分子化合物berbamine在制备预防和/或治疗牛肠道病毒感染药物中的应用，而且还公开了，施用天然小分子化合物berbamine与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强这种作用。作为其它药物活性成分的替代或补充，berbamine还可以与其它非药物活性成分组合使用。有鉴于此，本发明的第四个方面，提供一种预防和/或治疗牛肠道病毒感染的药物组合物，所述药物组合物由天然小分子化合物berbamine与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。其中，天然小分子化合物berbamine取不低于10μmol/l的药物浓度。其中所述的其他非药物活性成分包括药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。本发明的第五个方面，提供一种预防和/或治疗牛肠道病毒感染的药物组合物的给药剂型包括固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。所述的，一种预防和/或治疗牛肠道病毒感染的药物组合物的给药剂型包括片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液和小输液。在本发明的意义上，本发明所述的药物组合物表示一种物质，其所含有的天然小分子化合物berbamine对牛肠道病毒具有明显的抑制和/或杀灭作用，并主要作用于牛肠道病毒生活周期的多个阶段，可以实现对牛肠道病毒的直接杀灭作用。本发明的有益技术效果：本发明提供了bbm应用于bev的用途，双苄基异喹啉类生物碱berbamine能够有效抑制牛肠道病毒bev体内外复制，在胞内水平阐明bbm显著抑制bev复制，使用免疫荧光方法检测，bbm对感染bev的mdbk细胞中病毒增殖有明显的抑制作用，呈浓度依赖，最终使用10μmol/lbbm较优，bbm在抗病毒方面仍具有高效性；通过bbm处理的bev子代病毒滴度显著降低及bev引起细胞脱落、变圆和聚集等现象在bbm作用下明显减弱等结果，使bbm的抗病毒作用得到充分证明；在抑制bev体内复制的试验中，使用bbm提前灌胃balb/c小鼠可有效阻止bev感染，减轻bev感染造成的各器官组织病理损伤，bbm在抗病毒感染引起的组织病理损伤方面仍具有高效性；与体外复制研究发现的使用bbm预处理mdbk有效抑制bev在mdbk细胞内的rna积累、mrna复制、致细胞病变效应(cytopathiceffect，cpe)、滴度变化等可共同表明，bbm对bev体内外复制均有抑制作用，为bev防控提供有力的依据，同时为bbm抗病毒的后续研究提供理新的论依据。天然小分子化合物berbamine具有开发成预防和/或治疗牛肠道病毒感染药物的前景，为天然小分子化合物berbamine开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗牛肠道病毒药物奠定实验基础并提供新的视野。附图说明图1所示为免疫荧光染色检测不同bbm浓度下bevdsrna水平图。图2所示为bev荧光定量标准曲线图。图3所示为bev荧光定量溶解曲线图。图4所示为bev荧光定量扩增曲线。图5所示为实时荧光定量pcr检测bevmrna水平图。图6所示为bev感染不同时段的病毒滴度图。图7所示为mdbk细胞cpe情况观察图。图8所示为qpcr检测bev感染bbm预处理balb/c小鼠不同时间后mrna水平图。其中，图a所示为bev感染5d后mrna水平；图b所示为bev感染10d后mrna水平。图9所示为bev感染bbm预处理balb/c小鼠不同时间后各组织病理变化检测图。其中，图a所示为bev感染5d后各组织病理变化；图b所示为bev感染10d后各组织病理变化。图10所示为qpcr检测bbm治疗bev感染balb/c小鼠不同时间后mrna水平图。其中，图a所示为bev感染0d后mrna水平；图b所示为bev感染3d后mrna水平；图c所示为bev感染6d后mrna水平；图d所示为bev感染10d后mrna水平。图11所示为bbm治疗bev感染balb/c小鼠不同时间后各组织病理变化检测图。其中，图a所示为bev感染0d后各组织病理变化；图b所示为bev感染3d后各组织病理变化；图c所示为bev感染6d后各组织病理变化；图d所示为bev感染10d后各组织病理变化。具体实施方式下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中mdbk细胞购自中国科学院上海细胞库；bev-bl311株由新疆农业大学动物医学学抗病毒药物研究实验室分离，已于2021年1月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno:v202098，普通公众可通过保藏中心公共渠道购买获得；balb/c小鼠购自新疆医科大学。本发明中采用的试剂有：bbm(hy-n0714a)购自medchemexpress公司；solutionⅰ购自takara公司；t-vectorpmd19载体购自takara公司；e.colidh5α感受态细胞(bc116-01)购自北京biomed基因技术有限公司；dl500dnamarker购自宝日医生物技术；普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(dp209)；、taqpcrmastermix(kt201)购自天根生化科技(北京)有限公司。所述试剂、材料均可通过公共渠道购买。本发明中所采用的仪器为：pcr仪(c1000)、电泳凝胶成像仪(geldocxr+)购自bio-rad公司；制冰机购自日本三洋公司；低温高速离心机、移液器等购自德国eppendorf公司；细胞培养箱购自glaxy公司；yj-875医用净化工作台购自苏州净化设备公司；高压蒸汽灭菌锅购自上海申安医疗器械厂；透射电子显微镜(ht7700)购自hitachi公司。本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例一：天然小分子化合物berbamine在抑制牛肠道病毒感染中的用途本发明的第一个方面，提供天然小分子化合物berbamine在制备预防和/或治疗牛肠道病毒感染药物中的应用。根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗牛肠道病毒病毒相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。同时，所述预防和/或治疗牛肠道病毒感染药物中，天然小分子化合物berbamine取不低于10μmol/l的药物浓度。本发明的第二个方面，提供天然小分子化合物berbamine在制备抗牛肠道病毒的药物中的应用。本发明的第三个方面，提供天然小分子化合物berbamine在制备抑制和/或杀灭牛肠道病毒的药物中的应用。根据本发明，不仅公开了天然小分子化合物berbamine在制备预防和/或治疗牛肠道病毒感染药物中的应用，而且还公开了，施用天然小分子化合物berbamine与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强这种作用。作为其它药物活性成分的替代或补充，天然小分子化合物berbamine还可以与其它非药物活性成分组合使用。有鉴于此，本发明的第四个方面，提供一种预防和/或治疗牛肠道病毒感染的药物组合物，所述药物组合物由berbamine与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。其中，天然小分子化合物berbamine取不低于10μmol/l的药物浓度。其中所述的其他非药物活性成分包括药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。本发明的第五个方面，提供一种预防和/或治疗牛肠道病毒感染的药物组合物的给药剂型包括固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。所述的，一种预防和/或治疗牛肠道病毒感染的药物组合物的给药剂型包括片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液和小输液。在本发明的意义上，本发明所述的药物组合物表示一种物质，其所含有的berbamine对牛肠道病毒具有明显的抑制和/或杀灭作用，并主要作用于牛肠道病毒生活周期的多个阶段，可以实现对牛肠道病毒的直接杀灭作用。实施例二：bevdsrna检测mdbk细胞计数1×105个/孔接种至铺爬片的培养板中培养到细胞汇合度达70％，分别加入0、1、5、10μmol/lbbm处理mdbk细胞12h；弃掉培养液后加入1000tcid50bev吸附2h后更换为细胞维持液培养24h；每孔200μl的4％多聚甲醛室温下固定20min使用blockingbuffer封闭液孵育1h；稀释anti-dsrnaantibody(1∶1200)置于4℃过夜孵育；更换成coralite488标记驴抗鼠二抗igg(h+l)(1∶250稀释)置于常温下孵育2h后加入pi染核；取少量pvp封片液封片，4℃避光晾干后在激光共聚焦显微镜下观察。为检测不同浓度bbm对bev在细胞内复制的影响，分别使用不同浓度bbm处理mdbk，使用免疫荧光染色检测bbm处理对bevdsrna含量的影响。结果如附图1所示，与对照dmso处理相比，细胞质内特异性绿色荧光在bbm工作浓度为1μmol/l时明显减少，当工作浓度为5μmol/l时绿色荧光基本消失至10μmol/l时完全消失，表明bev在细胞内的复制随着bbm浓度增加而被抑制，10μmol/lbbm可完全抑制bev胞内复制。实施例三：bevsybrgreen荧光定量pcr方法的建立(一)、试验方法1.引物合成：根据已发表文献使用primerpremier5.0软件参考genbank数据库中bev序列设计荧光定量pcr引物，引物序列如表1所示，由苏州金唯智生物科技有限公司合成，目的片段预期大小分别为199bp。表1：bev通用引物2.标准阳性质粒的制备：提取细胞中的bev全序列为模板，使用特异性引物进行pcr扩增目的基因片段。反应体系为50μl，见表2。反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃终延伸10min，，扩增完成后，使用2％琼脂糖凝胶对pcr产物进行电泳鉴定，在120v稳压下电泳30min后，切取相应大小的明亮条带回收。表2：pcr反应体系试剂体积(μl)模板2.00f1.00r1.002×pcrmastermix25.00rnasefreedh2o21.003.使用e.z.n.a.tmgelextractionkit(omega)回收目的基因：(1)用无菌刀片切下将目的基因片条带，放入无菌ep管中。称量重量，按照每0.1g凝胶对应加0.1ml体积的bindingbuffer(xp2)，于55℃金属浴融化凝胶，每3min摇晃一次，至完全融化。(3)将凝胶溶解物加入装有2ml收集管的吸附柱，吸附1min，10000r/min离心2min，弃去滤液。(4)收集管中加入500μlwashingbuffer，10000r/min离心2min。(5)重复上一步。(6)弃去滤液，12000r/min空离3min，弃去收集管。(7)将吸附柱放入新ep管中，加30μlelutionbuffer洗脱，10000r/min离心3min，即可回收到目的片段，存于-20℃。4.载体连接：将bev胶回收产物与t-vectorpmd19载体连接，常温连接4h，得到连接产物。反应体系为10μl，见表3。表2：连接反应体系试剂体积(μl)pmd19-t1.00(0.025pmol)pcr回收产物5.00(0.25pmol)solutionⅰ4.005.制备感受态：(1)将大肠杆菌dh5α菌接种lb固体培养基上37℃恒温培养12-14h，挑取单克隆菌lb液体培养基中，37℃180r/min过夜培养。(2)取100μl活化后的dh5α菌液至10mllb液体培养基中(1∶100的体积比)，37℃200r/min培养2-2.5h，使菌液浓度od600在0.4～0.6之间即可。(3)取1ml菌液至1.5mlep管中，冰浴20min，终止其生长，4000r/min4℃离心5min，收集菌体，并预冷cacl2(75mmol/l)。(4)弃去上清后，加入预冷的cacl2重悬菌体，冰浴30min，4000r/min4℃离心5min，收集菌体。(5)加入200μl低温cacl2悬浮菌体，1：1加入200μl30％甘油保存于-80℃备用。6.连接产物转化至感受态：将10μl连接产物加至100μldh5α感受态中，混匀后冰浴30min。42℃热激90s，迅速冰浴5min。加至800μl液体lb培养基中，37℃摇1h。1000r/min离心5min后弃去上清，取100μl沉淀均匀接种至含氨苄霉素的lb固体培养基上，37℃过夜培养，同时设空白对照。7.菌液鉴定：挑取单菌落接种至含有氨苄青霉素的液体lb培养基中，37℃培养。将菌液按照2步骤进行pcr初筛,将单克隆菌株送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序鉴定。8.绘制溶解曲线：取验证成功的菌液进行快速小提质粒，按照公式：(6.02×1023)×质粒浓度(g/ml)/mw(g/mol)＝copies/ml(其中mw＝质粒总长度×660)，将dna浓度换算为拷贝数。取八连管将10μl阳性重组质粒标准品加入90μlddh2o中，依次做10倍稀释，至1010copies/μl，共稀释8个梯度，以梯度稀释的质粒为模板，使用实时荧光定量pcr制备标准曲线。实时荧光定量pcr扩增体系:2×quantifastsybrgreenpcrmastermix10.0μl，qnroxreferencedye0.1μl，上、下游引物(10μmol/l)各0.5μl,模板cdna1.0μl。扩增程序：95℃2min；95℃5s，60℃30s，40个循环。反应结束后通过样品循环阈(cyclethreshold,ct)值与起始模板拷贝数的log值制成标准曲线，分析熔解曲线以确认反应的特异性。(二)、试验结果为准确定量检测到bev基因，需建立sybrgreen荧光定量pcr方法，在103-1010copies/μl浓度范围内，其扩增曲线如附图4，所得拷贝数(x)与ct值(y)的线性方程为y＝-3.4792x+42.106，线性相关系数(r2)为0.9966，如附图2，说明具有较好的线性关系；熔解曲线中峰型单一，无杂峰，溶解温度一致，退火温度(tm)在82-83.5℃之间，见附图3，说明引物的特异性良好，未出现非特异性产物和引物二聚体。实施例四：bbm影响病毒rna复制的测定结果使用实时荧光定量pcr的方法测定bbm处理的细胞中bevmrna的复制情况。待6孔细胞培养板中mdbk细胞融合率达到60％左右时，加入0和10μmol/lbbm处理12h；吸弃培养液后加入1000tcid50bev吸附2h，更换成5％fbs的细胞培养液，于病毒感染后的0、12、24、36、48h收集细胞及培养液，提取rna并反转录1μg总rna为cdna，使用荧光定量pcr检测bevmrna的表达量；实时荧光定量pcr反应体系为：2xquantinovasybrgreenpcrmastermix10.0μl，5，utr-f1.4μl，5，utr-r1.4μl，cdna模板1.0μl，qnroxreferencedye0.1μl，rnasefreeddh2o6.1μl，反应条件为：95℃2min，95℃5s，60℃30s，循环次数为35次。为检测bbm处理是否影响bev感染不同时段mrna的表达水平，于不同时间点收集bev感染dmso和bbm处理的mdbk细胞及培养液，提取总rna并反转录成cdna，使用实时荧光定量pcr检测bevmrna水平。结果如附图5所示，与对照dmso处理相比，bev感染bbm处理的mdbk细胞mrna量显著性降低，其中bev感染48h时，差异最为明显，约降低40倍，表明bbm处理可显著抑制bevrna的复制。实施例五：bev滴度(tcid50)的测定使用reed-muench法检测bbm对bev子代病毒滴度的影响。分别接种mdbk细胞至6孔细胞培养板中；待细胞汇合度达60％加入0和10μmol/l的bbm处理mdbk细胞12h；分别加入1000tcid50bev吸附2h后换为5％fbs的细胞培养液；于病毒感染后0、12、24、36、48h时反复冻融三次使细胞充分裂解，1000r/min离心后弃掉细胞碎片，取病毒悬液10倍比递减稀释，接种至铺有mdbk细胞(汇合度约70％)的96孔细胞培养板中，吸附2h后更换成5％fbs的细胞培养液，每个稀释度平行做8个复孔；病毒感染3-5d统计细胞病变情况；根据reed-muench法计算tcid50。计算方法如下：lgtcid50＝-(高于50％的稀释对数)+(稀释度对数之间的差)×距离比例为检测bbm处理对bev复制产生子代病毒滴度的影响，使用bev分别感染dmso和bbm处理的mbdk细胞，于感染后不同时间点后收集病毒悬液，并使用reed-muench法检测子代病毒滴度的变化情况。结果如附图6所示，与对照dmso处理相比，bev感染bbm处理的mdbk细胞后各时间段子代病毒的滴度均显著降低，表明bbm可显著抑制bev在mdbk细胞中的复制。实施例六：bvdv致细胞cpe的检测bev感染可导致细胞出现cpe现象，观察bbm是否对bev感染引起的cpe现象有抑制作用。分别接种3×105个/孔mdbk细胞至6孔细胞培养板中，待细胞汇合度达60％时使用0和10μmol/l的bbm处理mdbk细胞12h；分别加入1000tcid50bev吸附2h后换为5％fbs的细胞培养液，于bev感染后0、12、24、36、48h在倒置荧光显微镜下观察cpe情况。为了观察bbm处理对bev感染mdbk细胞cpe是否有影响，使用bev分别感染dmso和bbm处理的mdbk细胞，于病毒感染不同时间点使用倒置显微镜观察细胞形态变化。结果如附图7所示，bev感染对照dmso处理mdbk细胞12、24、36、48h时出现较为明显的细胞变圆、聚集、拉丝、融合、脱落等cpe现象，尤其是24、36和48h时，60％以上的细胞出现聚集、变圆、融合成合胞体等cpe，而bev感染bbm处理的mdbk细胞中多数细胞仍以单个细胞铺展和贴壁的形式出现，cpe情况明显减弱，表明bbm可抑制bev在mdbk细胞中复制，减弱bev感染造成的cpe。实施例七：(一)、小鼠内脏总rna提取及cdna的合成分别配制0mg、50mg和100mg的bbm混悬液，每只balb/c小鼠称重后用量不超过200μl。预防过程将3-4月龄的balb/c小鼠分为3组，第一组为对照组每组3只每天灌胃0mg/kg，第二组为实验组灌胃bbm按照50mg/kg的剂量每日一次，第三组为实验组灌胃bbm按照100mg/kg的剂量每日一次，共灌胃3次，滴鼻感染bev105tcid50，共感染3次，感染后继续药物灌胃，每48h一次，于感染后5d和10d时解剖取肝，脾，肾，小肠等病理组织进行组织总rna的提取，并反转录为cdna通过rt-qpcr方法分析病毒rna在小鼠体内复制情况；治疗过程将3-4月龄的balb/c小鼠滴鼻感染bev105tcid50，于感染后第三天开始治疗，第一组每天灌胃0mg/kg的bbm，第二组每天灌胃bbm按照100mg/kg的剂量，第三组选取无病毒感染小鼠灌胃bbm按照100mg/kg的剂量每日一次，分别于灌胃的0、3、6、10d时取肝，脾，肾，小肠等病理组织进行组织提取总rna，并反转录为cdna通过rt-qpcr的方法分析病毒rna在小鼠体内复制情况。组织总rna提取方法如下：(1)将器具预冷，剖取的新鲜组织块取50-100mg用液氮迅速研磨成粉末加入盛有1ml的trizol裂解液的ep管中，涡旋混匀，静止5min。(2)在ep管中加入氯仿200μl，盖紧管盖并涡旋混匀，4℃离心12000rpm/min离心10min。(3)小心吸取上清至新无rna酶的ep管中，加500μl预冷的异丙醇，颠倒混匀静置10min后12000rpm/min离心10min。(4)吸弃上清，加入预冷的75％乙醇，轻弹混匀，4℃离心12000rpm5min。(5)可重复上一步骤。(6)吸弃上清后室温干燥10min，用20μlddh2o溶解rna震荡混匀后立即测定浓度并反转录成cdna，可于-80℃长期保存。反转录使用takara-rr036a试剂盒体系配制如表4：表4：反转录反应体系反转录反应条件为：42℃30min，85℃5min；反应结束后可将反转录产物置于-20℃保存，以备后续实时荧光定量使用。(二)、babl/c小鼠体内病毒载量测定将提取babl/c小鼠的组织总rna反转为cdna，使用荧光定量pcr检测bevmrna的表达量。实时荧光定量pcr反应体系为：2xquantinovasybrgreenpcrmastermix10.0μl，f1.4μl，r1.4μl，cdna模板1.0μl，qnroxreferencedye0.1μl，rnasefreeddh2o6.1μl，反应条件为：95℃2min，95℃5s，60℃30s，循环次数为35次。(三)、病理切片取肝、脾、肾、小肠等组织浸泡10％中性福尔马林固定液72h，置于流水下冲洗12h，使用梯度浓度(75％、80％、95％、100％)的无水乙醇分别脱水处理2h，置于二甲苯和无水乙醇等体积混匀的溶液中浸泡5min，转移至二甲苯中浸泡5min，重复使用二甲苯浸泡一次；置于石蜡中浸泡12h待凝固成块；使用石蜡切片机将组织切成4-5μm薄片，置于37℃水浴中展开后使用载玻片捞出，静置于40-45℃烘烤2h；使用二甲苯重复处理两次，每次15min以脱去石蜡；将组织切片依次使用100％、95％、85％、75％无水乙醇和ddh2o处理5min；使用苏木素溶液染色10min，流水冲洗10min；用1％盐酸乙醇分色3s，流水冲洗10min，将组织切片放于伊红染液中浸泡7min，使细胞质着色；依次使用75％、95％、100％、100％无水乙醇、无水乙醇和二甲苯等体积混合液、二甲苯等分别处理3min以使组织切片脱色透明；最后使用中性树胶进行封片，使用显微镜观察组织病理变化情况。(四)、测定结果(1)、bbm预防bev感染为了检测bbm预防bev感染balb/c小鼠的作用，使用不同浓度的bbm提前灌胃balb/c小鼠，bev感染balb/c小鼠后继续灌胃bbm，于感染后5和10d时处死小鼠，采集不同组织，使用qpcr和组织病理切片检测bbm预防保护bev感染的作用。结果如附图8所示，与对照相比，bev感染100mg/kgbbm处理balb/c小鼠后肝、脾、肾、小肠等组织中bevmrna水平显著性降低；与其他组织相比，小肠中bevmrna水平降低最为明显，而bev感染10d时除小肠外肝脏中bevmrna水平降低较为明显，约降低28倍；bev感染50mg/kgbbm处理balb/c小鼠10d时各组织中bevmrna水平均出现显著性降低，而5d时肾脏和脾脏中bevmrna水平改变未出现显著性差异。为了进一步检测bbm预防bev感染balb/c小鼠的作用，制备组织病理切片观察bbm保护balb/c小鼠防止bev感染造成的病理变化。取肝、脾、肾、肠四个组织进行h&e染色，染色结果如附图9所示，观察结果显示：bev感染可引起肾脏出血、肾小球充血水肿及炎性细胞增多等现象，100mg/kgbbm处理balb/c小鼠5、10d可显著抑制肾脏出血及肾小球肿大50mg/kgbbm处理balb/c小鼠5、10d可有效减缓肾小球充血肿大，减少炎性细胞浸润，使肾小球和肾小管间质病变均；同时bev感染导致的肝脏出血、肝静脉充血、肝细胞中可见少量颗粒状物质，细胞质呈空泡状等，50mg/kgbbm处理balb/c小鼠5、10d可减少肝脏出血、肝静脉充血，100mg/kgbbm处理5d可减轻上述症状10d可显著抑制肝脏出血、肝静脉充血，减少细胞中颗粒状物质产生及细胞质空泡状现象的发生，使肝小叶结构完整、中央静脉清晰、肝细胞索呈整齐的放射状；bev感染可致小鼠脾脏充血，红细胞显著增多，红髓与白髓界限不清晰，小梁增多，50mg/kgbbm处理balb/c小鼠5d可减少脾脏充血，中性粒细胞增多，10d时脾小梁减少，巨细胞增多，100mg/kgbbm处理5d可减少组织充血，白细胞增多，10d时脾脏充血显著减轻且红髓与白髓界限清晰，出现少量巨细胞；bev感染可致小鼠小肠黏膜充血水肿，黏膜下层的炎性细胞增多，肠绒毛代偿性增宽且缩短，隐窝减少且形态改变，50mg/kgbbm处理balb/c小鼠5d可减少小黏膜下层的炎性细胞浸润，10d可使隐窝增多，肠绒毛增长且隐窝增大，100mg/kgbbm处理5、10d可使肠绒毛上皮细胞由多层变为单层。综上结果表明，bbm处理balb/c小鼠可有效抑制bev感染。(2)、bbm治疗bev感染的作用为了检测bbm治疗bev感染balb/c小鼠的作用，先使用bev感染balb/c小鼠，再灌胃不同浓度的bbm进行治疗试验，于bev感染0、3、6和10d时处死小鼠，采集不同组织，使用qpcr和组织病理切片检测bbm治疗bev感染的作用。结果如附图10所示，与对照相比，100mg/kgbbm处理bvdv感染balb/c小鼠不同时间后bevmrna水平显著性降低，其中bev感染10d时肝脏中bevmrna水平下降最为明显，约降低26倍。为了进一步检测bbm治疗bev感染balb/c小鼠的作用，制备组织病理切片观察bbm治疗bev感染balb/c小鼠的病理变化。分别取肾、脾、肠、肝四个组织进行h&e染色，染色结果如附图11所示，结果与相应对照组相比：自100mg/kgbbm处理balb/c小鼠0d开始各组织中bev感染引起的病变出现减轻；100mg/kgbbm处理balb/c小鼠3d可抑制bev感染引起的肾脏出血现象，6d可减轻肾小球充血水肿等症状，10d可显著减少炎性细胞增多情况；100mg/kgbbm处理balb/c小鼠3d可减轻bev感染导致的小鼠脾脏中巨噬细胞增多的症状，6d改善红细胞增多，小梁增多等现象，10d可显著减少脾脏充血，减少脾小梁，改善红髓与白髓界限不清晰等情况，10d使中性粒细胞增多，巨细胞增多，白细胞增多；100mg/kgbbm处理balb/c小鼠3d可减少小黏膜下层的炎性细胞浸润，使肠绒毛增长隐窝增多且增大，6d可使肠绒毛上皮细胞由多层变为单层，10d可显著抑制小肠黏膜充血水肿，黏膜下层的炎性细胞增多，肠绒毛代偿性增宽且缩短，隐窝减少且形态改变等情况；100mg/kgbbm处理balb/c小鼠3d可减少bev感染导致的肝脏出血、肝静脉充血，6d可使肝细胞索排列整齐，细胞质呈空泡状现象改善，10d可显著抑制肝脏出血、肝静脉充血，减少细胞质空泡状现象的发生，使肝小叶结构完整、中央静脉清晰、肝细胞索呈整齐的放射状。综上结果表明，bbm能治疗bev感染balb/c小鼠，抑制bev感染balb/c小鼠。如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明优化的保护范围内。当前第1页12