BDNF激活组合物和方法与流程

本申请要求序列号为61/794452，2013年3月15日提交的美国临时申请案的优先权。

本发明的领域是增加内源性bdnf的血液水平的组合物和方法，特别是因为它涉及到咖啡水果提取物的使用，以增加人体中内源性脑源性神经营养因子(bdnf)的血清和/或脑水平。

背景技术：

bdnf是神经生长因子(ngf)相关家族的成员，并且被描述为一种在进化过程中结构和功能被高度保全的同源二聚体蛋白。bdnf是一种分泌蛋白，在人类中由bdnf基因编码种。bdnf有几个已被记载的短期和长期的功能作用，并且bdnf用作为产前阶段的神经元亚群的靶衍生的存活和分化因子，也已众所周知。

bdnf还通过增强兴奋性神经递质的活动在海马和ampa受体插入突触后，来促进长时程的增强。这些动作，沿着bdnf的能力到达稳定的树突棘，构成分子在学习、记忆和行为的明显作用。此外，bdnf水平的增加响应于某些形式的损伤，如局部缺血-缺氧和传染性辱骂，推测是通过阻断细胞凋亡。各种研究已表明，bdnf与某些健康状况之间的联系，例如抑郁症、强迫症、阿尔茨海默氏病和痴呆。尽管它的名字是脑源性神经营养因子，但bdnf在多种组织和细胞类型，而不是仅仅在大脑中被发现。它也在心血管、免疫、生殖和内分泌组织中表达。值得注意的是，锻炼已显示能够适度增加bdnf在人体中的表达，其与咖啡因应用在体外和体内后也观察到类似的效果。

虽然bdnf具有相对良好的表征，但是并没有组合物或方法是已知的，以基本上刺激哺乳动物体内的bdnf达到统计学的显著程度，从而帮助提供潜在途径来治疗bdnf相关的病症。此外，也没有组合物和方法是已知的，将有助于bdnf跨越血脑屏障的递送以此提供具有高水平bdnf的神经组织。因此，仍然需要提供组合物和方法用于bdnf在体内的激活，特别是在人类中。

技术实现要素：

本申请发明人现在惊奇地发现，包括一种整个咖啡果(例如，整个咖啡果提取物)制剂或一种水果或蔬菜的原花青素富集制剂的多种组合物能够高效地刺激哺乳动物体内bdnf至其水平典型地超过50，更典型地为100，并且在某些情况下甚至超过上述通常观察到的不给予所述组合物的基准水平的150％。这样的发现是特别意外的，在其它多酚或富含咖啡因的植物制剂和其它咖啡相关的组合物都没有证明bdnf的任何统计学显著增加的情况下。

甚至更令人惊讶地，发明人发现，该组合物和方法，当以相对小批量(例如，50-150mg之间)的方式口服给药时，将会以外来体的形式刺激bdnf的释放，这被证明血液中增加的bdnf的主要部分是由于所考虑的组合物的实施。因此，可以认为，bdnf可以特别有效地经由外来体跨越血脑屏障递送至脑和其它神经组织。在优选的组合物中，咖啡果的制剂是一个整体的咖啡果提取物或整个咖啡果粉(示例性组合物是可商购的作为n580和n286，分别来自vdffutureceuticals,inc.2692n.stateroute117-momence,il60954,usa)。

因此，在本发明主题的一个方面中，本申请发明人考虑，在增加哺乳动物血液中的内源性bdnf的方法中，一种可以增加血液中bdnf水平的组合物，被施用于哺乳动物体内，其中，所述组合物包含一种咖啡果制剂或一种水果或蔬菜的原花青素富集制剂，其特征在于，所述组合物被配制和施用的剂量，以增加血液中bdnf水平的至少25％的量为准。

在特别预期方面，bdnf水平的增加是外体bdnf的增加，咖啡果制剂是整个咖啡果提取物或整个咖啡果粉，并且该组合物的施用剂量在每剂5mg-500mg之间。在其它方面，一种水果或蔬菜的前花青素富集制剂包括原花青素以至少为5μg/g的浓度。最优选地，该组合物的施用剂量，以增加血液中bdnf水平的至少100％为准。

在本发明主题的又一个方面中，本发明人考虑，增加哺乳动物脑循环中的bdnf的方法包括向哺乳动物施用一种组合物的步骤，其包括一种咖啡果制剂或一种水果或蔬菜的前花青素富集制剂，其特征在于，所述组合物被施用的量足以增加外来体bdnf，并且其中，所述增加的外来体bdnf有效地增加哺乳动物脑循环中的bdnf。最典型地，施用是口服给药，所述咖啡果制剂是整个咖啡果提取物或整个咖啡果粉。进一步优选地，所述水果或蔬菜的前花青素富集制剂包括浓度至少为5μg/g的原花青素。

此外，发明人考虑，增加哺乳动物血液中外来体bdnf的一个方法包括向哺乳动物施用一种组合物的步骤，所述组合物包括一个咖啡果或其部分的制剂(例如，整个咖啡果提取物或整个咖啡果粉)，其中，所述组合物的给药量(例如，50-150mg)以足以增加哺乳动物血液中外来体bdnf的量为准。

结果，本申请发明人进一步考虑，增加具有bdnf相关疾病的哺乳动物体内中的bdnf的方法，其中，所述方法包括施用一种组合物(例如，一种咖啡果制剂，整个咖啡果提取物，或整个咖啡果粉，或一种水果或蔬菜的原花青素富集制剂，其包括浓度至少为5μg/g的原花青素)的步骤，所述组合物能够增加哺乳动物血液中外来体bdnf的至少50％的量，相比于未经施用组合物的哺乳动物。尽管不限于本发明主题，考虑到bdnf的相关疾病包括肥胖症、糖尿病、抑郁症、心血管疾病、认知障碍、阿耳茨海默氏病、纤维肌痛、帕金森氏病和痴呆。

从不同的角度来看，本申请发明人也考虑到一种整个咖啡果制剂在通过口服施用以增加哺乳动物血液中外来体bdnf的组合物中的应用。最典型地，整个咖啡果制剂是一个整个的咖啡果提取物或整个咖啡果粉，其中，所述的咖啡果制剂是存在于所述组合物中，以50-150mg之间的量用于口服给药。在优选的应用中，外来体bdnf的增加至少为高于基准线200％的急性增加。

本发明的各种目的、特征、方面以及优点将变得更加清楚，从对本发明优选实施例的详细描述，连同附图中。

附图说明

图1是收集来自经粉末化整个咖啡果提取物(wcfc，n580)、生咖啡豆提取物粉末(n625)、生咖啡豆的咖啡因粉末(n677)、葡萄籽提取物粉末(n31)与安慰剂(placebo，硅石)处理的受试者的bdnf血液水平的描述图表。数据表示实施(t0)的平均百分比差异。*平均数值为通过学生t-分布检测与安慰剂进行比较显著不同(p<0.05)。

图2是测试未处理组(安慰剂，placebo)、接受50mg绿原酸组、或接受100mg整个咖啡果浓缩物粉末(wcfc，n580)组中受试者的bdnf血液水平的描述图表。与基线(t0)相比，数据表示为平均百分比差异。*平均数值为通过学生t-分布检测与安慰剂进行比较显著不同(p<0.05)。

图3是安慰剂(placebo)/sic>2、生咖啡豆提取物、绿原酸、禁食、葡萄籽提取物、生豆咖啡因、和整个咖啡果浓缩物粉末(wcfc，n580，“neurofactor”)的对血液bdnf水平的效果的比较图表。

图4是安慰剂、煮咖啡、和整个咖啡果浓缩物粉末(wcfc，n580)对bdnf的效果的描述图表。

图5a和5b是比较实施100mgn580(5a)60min后人类渊源者中的血清和外来体的bdnf水平，以及计算血清和外来体bdnf的增加的试验结果的描述图表。

具体实施方式

根据本申请发明人的早期发现，即整个咖啡果提取物能有效地显著提高血液bdnf水平到一个在此之前未知的程度，本申请发明人进一步测试各种富含多酚的天然产品，以调查是否单剂量可能导致bdnf血浆水平的增加。在其它的产品中，选择了三种含有不同量咖啡因的天然产品：从生咖啡豆中获得的生咖啡的咖啡因(指定为n677)、生咖啡豆提取物(指定为n625)、以及牌整个咖啡果浓缩物(指定为n580)。对含有高含量多酚类物质但非咖啡因的葡萄籽提取物(指定为n31)(全部购自vdffutureceuticals,inc.2692n.stateroute117-momence,il60954,usa)和煮咖啡进行了测试，以确定咖啡因和焙烧的可能效果。

值得注意的是，n580增加的哺乳动物中bdnf血浆水平为基线以上平均137％的量，如下列更多细节所示。生咖啡豆的咖啡因提取物n677显示为基线以上42％的增加，但是这增加不具有统计学显著性。生咖啡豆提取物n625和煮咖啡没有造成bdnf的一个显著的增加，而葡萄籽提取物n31可以增加相对于基线30％的血浆中bdnf水平，尽管不是显著(p值＝0.65)，也如进一步详细的下文所示。因此，可以预期的是，n580对bdnf血液水平的刺激效果不与每剂量多元酚或咖啡因的量相关联。此外，基于n580的组成分析，本发明人推测(不希望受任何理论或概念的约束)，该可能的刺激作用可能是由于原花青素。

在又进一步的意想不到的效果中，本申请发明人发现bdnf增加的显著馏分可以归因于血液的外来体级分。作为外来体必须穿越血脑屏障(例如，moleculartherapyvol.19no.10,1769-1779oct.2011；nanomedicine,vol.7,no.8,2012,pp.1225-1233；therapeuticdelivery,vol.2,no.9,2011,pp.1095-1099；advanceddrugdeliveryreviews,vol.65,no.3,2012,pp.342-347；journalofcontrolledrelease,vol.161,no.2,2012,pp.635-644)，bdnf向大脑的递送和/或增加是特别预期的。

预期组合物

在本发明主题的优选方面中，本发明人设想的bdnf激活组合物将包括营养学上可接受的天然产物，其包括整个咖啡果(包括果肉、果壳、外壳和/或粘液)制剂和/或富含原花青素(优选为具有浓度至少为5μg/克的总原花青素)的制剂，其量能有效地提高在口服给药后的哺乳动物体内的血液bdnf(尤其是与血液中的外来体分数相关联的bdnf)。

因此，如本文使用的，术语“bdnf激活组合物”是指一种组合物，能够增加血液bdnf(尤其是与血液中的外来体分数相关联的bdnf)至高于上述生理正常值(即，与安慰剂/没有施用bdnf激活组合物的禁食相比)的bdnf刺激上述的至少120％的量的组合物)以统计学显著方式，典型地在基准以上至少50％的量，更典型地为基线以上至少100％的量，并且最典型地为基线以上至少120％的量。如本文所用，术语“bdnf相关联的外来体”、“与外来体相关的bdnf”、“与外来体级分相关联的bdnf(或外来体级分)”和“外来体bdnf”在本文可互换使用并且是指可从外来体中分离和/或定量的bdnf。

特别优选的组合物将被配制成营养补充剂以液体或固体形式，包含bdnf激活组合物，并且还可任选包括营养学上可接受的载体。例如，在营养补充剂为固体形式时，所述组合物可以配制成小吃、锭剂、片剂、或胶囊剂，或者可以涂覆到谷物产品，或包括在焙烤产品中。另一方面，这里的营养补充剂是液体形式时，组合物可以配制成碳酸饮料、冲泡饮料(例如，作为咖啡或茶)、果汁、能量饮料、运动饮料、或调味的水。bdnf激活组合物也可以被配置以用于药物组合物中，典型地与药学上可接受的载体一起用于组合物中，其中bdnf激活组合物存在的量，能够增加bdnf以治疗或预防的有效量为准。而营养和药物组合物供人使用是特别期望的，但是应该理解的是，bdnf激活组合物和制剂也可以用于兽医用途(例如，在动物饲料中使用，为国内伴侣动物('宠物')，或在动物饲料的农场动物。在进一步考虑的方面中，bdnf激活组合物也可提供为散装产品(例如，在数量等于或大于一百克，等于或大于一千克，或等于或大于10千克)，用于营养或药物产品的生产中。

根据特定的制剂，预期组合物每份供应量将包含至少5mg，更典型地为至少50mg，和最典型地至少100mg的bdnf激活组合物。因此，从另一个角度看，并根据特定类型的最终产品(例如，能源或调味饮料，或强化固体食物产品，或胶囊/片)，bdnf激活组合物可以存在于制剂中的浓度在之间，或0.01wt％至0.1wt％之间，或介于0.1wt％至1.0wt％之间，或1.0wt％至10wt％之间，或介于同样地，该组合物包括原花青素富集的天然产物，所述原花青素将以至少5μg/克，更通常至少20μg/克，和最典型地至少50μg/克的量存在于每次供应中。因此，原花青素可以存在于所述制剂以0.0001wt％-0.01wt％之间的浓度，或0.01wt％至0.1wt％之间，或介于0.1wt％至1.0wt％之间，或1.0wt％至10wt％之间，或10wt％至99wt％之间。

相对于合适的剂量可以预期的是，包括整个咖啡果粉和/或提取物(或整个咖啡果某些部分的粉末或提取物，特别是果肉、果壳、外壳和/或粘液)的组合物将是急性增加地有效的在口服给药中，如下面更详细描述所述，其中，所述急性有效是在约30分钟到3小时的时间跨度内观察。对于整个咖啡果粉和/或提取物(或其部分的粉末或提取物)的合适剂量通常为10mg至500mg之间，甚至更高。因此，合适的剂量以达到可观察到的效果将是10-50mg之间，50-150mg之间，150-500mg之间，500-1000mg之间，甚至更高。最通常地，这样的剂量在一个单一的事件中给出(例如，通过胶囊、饮料的消耗等)，但应该注意的是所述剂量也可被两个或两个以上给药给予。类似地，预期的组合物包含原花青素，急性效果也也在约30分钟到3小时的时间跨度内观察。对于原花青素的合适剂量通常为0.10μg至500μg之间，甚至更高。因此，合适的剂量以达到可观察到的效果将是0.01-1.0μg之间，1-100μg之间，100-1000μg之间，1-50mg之间，甚至更高。

从另一个角度看，合适的产品将被配制以产生bdnf激活组合物，将增加血液bdnf至以统计学显著方式高于正常情况，在基准以上至少50％的量，更典型量为基线以上至少100％的量，最通常为基准以上至少150％的的量和/或所考虑的组合物增加的bdnf，使得增加的bdnf为至少30％，更典型地至少50％，最典型的至少70％，可归因于哺乳动物血液中的外来体级分。

对于特别优选的bdnf激活组合物，应当注意，整个咖啡果或部分的所有制剂都被认为适用于本发明，其中，咖啡果的一部分是果肉、果壳、外壳和/或粘液。如将在下面更详细示出的，应该注意的是咖啡豆的烤或未经焙烧的形式(和其提取物)不会出现有统计学显著的bdnf激活作用。因此，制剂和咖啡果的部分的提取物是特别预期的。尽管不限制本发明的主题，它是进一步优选的是，咖啡果(或其一部分)具有低的真菌毒素含量，其小于20ppb的总黄曲霉毒素，小于10ppb的总赭曲霉毒素，且小于5ppm的总伏马菌素。示例性的组合物和提取物和这种组合物和提取物的方法公开于共同拥有的us7815959，us8597710，us8603564，us7754263，us8603563和us7807205中，所有这些都通过引用并入本文。

因此，应该理解的是，bdnf激活组合物可以是干燥的整个咖啡果实(或其部分如上述定义)的粉末，一个干燥的整个咖啡果实(或其部分如上述定义)的提取物，其中该提取物可以是水性提取物，醇提取物(或其组合)，或超临界二氧化碳提取物，其中所述提取物可任选地进一步处理(例如，通过至少部分地去除溶剂，或一个色谱步骤)。类似地，应当理解的是，bdnf激活组合物可以是富含原花青素的组合物和由植物材料制备，或者可来自合成或其它分离的原花青素配合的组合物。因此，组合物富含原花青素，尤其包括葡萄籽提取物，各种浆果，水果，或坚果提取物(例如，来自蓝莓，红莓，呛浆果，苹果，李子，高粱，榛子，山核桃，可可等)，以及肉桂。

预期用途

由于bdnf的显着的和显著增加，特别是外来体相关的bdnf，发明人考虑的是，本文提出的组合物和方法将是有效地调节哺乳动物体内外来体bdnf水平，尤其是在人类中。因此，在本发明主题的特别优选方面中，bdnf调制被设想用于正常化或急性增加哺乳动物体内病理性的低bdnf，或在哺乳动物中升高bdnf的程度足以减轻的相关病症，其至少一种症状临床上为低bdnf水平。此外，应当注意，考虑的方法和组合物也被认为用于提高涉及bdnf作为成分的条件和机制。

因此，发明人考虑利用整个咖啡果或其部分的制剂(例如，提取物或粉末)来增加血液中的bdnf，特别是增加血液中的外来体bdnf。从不同的角度来看，本发明人考虑使用整个咖啡果实或其部分的制剂(例如，提取物或粉末)来增加哺乳动物的外来体bdnf。因此，使用整个咖啡果或其部分的制剂(例如，提取物或粉末)用于跨越血脑屏障增加bdnf的递送，考虑是经由外来体bdnf。

例如，已经报道了bdnf的低水平往往与肥胖，糖尿病，抑郁症，心血管疾病，认知障碍，阿耳茨海默氏病，纤维肌痛，帕金森氏病，或痴呆病症相关。同样地，可以认为动物体内bdnf的缺乏会导致认知和/或行为障碍。因此，bdnf在哺乳动物中释放或产生的激活被认为可以治疗肥胖症，糖尿病，抑郁症，心血管疾病，认知功能障碍、和/或阿尔茨海默氏病中的至少一种症状，并且还认为用于改善在动物(例如，宠物，农场动物等)中的认知和/或行为模式。从又一角度看，设想的方法和组合物也可改善学习，记忆，警觉性，情绪，体重控制和/或能量代谢。

从不同的角度，过程依赖于(至少在一定程度)一定水平的内源性bdnf、使用考虑的组合物对bdnf的正常或临床低水平的调制的情况，可以是能够影响神经变性健康状况、睡眠、放松、情绪、运动后再生、压力管理、食欲和疼痛的状态或进展的有效的方式。

在更进一步设想的方法和用途中，但应注意的是，bdnf水平也可在组织中被升高除了神经组织外，通过使用考虑的组合物，而且考虑的组合物可因此用于增加在固体组织，尤其是皮肤和肌肉中的bdnf水平。因此设想的组合物和方法的应用可以包括局部施用，注射，下闭塞应用等。其它化合物和组合物可与本文中所呈现的组合物结合，以得到对与bdnf相关的症状中的至少一个症状附加的或者甚至协同的效果。

考虑的组合物也可用于再生目的，尤其是在外周神经病或皮肤的内向外的恢复活力的情况下，通过外周神经活性和存活力的调制和/或再生。当然，这样的(和所有其它活动)效果可以是预防性的或出示症状时。

实验数据

咖啡材料的调查研究

测试的所有材料均为市售并由futureceuticals,inc.,momence,ilusa提供：n625是一款生咖啡豆提取粉，n677是一款生咖啡豆咖啡因粉，n580是一种粉状整个咖啡果提取物(整个咖啡果的含水乙醇提取物)和n31是葡萄籽提取物的粉末。dulbecco磷酸盐缓冲盐水(pbs)和水是从sigmachem.co.(st.louis,mo,usa)购买。蛋白质低结合微管从eppendorf(hauppauge,ny,usa)购买，和rcdc蛋白测定试剂盒ii从bio-rad(paloalto,ca,usa)购得。人类bdnfquantikineelisa试剂盒来自r&dsystems(minneapolis,mnusa)(madison,wi,usa)。(麦迪逊，威斯康星州，美国)。肝素血液收集管从ramscientificinc.(yonkers,ny)获得，采血针从(ozorkow,poland)购买。二氧化硅氧化物用作安慰剂自sigmachemicalcompany(minneapolis,mn)购得。

所有研究受试者一般健康，并且研究开始前为期15天没有使用任何类型的药物或补充剂。纳入标准需要参与者为18和55岁之间，并具有18.5和24.9公斤/平方米之间的身体质量指数。在研究期间，参与者无鼻炎，感冒，上呼吸道感染等症状。参与者被排除在外，如果他们有糖尿病，已知对任何测试成分或使用的任何抗炎药，镇痛药，抗过敏，抗抑郁药物或多种维生素过敏。所有参与者都能够满足研究前签署知情同意书的标准。

在该组实验中，25例患者随机分成五组，以接收五个处理之一：n580(含咖啡因)，n677(含咖啡因)，n625(含咖啡因)，n31(不含咖啡因)，或安慰剂(二氧化硅氧化物)。在相同的实验条件下进行后续的研究，5名参加者获得n580，绿原酸，或安慰剂(无处理)下面进一步详细说明。所有健康受试者在治疗前禁食12小时。在任何情况下，100mg选择的提取物被施用。除了消耗研究材料或安慰剂之一，在研究期间患者经口没有摄入。血液在基线(to)被收集，随后样本在处理之后每30分钟(t30，t60，t90和t120)被收集。

对于血浆的分离，100μl手指收集血液通过手指穿刺并放置在安全毛细管血液收集管(ramscientificinc.yonkers,ny)中并在1000×g下进行离心10分钟。血液被转移到蛋白质低结合微管并保持在-80℃直到使用。在基线(to)收集血液和随后在处理之后每30分钟(t30，t60，t90和t120)收集样本。bdnf水平与参考标准曲线进行比较，且每个受试者进行标准化于to时测量的自身质量。每位患者的等离子体bdnf的峰值水平被用于比较。结果合并，并平均值的标准误差被用于每个单独的分析。采用独立学生检验对血浆bdnf水平的处理影响进行分析。

按照制造商提供的说明，用固相酶联免疫吸附测定法(明尼苏达州明尼阿波利斯，美国r&d系统)对bdnf进行定量，使用的缓冲液和校准特异于等离子体。最终反应使用分光光度计(分子装置，桑尼维尔，加州，美国)在450nm和540nm波长下测量和最终浓度从标准曲线中计算出。

在第一组实验中，四富含多酚的水果提取物在健康受试者中进行了测试。三种提取物含有咖啡因以不同的量(n580：0.7％咖啡因；n677：72.8％咖啡因；和n625：2％咖啡因)和一个提取物不含咖啡因的(n31)，列于下表1中。如图1所知，可测试n580的物质在患者中增加的bdnf血浆水平平均为267％，相对于基线(范围165％至322％；p＝0.006与安慰剂)。生咖啡的咖啡因提取物(n677)，按年升幅为42％，但无统计学显著性(p＝0.49)。生咖啡豆提取物(n625)没有引起bdnf的一个显著增加。葡萄籽提取物(n31)升高在血浆中bdnf水平30％，相对于基线，虽然没有显著(p值＝0.65)。

出乎意料的是，与使用安慰剂(二氧化硅)治疗导致bdnf的血液水平34％的减少(p＝0.09)。由于这些结果(即n580后显著增加bdnf的血液水平，二氧化硅作为安慰剂的减少)，进行了第二组实验，以验证n580对bdnf和测试延长禁食的效果(未治疗的对照)对bdnf的血液基线水平的影响的再现性。

符合同样的纳入标准的五个附加健康受试者分别用100mgn580。与以前一样，所有的组在测试前禁食12小时，而对照组没有接受二氧化硅氧化物作为安慰剂。100mgn580治疗的受试者增加bdnf血浆水平(增加148％；p＝0.002)。然而，扩展单独禁食并没有表现出统计学显著增加(14％)。二氧化硅氧化物被选定为安慰剂，因为它通常被认为是惰性材料。而在这项研究中，bdnf的降低无统计学显著，这是唯一的试验条件，即导致较低的平均bdnf水平。

汇集来自两个研究的所有十个组，n580的100mg治疗引起bdnf血浆水平增加了143％。先前已观察到的咖啡因对bdnf的激活作用。与含咖啡因的提取物单剂量治疗导致血浆bdnf的水平增加，然而，在一个与咖啡因浓度无关的方式。如表1所示下面进一步，n677是主要包含咖啡因(重量比72.8％)的，但只造成适度增加血浆bdnf水平。最深刻的增加血浆bdnf与n580观察治疗后，虽然n580提取物只有0.7％的咖啡因(重量)。

在此研究中使用的葡萄籽提取物具有相对高的多酚水平相比咖啡果、0咖啡的咖啡因和咖啡果提取物，但是未能显著增加血液中的bdnf。这一结果表明，n580对bdnf的血液水平的激活效果不与多元酚的量或咖啡因每剂量相关联。相反，效果可能与原花青素的任意量，或与n580材料的独特的咖啡多酚有关。根据所使用的提取物的化学分析，比较n31，n625和n677(表1)，n580示出了一个显著的原花青素量，表明原花青素富集的整个咖啡果提取物(以及可能的其它原花青素富含提取物)的急性治疗，可能会增加bdnf在人受试者的血液水平。葫芦巴碱的量也各不相同的各材料进行测试(表1)。作为呈现，n580和n625含有最高量的该化合物，但是，相同的实验条件下，n580对血浆bdnf作用的效果优于n625，这表明这是不负责增加bdnf水平在血液中的主剂。

因为n580含有大量绿原酸，有人推测这特定多酚酸可以导致bdnf血液水平的增加。因此，绿原酸50mg的给药作为单剂量到五个健康受试者。值得注意的是，绿原酸并没有增加bdnf血液水平以统计学显著方式(p值＝0.89)，表明该物质是不负责n580的增加的bdnf的能力。

脑源性神经营养因子(bdnf)是生长因子的神经营养蛋白家族参与cns的开发，维护和功能中的一员。在大范围的组织已发现，它可以是自我调控的。最近的研究已经提出了咖啡因作为维持bdnf的健康水平的潜在候选，因为它是最常见的在世界各地的一个消费精神兴奋剂，并且能够积极影响认知。该化合物经测试有不同浓度的咖啡因和茶多酚(表1)。虽然结果显示每个试验化合物，而不是咖啡因的绝对值物质内咖啡因的比例，结果仍表明原花青素可能必须增加血浆bdnf水平，也许比咖啡因本身有更大的程度的能力。

bdnf依赖的端粒酶活性已经显示出促进神经元的存活在显影海马神经元。脑损伤后增加bdnf表达和端粒酶活性表明，端粒酶可能在bdnf主导神经保护作用。此外，bdnf已显示上调在脊髓运动神经元的端粒酶的表达和活性。这些神经元，用bdnf处理，对兴奋毒性损害更耐受，大概是由于增加细胞的抗凋亡。发明者因此还设想n580还可发挥通过端粒酶的抗凋亡作用来增加的bdnf活性。

所有材料进行测试，n580被确定为增加bdnf的血浆水平的有效实体，在短周期时间(处理后一到两个小时)。然而，长期影响也考虑，以及在整个长时间的多剂量，以使急性延伸到更长期的效果。图3描绘了测试结果，其中“neurofactor”是n580。由于是显而易见的，n580对bdnf水平在所有测试的控制物质深刻和统计显著的效果。

图4描述了比较n580和煮咖啡的bdnf激活的进一步结果。如图可以看到，煮咖啡曾在测试系统上的bdnf没有显著效果。血浆bdnf水平在基线(to)，治疗后60(t60)，120(t120)分钟被测定。受试者被施用安慰剂(第1天)，100mgwcfc(2天)和300毫升的稀释咖啡(第3天)。相比基线数据表示为平均百分比差异。*与安慰剂(p值＝0.007)和咖啡(p值＝0.02)，在t60的相比平均数wcfc治疗的值为显著不同。当相比于安慰剂(p值＝0.11)结果没有在t120显著，然而，他们相比，咖啡(p值＝0.04)是显著的。

bdnf起源的研究

在进一步的一系列实验中，与一种或多种特定血液部分增加bdnf的关系进行了调查。为了评估是否bdnf与血液中的外来体部分相联结，外来体使用市售外来体分离试剂盒从sbi公司根据由生产商提供的说明书进行分离血清。将如此收集的外来体在磷酸盐缓冲液中悬浮，进行bdnfelisa(r&d系统)，并作为100mgn580给药前测量，以先证者和给药后(60分钟)的原始数据的测试结果显示在图5a。这里，显而易见的是bdnf在血清中的增加是急性和显著。当增加其标准化为本地化，bdnf的外来体的增加更加明显如图5b。

值得注意的是，虽然所考虑的化合物的施用导致血清bdnf的整体增加，外来体相关联的bdnf的增加甚至更加显著。因此，应该理解的是，考虑的组合物和方法能在血液中增加外来体的血清bdf的至少2倍，更典型地至少3倍，并且最典型地为至少4倍以上的增加。这样的急剧增加是完全出乎意料，并认为显著帮助解决bdnf的递送通过穿越血脑屏障外体输送的bdnf的脑(和其它神经组织)。因此，应该指出的是考虑的组合物和方法适于靶向脑和其他神经组织的bdnf水平的增加，尽管这样的组织被通过血脑屏障保护。

但是应当理解的是，考虑的组合物和方法显著促进内源性血液bdnf水平，而这一增加的主要部分(即至少50％，更典型地至少70％，最通常至少85％)与外来体部分相关联。其结果是，由于外来体是已知的通过血脑屏障，但是应该理解的是，考虑的组合物和方法将是有用的，以增加内源性bdnf在脑循环，它具有以最好的发明人的知识没有报道或在本领域中建议的。

化合物分析

绿原酸类，原花青素，黄酮醇和市售n580整个咖啡果实提取物的黄酮醇，n625绿咖啡豆提取物，和n31葡萄籽提取物进行了表征通过lc-ms(n)和通过uv吸收进行定量。总多酚含量用分光光度法根据福林-乔卡梯奥法测定，并进行了标定针对没食子酸标准(sigma-aldrich公司，圣路易斯，密苏里州)。结果表示为克没食子酸当量。

咖啡因和葫芦巴内容物通过hplc的agilent1100(agilent技术，帕洛阿尔托，ca)，配备有二极管阵列检测器和通过uv吸光度定量。咖啡果提取物，咖啡豆提取物及葡萄籽提取物的抗氧化能力的特点，以清除过氧自由基(orac)，羟基自由基(horac)，过氧化亚硝酸盐(norac)，超氧阴离子(sorac)和单线态氧的能力(soac)。每个测试提取物的化学组成和多酚剖面显示在下面的表1：

表1

其中，wcfc为整个咖啡果浓缩物粉末；n677为生咖啡豆的咖啡因粉末；n625为生咖啡豆提取物粉末；n31为葡萄籽提取物粉末；nd为未检测；orac为氧自由基吸收能力；te为水溶性维生素e当量；horac为羟基氧自由基吸收能力；sorac为超氧阴离子自由基吸收能力；norac为过氧亚硝基自由基吸收能力；sorc为单自由基吸收能力。

因此，具体实施方案和bdnf表达活化的方法的应用已被公开。应当显而易见，然而，对本领域技术人员，除了那些已经描述的有更多的修改是可能的，而不脱离本文的发明概念的出发。本发明的主题，因此，不被限制，除非在所附权利要求的保护范围内。