包含腺病毒的医药配制品及其保存方法与流程

1.本技术涉及生物医药技术领域，具体涉及一种包含腺病毒的医药配制品及其保存方法。


背景技术：

2.疫苗是将病原微生物(如细菌、立克次氏体、病毒等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用转基因等方法制成的用于预防或治疗传染病的自动免疫制剂，是生物制剂中的最为常见的一类。疫苗的常见给药途径主要为口服和注射，由于疫苗的分子活性要求，目前的疫苗研究主要集中在注射剂中，常见的疫苗注射剂为小水针剂或冻干粉针剂两种，冻干制剂因其高稳定性已成为生物制品的基本剂型，但是其工艺复杂，周期较长且成本较高，而液体制剂虽然研发较难但工艺简单，周期较短，避免了冻干滴度损失且成本较低。
3.腺病毒载体是目前最有应用前景的病毒载体之一，被广泛应用于包括疫苗研发、基因治疗和溶瘤治疗的各种临床前和临床研究。腺病毒的生物活性取决于由二十面体外壳结构包围的核苷酸的至少一个核心序列的构象的完整性，该二十面体外壳结构由衣壳蛋白组成。不同于传统有机和无机药物，腺病毒粒子非常容易降解，稳定性差。因此，为了确保合理的保质期，腺病毒制剂的良好配制品是至关重要的。腺病毒的研究还聚焦于旨在施用于人的腺病毒制剂。这种腺病毒制剂不仅应该安全、无菌且为良好生产规范(gmp)等级的，这些制剂还应表现出和促进腺病毒的长期稳定性，最大限度地减少制造、包装和储存过程中腺病毒效价的损失。该制剂还应进一步防止腺病毒吸附至包装和储存腺病毒的容器表面以及制造过程中使用的机械表面。虽然目前在腺病毒制剂的设计上已投入了大量的研究，但仍然对改进的腺病毒制剂有需求。


技术实现要素：

4.本技术提供一种包含腺病毒的医药配制品，可以实现腺病毒制剂的长期储存，最大限度地减少腺病毒效价的损失，并且有利地防止可见颗粒的形成，防止腺病毒吸附至包装和储存容器表面以及制造过程中使用的机械表面。
5.本技术提供一种医药配制品，以所述医药配制品的总体积计，包括：
6.(a)重组腺病毒；
7.(b)枸橼酸盐缓冲液5mm至400mm；
8.(c)非离子表面活性剂(v/v)0.01％至1％；以及
9.(d)保护剂(w/v)4％至15％；
10.其中，所述保护剂为c原子数≤24的糖类化合物或c原子数≤24的糖醇中的一种或多种的组合；
11.所述医药配制品的ph值为5.0至7.0。
12.在本技术的一些实施方案中，所述医药配制品为液体制剂。
13.在本技术的一些实施方案中，所述医药配制品还包括nacl，所述nacl的浓度(w/v)
≤35％，例如所述nacl的浓度(w/v)为0。
14.在本技术的一些实施方案中，所述枸橼酸盐缓冲液的浓度为10mm至140mm，例如20 mm至75mm，再例如40mm至80mm、30mm至100mm，或者优选20mm至60mm。
15.在本技术的一些实施方案中，所述医药配制品的ph值为5.5至6.8，例如所述医药配制品的ph值为5.8至6.7、6.0至6.8或者6.2至6.7的任一范围内；又例如ph值为5.8至6.0、6.0至6.2、 6.5至6.7或6.4至6.6的任一范围内。
16.在本技术的一些实施方案中，所述非离子表面活性剂为聚山梨酯，例如聚山梨酯80(吐温80，ps80)。
17.在本技术的一些实施方案中，所述医药配制品中，所述非离子表面活性剂的浓度(v/v) 为0.05％至0.5％，例如0.08％至0.2％，优选0.1％。
18.在本技术的一些实施方案中，所述糖类化合物为蔗糖、海藻糖或乳糖中的一种或多种。
19.在本技术的一些实施方案中，所述医药配制品中，所述保护剂浓度(w/v)为4.2％至10％，例如4.4％至7.5％、4.4％至7.2％或4.8％至7.5％。
20.在本技术的一些实施方案中，所述医药配制品进一步包括甘氨酸和/或甘露醇。
21.在本技术的一些实施方案中，所述医药配制品中，所述甘氨酸的浓度(w/v)为0.2％至5％，例如为0.5％至1％；所述甘露醇的浓度(w/v)为0.2％至5％，例如为0.5％至1％。
22.在本技术的一些实施方案中，所述医药配制品包括滴度范围为7.0lgifu/ml至12.0 lgifu/ml之间重组腺病毒；例如，滴度范围为7.0lgifu/ml至11.0lgifu/ml，或者滴度范围为8.0lgifu/ml至11.0lgifu/ml，或者滴度范围为8.0lgifu/ml至10.0lgifu/ml。
23.本发明所述重组腺病毒中，腺病毒载体源自人腺病毒或非人猿猴腺病毒。在一个实施方案中，本发明的腺病毒载体源自人腺病毒例如ad1、ad2、ad4、ad5、ad6、ad11、ad 24、ad34或ad35，特别是ad5、ad11或ad35。
24.在本技术的一些实施方案中，所述重组腺病毒包括来自于非人猿猴腺病毒的腺病毒载体，例如黑猩猩腺病毒载体或大猩猩腺病毒载体。
25.在本技术的一些实施方案中，所述腺病毒载体为黑猩猩腺病毒载体，例如adc68、chad3、chad63、chad83、chad155、pan 5、pan 6、pan 7或pan 9。所述腺病毒载体还可以源自从矮黑猩猩分离的非人猿猴腺病毒，诸如panad1、panad2或panad3。
26.在本技术的一些实施方案中，所述重组腺病毒包括异源核酸分子。
27.在本技术的一些实施方案中，所述重组腺病毒包括如下异源核酸分子中的至少一种：
28.(a)编码sars-cov-2的pres蛋白的核酸分子；或
29.(b)编码sars-cov-2病毒的全长s蛋白的核酸分子。
30.在具体实施方案中，所述pres蛋白的氨基酸序列包括如seq id no.1所示的氨基酸序列，所述编码sars-cov-2的pres蛋白的核酸分子包括如seq id no.2所示的核苷酸序列；
31.在具体实施方案中，所述全长s蛋白的氨基酸序列包括如seq id no.3所示的氨基酸序列，编码sars-cov-2病毒的全长s蛋白的核酸分子包括如seq id no.4所示的核苷酸序
列。
32.在本技术的其他实施方案中，所述重组腺病毒包括的异源核酸分子可以是rsv抗原蛋白的编码基因、vzv抗原蛋白的编码基因、gfp蛋白的编码基因或ie63蛋白的编码基因。
33.在本技术的一些实施方案中，所述医药配制品为鼻喷给药制剂、滴鼻给药制剂、气溶胶吸入式给药制剂、肌肉注射制剂、皮下注射制剂、或口服给药制剂。
34.在本技术的一些实施方案中，所述医药配制品由如下成分组成：重组腺病毒、枸橼酸盐缓冲液5mm至400mm、非离子表面活性剂0.01％至1％(v/v)和保护剂4％至15％(w/v)。
35.在本技术的一些实施方案中，所述医药配制品由所述重组腺病毒、所述枸橼酸盐缓冲液5mm至400mm、所述非离子表面活性剂0.01％至1％(v/v)、所述保护剂4％至15％(w/v)、甘氨酸0.2％至5％(w/v)和甘露醇0.2％至5％(w/v)组成。在具体实施例中，各组分含量可如上文中进一步优选。
36.本技术进一步提供一种医用配制品，以所述医药配制品的总体积计，包括：腺病毒、枸橼酸盐缓冲液20mm至60mm、蔗糖或海藻糖4.4％至7.2％(w/v)、甘氨酸1％(w/v)、甘露醇 1％(w/v)和吐温80 0.1％(v/v)，所述医用配制品的ph为5.8至6.7。
37.相应的，本技术还提供一种包含腺病毒的医药配制品的保存方法，包括：将如上所述的医药配制品存储在-60℃至37℃的温度下。
38.在一个实施方案中，所述医药配制品存储在0℃至25℃的温度下。在另一实施方案中，所述医药配制品存储在2℃至8℃。在另一实施方案中，所述医药配制品存储在-20℃至-60℃之间。
39.有益效果：
40.本发明提供的含腺病毒的医药配制品采用枸橼酸盐缓冲液体系，结合低分子量糖或糖醇作为保护剂，实现了制剂的稳定性。本发明的含腺病毒的医药配制品可制备为稳定的液体制剂，渗透压在合理范围内，满足注射需求，并且具有良好的存储稳定性，在0至37℃的温度条件下可以保持良好的病毒感染率，病毒颗粒粒径保持均匀稳定，无降解或明显聚集，有效避免了病毒滴度损失，能够满足制品储存、运输要求，能大大降低成本，并且实现了腺病毒药物液体制剂的稳定性和药用性能的平衡突破。此外，本发明提供的腺病毒制剂ph值接近中性，配方用料安全无毒，有效降低了施用对象机体不良反应的概率。
附图说明
41.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
42.图1是实验例2中b1至b16组腺病毒制剂样品在37℃放置28天后的粒径分布(dls)图；其中横坐标组别中的数字1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16分别对应样品组别b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7、b8、b9、b10、b11、b12、b13、b14、 b15和b16；
43.图2是实验例3中c1至c8组腺病毒制剂样品在37℃和42℃热加速稳定性实验的粒径分布(dls)图；
44.图3是实验例4中d3和d4组腺病毒制剂样品冻融1至5次的病毒滴度检测结果；
45.图4是实验例4中d3和d4组腺病毒制剂样品冻融1至5次的病毒颗粒数检测结果；
46.图5是实验例4中d3和d4组腺病毒制剂样品冻融1至5次的病毒感染活性(vp/ifu比
活) 检测结果；
47.图6是实验例4中d3和d4组腺病毒制剂样品冻融1至5次的病毒颗粒粒径分布。
具体实施方案
48.下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
49.本技术实施例提供一种包括腺病毒的医药配制品。以下分别进行详细说明。需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。本发明的各种实施例可以以一个范围的形式存在；应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所述范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。
50.本发明的医药配制品中含有的腺病毒为重组腺病毒。在一些实施方式中，所述医药配制品包含至少一种重组腺病毒。所述重组腺病毒中腺病毒载体的构建是本领域根据现有技术已经充分理解的，并且涉及使用标准的分子生物学技术。该腺病毒载体在腺病毒基因组的e1区域(例如，e1a区域和/或e1b区域)的至少一个必需基因功能中可以是有缺陷的，该e1 区域对该病毒复制是必需的。在本发明的一些实施方案中，所述腺病毒载体的构建包括：构建e1区缺失的复制缺陷型腺病毒载体，例如采用低熔点胶直接连接法构建了e1区缺失的复制缺陷型腺病毒分子克隆，在hek293细胞中包装出有感染性的病毒颗粒。在一些实施方案中，本发明的腺病毒载体是来源于非人猿猴腺病毒，例如黑猩猩腺病毒或大猩猩腺病毒。这些腺病毒载体在人群中一般具有低血清阳性率和/或低预先存在的中和抗体滴度。在另一些实施方案中，本发明的腺病毒载体是来源于人腺病毒，例如ad1、ad2、ad4、ad5、ad6、 ad11、ad 24、ad34、ad35中的至少一种，特别是ad5、ad11或ad35。
51.在另一些实施例中，本发明的重组腺病毒进一步包括异源核酸分子。对于本领域技术人员来说，适合的异源核酸分子是熟知的，并且可以包括转基因开放阅读框，例如编码多肽/蛋白质的开放阅读框。本发明对于所述异源核酸分子的种类或序列没有特别的限定，例如出于免疫应答的接种目的制剂时，选用对某些病毒具有免疫应答的核酸分子或其片段，这些对于技术人员来说均是熟知的。在本发明中，可以是任何异源核酸分子或片段，例如，所述异源核酸分子包含rsv抗原蛋白的编码基因、vzv抗原蛋白的编码基因、gfp蛋白的编码基因或ie63蛋白的编码基因，只需要其可以实现制剂的免疫和/或治疗效果即可。在一些实施方案中，所述异源核酸分子是来源于sars-cov-2病毒的核酸分子或其片段；或者是任一种对sars-cov-2病毒具有免疫应答的核酸分子或其片段。作为示例性技术方案，所述异源核酸分子是seq id no.2或者seq id no.4所示的核苷酸序列。然而这些异源核酸分子仅作为示例而不代表任何限制作用，本领域技术人员应当理解，本发明的医药配制品可包括含有任何其他异源核酸分子的重组腺病毒。
52.本发明涉及的包含重组腺病毒的医药配制品进一步涉及相关药用产品，例如基因药物和/或疫苗制剂。在一些实施方案中，所述医药配制品为液体形式的配制品，该液体配制品显示出优良的腺病毒稳定性。这些配制品适合储存在2-8℃，储存在更低的温度下时也可以保持良好的稳定性，例如，-20℃或更低、-40℃或更低、-65℃或更低。它们也可以在高于8℃的温度下稳定储存，例如，25℃、37℃或甚至更高。本发明中，术语“稳定性”是指在配制品中降解腺病毒粒子的相对抗性，在其预期有用性的时间尺度上保留其效力。在本发明中，所述腺病毒稳定性是指含有腺病毒的配制品或制剂在特定条件下的一定时间内，其病毒滴度不下降或者仅下降极小的在本领域可接受的范围内，以实现病毒滴度保持所述制剂有效的药用效果并满足本领域存储、运输需要；例如在37℃、7天加速实验条件或者37℃、14 天加速实验条件下其病毒滴度下降lgtcid
50
/ml≤0.5或下降lgifu/ml≤0.5；再例如在2～8℃存储270天，或者-60℃以下存储1年、1.5年、2年、3年或者5年，其病毒滴度下降水平保持 lgtcid
50
/ml≤0.5或下降lgifu/ml≤0.5。
53.本发明的医药配制品包括枸橼酸(柠檬酸)盐缓冲液、非离子表面活性剂(v/v)0.01％至 1％，以及保护剂，其中所述保护剂为c(碳)原子数≤24的糖类化合物或c原子数≤24的糖醇中的一种或多种的组合。
54.本技术所述“枸橼酸盐缓冲液”也可称为“柠檬酸盐缓冲液”，枸橼酸盐缓冲液是由枸橼酸和/或枸橼酸钠，以及水混合配制而成；枸橼酸盐缓冲液中枸橼酸和/或枸橼酸钠的含量不同会使医药配制品的ph值发生变化，通过调节枸橼酸盐缓冲液中枸橼酸和/或枸橼酸钠的用量以使医药配制品的ph值达到特定值或特定范围是本领域技术人员根据现有技术已经充分理解的。在本技术的一些实施例中，枸橼酸盐缓冲液的浓度可以理解为枸橼酸盐缓冲液中枸橼酸根离子的浓度。
55.本技术所述“保护剂”也可称为“稳定剂”，可以单独或者与其他添加剂联合使用，防止正在被冷冻或低温保存的腺病毒载体的低温损伤，或者保护疫苗抵御高温及极端温度变化(如冻融等不良条件)。在本发明中，所述保护剂优选自c(碳)原子数≤24的糖类化合物或 c原子数≤24的糖醇中的一种或多种的组合。在本发明的一些实施方案中，所述糖类化合物为单糖、二糖或三糖中的一种或多种；在一些实施方案中，所述糖类化合物的c原子数≤12，例如c原子数为12或c原子数为6，所述糖类化合物优选单糖或二糖；在一些实施方案中，所述糖类化合物为蔗糖、海藻糖或乳糖中的一种或多种。在一些实施方案中，所述医药配制品中还可以加入其他糖类化合物或其衍生物作为保护剂，例如羟丙基环糊精、右旋糖酐等。本领域技术人员可以理解，在加入其他糖类化合物或其衍生物时，应当考虑所加入的物质对于人用医药制品安全性的影响。在本发明中，出于人用医药制品安全性的考虑，优选加入蔗糖、海藻糖或乳糖中的一种或多种作为保护剂。在本发明的一些实施方案中，所述医药配制品的总体积计，所述保护剂浓度(w/v)为4％至15％，例如4.2％至10％，再例如4.4％至7.5％。在一些实施方案中，所述c原子数≤24的糖类化合物或c原子数≤24的糖醇的浓度 (w/v)为4.4％至9％，例如4.8％至7.5％或者4.4％至7.2％。在另一些实施方案中，所述保护剂包括浓度(w/v)为4.8％至7.5％的c原子数≤24的糖类化合物或c原子数≤24的糖醇，以及浓度 (w/v)为2.5％至5％的c原子数≥30的糖类化合物。
56.在一些实施方案中，枸橼酸盐缓冲液的摩尔浓度为10mm至140mm，例如20mm至 75mm、20mm至60mm、30mm至100mm、或者40mm至80mm；示例性，所述枸橼酸盐缓冲液的摩尔浓
度为20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm或80mm。
57.在一些实施方案中，所述医药配制品为液体制剂，其ph值为5.0至7.0之间，例如ph值为5.5至6.8、5.8至6.7、6.0至6.8或者6.2至6.7的任一范围内；又例如ph值为5.8至6.0、5.8至 6.2、6.0至6.2、6.5至6.7或6.4至6.6。
58.本发明的医药配制品可以进一步包括甘氨酸和甘露醇，以医药配制品的总体积计，所述甘氨酸的浓度(w/v)为0.2％至5％，例如为0.5％至1％；所述甘露醇的浓度(w/v)为0.2％至5％，例如为0.5％至1％。在一些实施方案中，甘氨酸和甘露醇的浓度分别为1％。甘氨酸和甘露醇的添加已确认是对腺病毒的稳定性有利的。
59.在一些实施方案中，所述医药配制品中不含有nacl或者其他形式的钠盐，或者nacl 或其他形式的钠盐的浓度保持在35％(w/v％)以下，以便实现良好的重组腺病毒稳定性，例如25％(w/v％)及以下，或者10％(w/v％)及以下。在一些实施方案中，所述医药配制品中nacl 的浓度为0。
60.在一些实施方案中，所述医药配制品中，乙醇、edta二钠和甘油的加入是可接受的，但这些成分的加入不会明显改善配制品的性能。
61.在一些实施方案中，所述医药配制品由上述重组腺病毒、枸橼酸盐缓冲液、非离子表面活性剂和c(碳)原子数≤24的糖类化合物或c(碳)原子数≤24的糖醇中的一种或多种组成。
62.在另一些实施方案中，所述医药配制品由上述重组腺病毒、枸橼酸盐缓冲液、非离子表面活性剂、c(碳)原子数≤24的糖类化合物或c(碳)原子数≤24的糖醇中的一种或多种、甘氨酸和甘露醇组成。
63.本发明的“配制品”、“制剂”可互换使用，是指含有具有预防或治疗效果的活性成分及药学上可接受的辅料等成分的组合物。在一些实施方案中，所述具有预防或治疗效果的活性成分是指可以引起施用对象(例如哺乳动物)免疫应答的重组腺病毒，或者可以作为基因治疗的重组腺病毒；在一些实施方案中，所述配制品或制剂经由不同种类的药学上可接受的辅料和工艺制备为各种不同的剂型，例如液体制剂、冻干制剂、片剂、膏剂等；在一些实施方案中，所述配制品或制剂通过鼻喷给药、滴鼻给药、气溶胶吸入式给药、肌肉注射、皮下注射、或口服给药。本发明的医药配制品为处于不同病毒浓度、单一或多价的重组腺病毒提供了稳定性，并且可以向各种哺乳动物施用，落入本发明范围内的合适的哺乳类动物包括但不限于：灵长类、家畜(例如羊、牛、马、猴、猪等)、实验室试验动物(例如兔、鼠等)、宠物(例如猫、狗等)和圈养野生动物(例如狼、狐狸、鹿等)。在一些实施方案中，哺乳动物为试验小鼠。在一些实施方案中，尤其可适用于人类，可以作为疫苗给予，该疫苗可以向之前未感染或无抗体的个体提供预防性和/或治疗效果。
64.如无特殊说明，在本发明中，各成分的浓度均以所配制的医药配制品(制剂)的总体积计，表示各成分在最终配制完成的含腺病毒的液体制剂中的质量/体积百分数(w/v)、体积/ 体积百分数(v/v)、或体积摩尔浓度(mm，mmol/l)。
65.以下结合实施例具体说明本发明，但不代表将本发明限制于以下实施例中。
66.本发明实施例采用的制剂如下表1所示。除非特别说明，本发明所采用的仪器、试剂或材料为市售品或者采用现有技术可制备得到。
67.表1制剂来源及基本信息
法可参照如下步骤进行：参照试剂盒adeno-x rapid titer kit(clontech,632250)的说明，将腺病毒梯度稀释后接种于长成单层的293a细胞上，随后将细胞继续培养。待培养一定时间后，利用可识别腺病毒hexon蛋白的抗体及可识别该抗体的二抗，经抗体结合和染色液染色，使受腺病毒侵染的细胞形成染色斑。通过显微镜观察染色斑并计数。
74.可采用od
260
法计算腺病毒颗粒数：待测样品中加入裂解液,以紫外分光光度计测 260nm吸光度值。根据依公式:腺病毒颗粒/ml＝od值
×
稀释倍数
×
1.1
×
1012，计算腺病毒颗粒数。也可以采用hplc法计算腺病毒颗粒数。
75.实施例1制备重组腺病毒原液
76.1.1构建重组质粒
77.本实施例选择未插入外源基因的pshuttle-cmv质粒作为重组质粒的载体。 pshuttle
‑‑
cmv为穿梭型质粒，其上含有cmv增强子、cmv启动子、t7启动子、嵌合内含子和bgh poly(a)加尾信号，并具有noti和kpni双酶切位点，还具有卡那霉素(kanamycin, kana)抗性。将目的异源核酸分子插入pshuttle-cmv质粒多克隆位点，得到含有目的基因的重组质粒，其中，本实施例中采用的异源核酸分子分别为：编码gfp蛋白(氨基酸序列如 seq id no.5所示)的核酸分子(核苷酸序列如seq id no.6所示)、编码sars-cov-2的pres 蛋白(氨基酸序列如seq id no.1所示)的核酸分子(核苷酸序列如seq id no.2所示)、编码sars-cov-2病毒的全长s蛋白(氨基酸序列如seq id no.3所示)的核酸分子(核苷酸序列如seq id no.4所示)。
78.1.2构建重组腺病毒质粒
79.在本实施例中，选择自行构建的重组质粒和商购的腺病毒载体质粒来构建重组腺病毒质粒。
80.1.3线性化处理重组腺病毒质粒
81.采用限制性内切酶对1.2中获得的重组腺病毒质粒进行酶切，以使所述重组腺病毒质粒线性化。
82.1.4制备重组腺病毒
83.对1.3中酶切后回收的基因片段进行转染操作，本实施例中采用lipofectaminetm2000 试剂盒进行转染操作，并选择hek293细胞作为表达系统。根据lipofectaminetm2000试剂盒的操作说明，将1.3中酶切后回收的基因片段转染于汇合度为60％至70％的hek293 细胞内。
84.在lipofectaminetm2000试剂盒操作说明的“接种细胞”步骤中，用于培养hek293细胞的培养基为mem培养基，并在转染前两小时将mem培养基更换为dmem培养基。转染五小时后，更换培养基为含10％(体积百分比)胎牛血清的dmem培养基。
85.转染隔日，在倒置显微镜下观察细胞病变，直至60％的hek293细胞出现噬斑时收集细胞。将收集的细胞在室温(25℃)与-80℃之间反复冻融三次，然后在1200
×
g的转速下离心五分钟，收集上清液，获得的上清液中包含重组腺病毒，并将上清液分装后置于-80℃超低温冰箱保存备用。鉴定重组腺病毒基因组中的基因为目的基因。
86.1.5重组腺病毒的扩增与纯化
87.扩增1.4步骤所制备得到的重组腺病毒使用阴离子层析方式进行病毒纯化，腺病毒纯化可根据sofiya fedosyuk etal,vaccine 37(2019)所记载的腺病毒纯化步骤进行，
之后将得到重组腺病毒纯化液使用4ff分子筛层析柱进行制剂缓冲液置换及进一步精纯。所得重组腺病毒分别命名为：radc68xy3-gfp、radc68xy3-pres、radc68xy3-s。
88.实施例2重组腺病毒制剂的制备
89.取实施例1制备的腺病毒纯化液，按照不同组别分组添加不同辅料，最终即成对应的液体制剂配方。充分混匀后进行过滤，分装，之后样品放入对应温度的生化培养箱进行加速稳定性考察。
90.实验例1不同缓冲液体系的腺病毒液体制剂制备及稳定性实验
91.按表3所示的配方配制含radc68xy3-gfp腺病毒的制剂，将配制的radc68xy3-gfp 腺病毒制剂样品a1至a14置于37℃生化培养箱(设备编号perd1702020)，在第0、7、14 以及28天分别取样，考察各时间点病毒滴度(lgtcid
50
/ml)变化，采用tcid50法检测实验结果如表4所示。
92.表3实验例1中含radc68xy3-gfp腺病毒的制剂成分
[0093][0094]
备注：
[0095]
1、缓冲液浓度以枸橼酸根离子在所得配制品中的摩尔浓度计；
[0096]
2、w/v表示每100毫升溶剂中加入的溶质的克重；
[0097]
3、医药配制品溶液的ph通过缓冲液中盐和相应酸的比例来调节，例如调节枸橼酸和枸橼酸钠的比例、调整组氨酸和组氨酸钠的比例，本领域技术人员知晓如何调节缓冲液中盐和相应酸的比例以使医药配制品达到特定的ph。
[0098]
分别将包含a1的医药配制品至包含a14的医药配制品进行37℃加速稳定性实验病毒滴度实验，实验结果详见下表4：
[0099]
表4 a1至a14组制剂37℃加速稳定性实验病毒滴度变化(1gtcid
s0
/ml)
[0100]
组别0d37℃7d37℃14d37℃28da17.87.96.85.7a27.87.96.95.6a37.87.86.65.8a47.87.96.95.8a57.887.56.4a67.87.87.96.8a77.87.97.26a87.88.07.36.2a98.46.75.63.6a108.36.54.4《3.6a118.563.8《3.6a128.25.63.9《3.6a138.54.5《3.6《3.6a148.56.84.6《3.6
[0101]
由表4可知，相较于包含组氨酸缓冲体系(histidine)的腺病毒液体制剂、包含磷酸盐缓冲体系(ebss)的腺病毒液体制剂以及包含tris缓冲盐体系的腺病毒液体制剂，包含枸橼酸盐缓冲体系的腺病毒液体制剂对腺病毒的保存效果更佳，即：a1至a8在37℃条件下放置28天病毒滴度的下降值明显小于a10至a14，说明包含枸橼酸盐缓冲体系的腺病毒液体制剂更有利于提高腺病毒的稳定性，可能是枸橼酸具有抑制自由基氧化的作用。
[0102]
实验例2含不同种类辅料的腺病毒液体制剂制备及稳定性实验
[0103]
按表5所示的配方配制含radc68xy3-pres腺病毒(批号：pe20200914)的制剂，将配制的radc68xy3-pres腺病毒制剂样品b1至b16置于37℃生化培养箱(设备编号 perd1702020)，在第0、7、14和28天分别取样，考察各时间点病毒滴度、病毒颗粒数变化、粒径变化以及渗透压。
[0104]
表5实验例2的含radc68xy3-pres腺病毒制剂成分
[0105][0106]
备注：参照表3备注。
[0107]
(1)病毒滴度变化
[0108]
表6显示了采用tcid50法检测b1至b16组制剂样品在37℃条件加速稳定性实验的结果。根据表6的数据可以看出，b1至b16的所有样品在37℃条件下放置14天时病毒滴度(lgtcid
50
/ml)变化均不超过0.6，放置28天时，第b2、b4、b6、b8、b9、b11、b15 和b16组样品病毒滴度(lgtcid
50
/ml)变化均不超过0.7，表明这些组液体制剂均具有较好的稳定性。
[0109]
表6b1至b16组制剂样品37℃加速稳定性实验病毒滴度变化(lgtcid
50
/ml)
[0110][0111]
具体来说，根据表6，b10组制剂样品在第14天和第28天的病毒滴度变化明显大于其他组别的制剂，可见当不加入蔗糖、海藻糖等小分子糖类而仅加入右旋糖酐时，其对腺病毒的保护作用明显下降。对比b4、b5和b6组制剂样品的病毒滴度可以看出，在37℃条件下放置28天，b6组(15％蔗糖)的病毒滴度(lgtcid
50
/ml值)变化最小，其次是b4组(7.5％蔗糖)，b5组(4.8％蔗糖)的病毒滴度下降最多。当蔗糖浓度下降到4.8％(w/v)时，b5组在第 7天、14天以及28天的病毒滴度下降更明显，可见高浓度蔗糖对于本实施例的腺病毒制剂的稳定性有积极作用。
[0112]
在37℃条件下保存28天，b2组(含有1％甘氨酸和1％甘露醇时)病毒滴度(lgtcid
50
/ml 值)下降0.5，b3组(不含甘氨酸和甘露醇时)病毒滴度(lgtcid
50
/ml)下降1.1。b15组(60mm 枸橼酸盐)与b1组(20mm枸橼酸盐)相比，病毒滴度(lgtcid
50
/ml值)下降值分别为0.5和1，表明甘氨酸、甘露醇的加入和高浓度的枸橼酸盐更有利于黑猩猩腺病毒稳定性。
[0113]
b12组含有甘油与b5组不含甘油的配方相比，病毒滴度(lgtcid
50
/ml值)一定程度上下降变缓(分别为0.9和1.6)，表明甘油对腺病毒制剂的稳定性具有一定增强效果。
[0114]
b4组和b8组相比，病毒滴度无明显区别，表面蔗糖和海藻糖对于制剂稳定性增强
效果相当，但从成本考虑，更优选蔗糖。
[0115]
组氨酸、乙醇和edta二钠与不含上述辅料的组别相比，各时间点病毒滴度 (lgtcid
50
/ml)下降值差别很小，表明组氨酸、乙醇和edta二钠在本发明的腺病毒制剂体系中对腺病毒稳定性的增强效果不太明显。在37℃条件下放置28天，不含有氯化钠的b2 组与含氯化钠的b7组相比，病毒滴度(lgtcid
50
/ml)下降值更小，进一步表明低含量或不含氯化钠在发明的腺病毒制剂体系中更有利于腺病毒稳定性。
[0116]
(2)病毒颗粒数
[0117]
采用hplc法检测b1至b16组radc68xy3-pres腺病毒制剂样品的病毒颗粒数，检测结果见表7。同0天相比，b1至b16组样品在37℃条件下放置7天病毒颗粒数变化小于 25％，颗粒数较稳定；大多数组别在第14天和第28天时，病毒颗粒数仍可保持较稳定的状态。
[0118]
表7b1至b16组腺病毒制剂样品病毒颗粒数(10
12
vp/ml，hplc法)检测结果
[0119][0120][0121]
(3)粒径检测
[0122]
采用dls检测黑猩猩腺病毒原液(含不同稳定剂)样品在37℃放置28天后的粒径大小，检测结果见表8。从表8及图1可知，绝大部分样品粒径大小在125至175nm。结果表明，在37℃放置28天后，b1至b16的腺病毒配制品样品中的腺病毒无明显聚集，较为稳定。
[0123]
表8b1至b16腺病毒制剂样品病毒粒径检测结果(dls)
[0124][0125]
(4)渗透压检测
[0126]
对不含腺病毒的空白稳定剂配方进行渗透压检测，结果见表9。从表9中结果可以看出，含有15％蔗糖(b6组)和2.5％(b12组)甘油的配方渗透压超过预定标准。b4和b5两组渗透压适当，并且辅料添加简单，相应的加入radc68xy3-pres腺病毒的制剂样品病毒滴度变化较小。
[0127]
表9b1至b16组空白稳定剂渗透压检测结果
[0128][0129]
根据实验例2可以看出，蔗糖、海藻糖、右旋糖酐或羟丙基环糊精都能一定程度改善腺病毒的稳定性，但右旋糖酐和羟丙基环糊精作为药用辅料的安全性尚有待确认；高浓度的蔗糖以及高浓度的枸橼酸盐缓冲液对腺病毒稳定性的改善效果更佳。甘氨酸、甘露醇和甘油对改善本实验例腺病毒的稳定性有积极效果，但是含有甘油的配方渗透压较高；当 nacl和组氨酸含量低或不含有nacl和组氨酸时，重组腺病毒的稳定性更佳，因此本发明的重组腺病毒制剂中可以不含有nacl。
[0130]
实验例3含不同用量辅料的腺病毒液体制剂制备及稳定性实验
[0131]
按表10所示的配方配制含radc68xy3-pres腺病毒(pe20201026-1-a3)的制剂，将配制的radc68xy3-pres腺病毒制剂样品c1至c7组置于37℃生化培养箱或42℃生化培养箱
(设备编号perd1702020，perd1711056)，在第0、7、14和28天分别取样，考察各时间点病毒滴度、病毒颗粒数变化、粒径变化以及渗透压。
[0132]
表10 c1至c7组radc68xy3-pres腺病毒的制剂样品成分
[0133][0134]
(1)病毒滴度
[0135]
采用icc法检测c1至c7组含radc68xy3-pres腺病毒配制品样品42℃热稳定性加速实验和37℃热稳定性加速实验的结果如表11所示。
[0136]
表11c1至c7组样品37℃/42℃加速稳定性实验病毒滴度变化(icc法,lgifu/ml)
[0137][0138]
根据表11可知，c1至c7组的腺病毒配制品样品为蔗糖、吐温80以及枸橼酸盐缓冲液共同形成的制剂体系，均具有良好的稳定性。并且，c1、c3和c6组均含有含甘氨酸和甘露醇，在42℃放置7天后病毒滴度(lgifu/ml)变化小于0.5，保护效果明显优于与不含有甘氨酸和甘露醇的c2、c4和c7组，表明甘氨酸和甘露醇对radc68xy3-pres腺病毒稳定性有进一步增强效果。
[0139]
(2)病毒颗粒数
[0140]
采用hplc法检测c1至c7组含radc68xy3-pres腺病毒配制品样品的病毒颗粒数，检测结果见表12。
[0141]
表12c1至c7组腺病毒配制品病毒颗粒数(hplc法)
[0142][0143]
根据表12的数据可知，c1至c7组的样品在37℃放置28天后，病毒颗粒数均没有明显下降，说明上述制剂配方稳定性较好。在42℃放置7天后，相较于c1组和c3组，c4 组的病毒数有较大程度下降。病毒颗粒数的检测结果与病毒滴度检测结果基本一致。
[0144]
(3)粒径检测
[0145]
采用dls检测c1至c7组样品在37℃和42℃放置后的粒径大小，检测结果见图2。从图2中可以看出，各组别的粒径分布在两种条件下无明显差别，同a组0天的样品中腺病毒颗粒粒径大小(120至160nm)接近。结果表明，在42℃放置7天或在37℃放置28天后， c1至c7组样品中的腺病毒无明显聚集行为。
[0146]
(4)渗透压检测
[0147]
对含radc68xy3-pres腺病毒的配制品样品c1至c7组进行渗透压检测，结果见表13。
[0148]
表13c1至c7组腺病毒配制品样品渗透压检测结果
[0149]
组别c1c2c3c4c5c6c7原液渗透压(mosmol/kg)659440529321547748552
[0150]
分别比较c1与c2组，c3与c4组，以及c6与c7组，可见添加1％甘氨酸和1％甘露醇渗透压增加120mosmol/kg至200mosmol/kg。比较c1组和c5组，可知枸橼酸盐缓冲液由20mm增加至60mm时，渗透压增加约110mosmol/kg。加速稳定性实验中，c1、c3和 c6组保护效果更好，但是c6组渗透压偏高，c1组稍高于注射剂的渗透压通用标准，因此 c1和c3组是较为优选的注射制剂配方。
[0151]
根据实验例3可以看出，本发明实施例提供的c1至c7组腺病毒制剂配方采用枸橼酸盐缓冲液体系，均可以达到良好的制剂稳定性效果。尤其是c1组配方和c3组配方的 radc68xy3-pres腺病毒样品在37℃和42℃热稳定性加速实验中，14天病毒滴度值lgifu/m 下降小于0.5，28天病毒滴度值lgifu/ml下降小于1，病毒颗粒数和粒径变化小，具有良好的稳定性效果。
[0152]
实验例4不同批次的radc68xy3-pres腺病毒配制品制备及稳定性实验
[0153]
为进一步确认实验例1至实验例3所确定的腺病毒配制品的配方，以内部批次为 pe20201026-1-b3的radc68xy3-pres黑猩猩腺病毒原液按表14配制d1-d5组配制品，置于37℃二氧化碳培养箱，在第0、7、14和28天分别取样，考察各时间点病毒滴度变化、病毒颗粒数
变化、粒径变化，以及原液的渗透压；同时部分样品在-60℃以下和室温分别冻融1至5次，按照冻融次数取样，考察不同冻融次数下病毒滴度变化、病毒颗粒数变化、比活以及粒径变化。
[0154]
表14d1至d5组腺病毒配制品成分
[0155][0156][0157]
(1)加速稳定性
[0158]
采用tcid50法检测d1至d5组radc68xy3-pres腺病毒配制品样品在37℃加速稳定性实验结果见表15。
[0159]
表15d1至d5组腺病毒制剂样品37℃热稳定性实验病毒滴度(lgtcid
50
/ml)
[0160]
组别0d37℃7d37℃14dd17.837.877.63d27.837.737.43d37.937.907.83d47.97.877.83d57.977.777.47
[0161]
由表15可见，d1至d5组在37℃放置14天后病毒滴度变化不大，说明本实验组配方制剂均具有较好的稳定性。其中，d3和d4组样品病毒滴度值(lgtcid
50
/ml)变化小于0.1，d5组14天病毒滴度(lgtcid
50
/ml)下降0.5。d1和d4相比，d2和d3相比，区别仅在于缓冲液用量，进一步证明了浓度较高的缓冲液对于制剂稳定性效果较好。
[0162]
(2)病毒颗粒数
[0163]
采用od
260
法检测d1至d5组样品的病毒颗粒数，检测结果如表16所示，在37℃放置28天后，五组配方的黑猩猩腺病毒颗粒数在4.0e+11vp/ml至6.0e+11vp/ml的范围内。相对于0天的检测结果，颗粒数百分比变化范围为75％至115％。可见，d1-d5组样品在 37℃放置28天颗粒数无明显差别。
[0164]
表16d1至d5组病毒颗粒数(od
260
)
[0165][0166]
(3)粒径检测
[0167]
采用dls检测d1至d5组样品在37℃放置0天、7天、14天和28天的粒径大小，检测结果见表17。从表17可以看出，除d2组外，其他组样品粒径无明显变化，表明病毒颗粒基本无聚集，稳定性较好。
[0168]
表17d1至d5组腺病毒制剂样品粒径(nm)
[0169]
组别0d37℃7d37℃14dd1130.0137.3145.0d2119.8135.31850.0d3123.9124.8124.5d4131.8133.3132.4d5119.3117.1118.3
[0170]
(4)渗透压检测
[0171]
d1至d5组样品的渗透压检测结果如表18所示。各组别样品的渗透压都不超过600 mosmol/kg，均满足本领域注射剂的通用标准。
[0172]
表18d1至d5组腺病毒制剂样品渗透压
[0173]
组别d4d3d5d1d2渗透压(mosmol/kg)587522233510417
[0174]
(5)冻融实验
[0175]
将第d4组及d3组制剂分别从病毒滴度、病毒颗粒数、比活(感染活性)以及粒径变化等方面考察冻融对腺病毒稳定性的影响，结果如图3至图6所示。从图3至图6可知，d4 组和d3两组制剂配方在反复冻融5次后，病毒滴度值变化不超过0.2lgtcid
50
/ml，病毒颗粒数变化小于10％，粒径稳定(分别在135nm和123nm左右)。通过计算，比活(vp/ifu) 在80至150范围内，绝大部分在100至120范围内。结果表明，d4和d3两组制剂配方中腺病毒在5次冻融过程中展现出良好的稳定性。
[0176]
综上所述，含蔗糖、吐温80、甘露醇、甘氨酸以及枸橼酸缓冲盐体系的腺病毒的配制品可以维持良好的稳定性，而且枸橼酸盐缓冲盐浓度相对较高时，稳定性更佳。具体来说，d4 组和d3组配方的黑猩猩腺病毒配制品样品在加速实验中，两者在14天均表现出良好的稳定性，两组样品28天病毒颗粒数和粒径变化小，比活在80至160的范围内，渗透压也较为适当，在5次冻融过程中展现出良好的稳定性。同时也验证了该配方适用于不同批次腺病毒配置品时，对制剂稳定性均具有较好的增强作用。
[0177]
实验例5不同ph值的腺病毒配制品制备及稳定性
[0178]
本实验例5与实验例4中d3组的区别仅在于ph值不同，枸橼酸盐总浓度为60mm，一共设置了三组不同ph值组别(d3-a，d3-b，d3-c)：5.9、6.1和6.6。各组配制品的配方如表19所示。以pe20201026-1-b3批次radc68xy3-pres腺病毒的配制品样品置于37℃或42℃生化养箱(设备编号：perd1702020&perd1711056)，在第0、7、14和28天分别取样，考察各时间点病毒滴度变化、病毒颗粒数变化和粒径变化。
[0179]
表19不同ph的腺病毒配制品配方表
[0180][0181]
备注：参照表3备注。
[0182]
采用icc法检测d3-a，d3-b和d3-c样品在42℃加速稳定性实验所得的病毒滴度，od
260
法检测样品的病毒颗粒数，检测结果分别参见表20和表21。由表20和表21可知， radc68xy3-pres腺病毒在三种ph值(5.8至6.0，6.0至6.2，6.5至6.7)条件下，42℃放置 7天病毒滴度值(lgifu/ml)变化约在0.3至0.4，不同ph下差异极小，病毒颗粒数在42℃放置7天后三组之间也无明显变化。表明在现有配方基础上，ph在5.8至6.7的范围内，均对黑猩猩腺病毒的有较好的稳定性。
[0183]
表20不同ph腺病毒配制品的42℃加速实验病毒滴度变化情况一览表(lgifu/ml)
[0184]
组别d3-ad3-bd3-cph5.96.16.60d9.369.479.4542℃7d9.099.089.10
[0185]
表21不同ph腺病毒配制品病毒颗粒数检测结果(od
260
法)
[0186]
组别ph42℃7天病毒颗粒数(vp/ml)d3-a5.93.10e+11d3-b6.13.10e+11d3-c6.63.04e+11
[0187]
本发明通过制剂研究发现，糖类化合物或糖醇浓度、枸橼酸盐缓冲体系、甘氨酸和甘露醇对重组腺病毒的稳定性起主要作用。本发明提供的含有腺病毒的液体制剂配方在多次冻融循环中都是稳定的，在2℃至8℃稳定储存的可能性也将大幅减少腺病毒疫苗的储存运输成本，具有极大的价值。
[0188]
实验例6含不同异源核酸分子的腺病毒配制品制备及稳定性
[0189]
按表22所示的配方分别配制含radc68xy3-gfp、radc68xy3-pres、radc68xy3-s 的制剂。
[0190]
表22e1至e3组三种腺病毒的制剂样品成分
[0191][0192]
备注：参照表3备注。
[0193]
(1)病毒滴度
[0194]
采用icc法检测e1至e3组含不同重组腺病毒配制品样品42℃热稳定性加速实验和 37℃热稳定性加速实验的结果如表23所示。
[0195]
表23e1至e3组样品的37℃/42℃加速稳定性实验病毒滴度变化情况一览表 (icc法,lgifu/ml)
[0196][0197]
由表23可知，无论是在37℃加速稳定性实验病毒滴度实验中，还是在42℃加速稳定性实验病毒滴度实验中，e1至e3组样品均表现出理想的稳定性，其中，e1至e3组样品在42℃加速稳定性实验病毒滴度实验中病毒滴度变化很小，第7天的病毒滴度相较于第0 天的病毒滴度下降值或上升值小于0.15。
[0198]
以上对本技术所提供的一种包含腺病毒的医药配制品进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本技术的原理及实施方案进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本技术的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本技术的思想，在具体实施方案及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本技术的限制。