专利名称：疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的后生动物寄生虫抗原，以及它们在控制由蠕虫和其他后生动物寄生虫(尤其是家养动物中的蠕虫和节肢动物寄生虫)引起的疾病中的应用。
每种家养动物都可以寄生有许多不同的寄生虫，包括许多种蠕虫和节肢动物，这一寄生过程通常引起疾病。这些疾病中有些在经济上是相当重要的例如血矛线虫病(haemonehosis)是由捻转血矛线虫这样一种蠕虫引起的疾病，这种线虫寄生在各种反刍动物包括羊的皱胃或真胃。血矛线虫的幼虫和成熟虫是吸血虫，它通过嘴附着在胃粘膜内的小血管上。有严重寄生虫的羊可失去大量血液，导致贫血、不健壮和经常死亡。血矛线虫病主要发生于世界的热带和亚热带地区，因为捻转血矛线虫在牧场的非寄生期易出现于低温气候，并且经常是在温和气候下也不能过冬。
从经济观点看也具有非常重要意义的是非吸血线虫Ostertagia ostertagi和Ostertagia(Teladorsagia)circumcincta(O.circumcincta最近被再分类为T.Circumcincta，只是新的名称尚未被广泛应用)。分别感染有O.ostertagi和O.circumcincta的牛和羊不能够健康成长，如果不治疗会引起死亡，胃线虫病(Ostertagiosis)是当今动物饲养中发生问题的主要蠕虫感染之一。
其他有经济重要性的寄生虫包括下列蠕虫家族的各种寄生虫毛圆线虫属，细颈线虫属，网尾(线虫)属，古柏线虫属，蛔虫属，恶丝虫属，鞭虫属，园线虫属，片吸虫属，结节线虫属，仰口(线虫)属，后圆线虫属。除家畜外，宠物和人也会被感染，常常出现致命的后果，并且蠕虫感染和侵染会带来相当广泛严重的世界性问题。
其他有意义的后生动物寄生虫包括许多节肢动物种类，尤其是蜘蛛和昆虫类的成员，特别是外寄生物如吸血(血液寄生)昆虫(例如昆虫外有翅亚纲和内有翅亚纲的成员)，绿头苍蝇(绿蝇属)和扁虱。
这方面特别提到的是扁虱品种和牛蜱属(Boophilus，spp)、钝眼蜱属、软蜱属、扁头蜱属、璃眼蜱属、钝缘蜱属、革蜱属、硬蜱属;苍蝇，尤其是绿蝇属和蝇蛆病，吸吮和叮咬苍蝇，如厩螯蝇、羊狂蝇、Hydrotaea irritans、胃蝇属、蚋属、扰血蝇、黑角蝇属、虻属、金蝇属、丽蝇属、白蛉属、舌蝇属、皮蝇属(hypoderma spp)、皮蝇属(Dermatobia spp)、和旋锥蝇属，虱，如，Haematopinus eurysternus、Linognathus Vittuli、Solenopotes Capillatus、Linognathus ovillus、和Menacanthus spp;螨，如痒螨属、蠕螨属、疥螨属、皮疥螨属、Psorergates spp、皮刺螨属、禽刺螨属、耳癞螨属、和痂螨属;蚤类如犬栉头蚤和猫栉头蚤;羊蜱蝇类如，羊虱蝇，和臭虫如臭虫属。
除了它们本身寄生的影响，许多吸血节肢动物是传播各种疾病的重要因素，例如，传播有医学和兽医学意义的致病性原虫或病毒。由于吸血节肢动物以及它们传播的疾病使得牲畜饲养者每年损失很大。
对于畜牧场蠕虫和节肢动物寄生虫的控制，目前主要依靠使用抗蠕虫药、endectosides和/或杀虫剂，并配合牧场管理。这种方法经常是不令人满意的，首先，因为必须经常地使用药物，再者对抗蠕虫药和杀节肢动物药的抗药性广泛增加，第三某些牧场经常不可能有合适的牧场管理，而且即使有，也是强调最好的利用可能的放牧。
曾试图通过免疫方法控制家畜的寄生虫。除极少数例外(如，牛肺蠕虫，Dictyocaulus viviparus)已经证实这种方法的不可行性，到目前为止，商业上尚没有用于防止反刍动物胃肠道线虫(包括血矛虫属和胃线虫属)和主要节肢动物寄生虫的疫苗。
不过，最近几年，有一些报道描述从血矛线虫属中分离出的新蛋白，并且有预防性抗原活性，不仅可抗血矛线虫属，而且还可以抗家畜的多种相关内寄生虫(描述见Emery和Wagland，1991，Parasitology Today 7，347-349)。
Munn于1977年(Tissue and Cell 1977，923-34)首次报道了与捻转血矛线虫肠细胞腔表面相关的一种螺旋状聚合细胞外蛋白-弯曲蛋白(Contortin)，而且后来作为粗制提取物大剂量(几毫克)给药时，表现可防止小羊发生血矛线虫病(Munn 1987，Parasitology 94 385-397)。因为需要大剂量以及所注射制剂的不纯，尚不清楚是否这些实验中产生的保护作用实际上是由于弯曲蛋白(contortin)本身还是由于污染疫苗的其他抗原。的确进一步的工作表明用这种弯曲蛋白制剂免疫的羊也具有抗肠膜蛋白对(doublet)H 110 D的抗体。后来表明用小剂量(几百微克)的高纯度H 11 D免疫的羊基本上可防止血矛线虫病(Munn，WO 88/00835;Munn and Smith WO 90/11086)。H 110 D目前代表了当今抗血矛线虫属最成功的疫苗成份。还发现了第三种具有预防性抗原特性的血矛线虫肠膜蛋白并命名为H45(Munn and Smith WO 90/11086)。
现有技术中还有报道不成功的尚试，试图在血矛线虫属和其他蠕虫种类中识别预防性抗原。因此，如，已从成熟血矛线虫属中分离出一种45kd膜糖蛋白，将它作为免疫原用于由这种寄生虫激发的荷兰猪中时以蠕虫数表示可表现出约50%的保护作用(Sharp，Wagland and Cobon WO 92/13889)。没有描述它在羊身上的作用。没有说明这种抗原在蠕虫中的天然位置，确实也没有说明它是一种肠腔表面蛋白。有报道说血矛线虫属膜提取物的更粗制品(几乎肯定含有H 110 D)可减少羊卵虫和蠕虫数目分别达88和75%，不过也没有提供资料说明分组样本大小以及羊之间变异的情况。捻转血矛线虫自然条件下不寄生于荷兰猪。不象在其自然宿主如羊身上那样可持续几周，血矛线虫属感染荷兰猪后在达到其成熟期前几乎所有蠕虫在感染后5到7天之间即被明显地消除掉(Wagland，Abeydeera，Rothwell and Ouwerkerk 1989 International Journal for Parasitology 19 301-305)。在WO 92/13889中使用的荷兰猪激发模型中，在激发后5或6天处死动物，这样接种组和对照组之间的任何区别只反映了排斥现象加速了1或2天。这种非常微小的区别与本发明(也见上述的WO 88/00835和WO 90/11086)所述的羊身上的效果形成对照，并且对此文献中的这种实验室动物模型的价值产生了怀疑。后来本发明经实验证实了这种怀疑，发现一种血矛线虫属膜提取物的小麦芽植物血凝素结合部分对羊具有高度的保护作用，而在WO 92/13889中报道了一种基本相似的制剂在荷兰猪模型中无作用。
WO 89/00163描述对一种41kd蛋白的编码基因的克隆和表达，这种蛋白来源于蛇形毛圆线虫，这种线虫是与血矛线虫相同分类家族的一个成员，并且是羊小肠的一种寄生虫。这种蛋白尚没有特征化，尽管由于用来源于表达这种基因的重组有机体的蛋白接种羊，在用血矛线虫属激发后与对照羊比较据称可引起卵虫和蠕虫数目的减少，但这种减少没有统计学的显著意义，除非进一步地改进，所表现的保护程度在商业上是没有使用价值的。
最近从捻转血矛线虫中分离出一种水溶性半胱氨酸蛋白酶，并且已克隆和表达了编码这种酶的基因(Cox，Pratt，Hageman and Boisvenue 1990 Molecular and Biochemical Parasitology 41 25-34)。通过在还原条件下SDS-PAGE电泳判断这种蛋白酶具有35kd的分子量，不过还识别了一种分子量为37kd的更重的糖基化转化体。曾假定这种蛋白酶(推断可除解纤维蛋白原)在血矛线虫属吸血时可防止宿主血液凝固，有可能增强血液的摄入和消化。据说用富含天然半胱氨酸蛋白酶的几百微克样本反复给羊注射，可预防血矛线虫属，因为在用2，500血矛线虫属幼虫激发后与对照羊比较它们的粪便卵数减少并且所携带的蠕虫也少(Boisvenue，Stiff，Tonkinson，Cox and Hageman 1990 Proceedings of the VIIth International Congress of Parasitology p.475)。尽管如此，在美国专利408339和48718)中公开的这些实验的详细内容表明接种组和对照组之间蠕虫和虫卵数目的实际差异是勉强的，没有统计学的显著意义。
已经从血矛线虫三期幼虫的外鞘体液中纯化出一种44kd蛋白酶(Gamble，Purcell and Fetterer 1989 Molecular and Biochemical Parasitology 33 49-58)。这种蛋白酶，被定义为金属蛋白酶，不能被胃酶抑素所抑制，可以引起蜕皮，没有测试出它的预防功能。Maki和Yanagisawawa(Journal of Helminthology 1986，60，31-37)描述了在成熟曼氏血吸虫、犬恶丝虫、Angiostrongylus Cantonensis和Suum.蛔虫中的羧基(天冬氨酰基)和硫羟基蛋白酶活性。尽管如此，也没有对这些活性以分子量的形式进行分离或特征化，并且没有试图确定它们是否可用作预防性抗原。
已从三期O.circumcincta幼虫中分离出一种31kd糖蛋白(McGillivery，Young，Riffkin and Adler 1989 International Journal for Parasitology 19 473-478)。用这种糖蛋白免疫的羊可部分地预防激发感染(WO 91/01150)。
已经从蛇形毛圆线虫(T.colubriformis)的排泄分泌产物中分离出11和17kd的两种低分子量蛋白(Savin et al.，1990 Molecular and Biochemical Parasitology 41 167-176;Dolpheide et al.，1991，Molecular and Biochemical Parastology 45 101108)。据报道当用这些抗原的重组转化体免疫羊时，对用蛇形毛圆线虫的激发可产生低程度或可变程度的预防(Emery and Wagland 1991)。
就节肢动物寄生虫而言，现有技术很少报道有推荐的疫苗，这些报道主要集中在具环牛蜱，尤其是微小牛蜱上面。因此Johnson等人于1986年报道从成熟雌性蜱中得到的水溶性和非水溶性提取成份中可发现抗微小牛蜱的预防性抗原(Johnson et al.，1986，Int.J.Parasitol，16(1)27-34)。从那时起现有技术中出现了一些报道，建议使用从成熟蜱的内脏提取物、蜱幼虫提取物和唾液腺成份中得到的蜱抗原免疫牛以抵抗蜱(见，例如，Willadsen et al.，1989，Int.J.Parasitol.18(2)183-189;Wong et al.，1990，Parasite Immunology，1275-83;Jackson et al.，1990，Parasite Immunology，12141-151)。
目前仍然需要新的和改进的后生动物寄生虫疫苗，尤其是需要一种可对广泛蠕虫和/或节肢动物种类使用的疫苗。
因此本发明试图提供新的抗原用作后生动物寄生虫疫苗，尤其是作为预防性免疫原用于控制由蠕虫和其他后生动物寄生虫引起的疾病。
更具体的讲，本发明是基于发现H.Contortus的内脏含有一种蛋白水解活性糖蛋白复合物，我们命名它为H-gal-GP(含血矛线虫半乳糖的糖蛋白)，并且它能够使动物具有抗血矛线虫及相关寄生虫的免疫能力。已分别从Ostertagia Ostertagi和Ostertagia circumcincta的提取物中分离出与H-gal-GP类似的糖蛋白复合物(我们称之为Oo-gal-GP和Oc-gal-GP)，并且发现了在其他蠕虫如毛圆线虫中的类似蛋白水解活性。从它们所结合的膜上例如通过使用洗涤剂如Triton X-100分离下的这种复合物是新的，并且可用于生产抗蠕虫感染的疫苗。在其他的后生动物寄生虫如绿头苍蝇幼虫中也发现了存在于蠕虫中的酶。
因此，根据本发明的一方面，提供了一种后生动物寄生虫抗原或抗原片段，其成份或其前体，和具有抗一种或多种后生动物寄生虫的预防性抗原活性的其功能等同衍生物、类似物或变异体，该抗原的特征在于(a)具有蛋白水解活性;
(b)天然形式是一种完整的膜蛋白或蛋白复合物，存在于寄生虫内脏的肠刷边缘;
(c)能够结合胃酶抑素;和(d)能够结合小麦芽植物血凝素和对β-连接的N-乙酰半乳糖胺有特异性的植物血凝素。
本发明的另一方面提供了预防性抗原和抗原片段、其成份或前体及功能等同衍生物，类似物或变异体用于在人或非人类(优选哺乳动物、特别是反刍动物)体内激发抗后生动物寄生虫的免疫应答。
所说抗原的前体是一种较大蛋白，通过如蛋白水解处理可原位产生抗原。这种前体可以是酶原的形式，也就是酶的非活性前体，通过蛋白水解断裂可使之活化，例如可以是胃蛋白酶/胃蛋白酶原系统或与血液凝固链相关的公知酶原的类似物。
本发明的新抗原不能被自然免疫动物血清所识别。换句话说，这些抗原在天然形式时通常不能接触到感染宿主的免疫系统，因此称之为“隐蔽”、“隐藏”或“秘密”抗原。
关于本发明新抗原的植物血凝素结合活性，已证实了与Con A、豌豆和莲花植物血凝素的结合，这表明了甘露糖和/或岩藻糖残基的存在。没有发现与植物血凝素如Datura和Bandeiraea的结合，说明缺乏含N-乙酰葡糖胺的结构，但是如上所述，与对N-乙酰半乳糖胺(特别是β-连接的N-乙酰半乳糖胺)有特异性的植物血凝素的结合是显著的，尤其是与花生和jacalin植物血凝素的结合。
关于蛋白水解活性，尽管使用一般蛋白酶底物如偶氮胶原蛋白、偶氮酪蛋白、血红蛋白、和明胶已经证实了这一点，但还发现了更特异性的活性，最显著的是天冬氨酰蛋白酶样和中性内肽酶样活性。因此，例如，在H和O-gal-GP制剂和蠕虫如毛圆线虫中已证实了天冬氨酰蛋白酶样活性。在含有本发明抗原的提取物中含有中性内肽酶样活性。而且，就所说的特异性抗原H-gal-GP而言，来源于编码H-gal-GP成份的cDNA克隆的开始核苷酸序列数据表明了与已知中性内肽酶的基本同源性。
因此，从不同角度看，本发明还提供了一种预防性后生动物寄生虫抗原或抗原片段、其成份或其前体和具有抗一种或多种后生动物寄生虫的预防性抗原活性的其功能等同衍生物、类似物或变异体，该抗原的特征在于具有天冬氨酰蛋白酶样和/或中性内肽酶样活性，并且天然形式的抗原是一种完整的膜蛋白或蛋白复合物。
本发明抗原的另一个主要特征是它们可以结合胃酶抑素。胃酶抑素公知是一种天冬氨酰蛋白酶的抑制剂，据记载它还可以较小程度地结合膜金属内肽酶，包括中性内肽酶。
发现胃酶抑素可抑制血矛线虫属、胃线虫属和毛圆线虫属中的蛋白水解活性。因此本发明的另一方面提供了预防性后生动物寄生虫抗原或抗原片段、成份或其前体和具有抗一种或多种后生动物寄生虫的预防性抗原活性的其功能等同衍生物、类似物或变异体，该抗原的特征在于能够结合胃酶抑素，并且其天然形式是一种完整的膜蛋白或蛋白复合物。
等电子聚焦研究表明本发明糖蛋白抗原的等电点位于大约pH2至pH7.5区间。
对本发明的抗原已进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)研究。在还原和非还原凝胶上这种研究有不同的表现。特别是，在非还原凝胶上的较大谱带当在还原条件下再电泳时会分解成一个或多个小谱带。正如下面将要详细描述的，描述了对个体蛋白或复合谱带的蛋白水解活性和预防性抗原活性，不过某些谱带比其他谱带更“活跃”。本发明的抗原可能代表了多聚酶复合物。
关于抗原H-gal-GP，PAGE研究结果在下面的实施例1中有详细描述。因此，本发明的优选抗原亚单位包括实施例1中所述的抗原(及其片段或成份)和它们的功能等同衍生物、类似物和变异体，包括其他属或种的类似物。因此，本发明的优选抗原可包括可从血矛线虫属或其他后生动物寄生虫属中分离、具有表1所列SDS-PAGE分子量的抗原。
关于抗H-gal-GP，预防性抗原活性表现与某些特定成份蛋白谱带相关，更为详细的描述见下面的实施例7，实验5。
因此，本发明的另一方面还提供了一种预防性后生动物寄生虫抗原或抗原片段、成份或其前体，和具有抗一种或多种后生动物寄生虫的预防性抗原活性的其功能等同衍生物、类似物或变异体，该抗原是，或形成部分、或完整的膜蛋白或蛋白复合物，它可从血矛线虫属的内脏获得，并且在非还原条件下通过在5%凝胶上进行SDS-PAGE电泳测得它具有大约190至205kd的分子量或者是在非还原条件下通过在10%凝胶上进行SDS-PAGE电泳测得大约35或45至50kd的分子量。
本发明特别感兴趣的后生动物寄生虫包括特别是蠕虫和节肢动物寄生虫，对于后者，特别是吸血昆虫寄生虫、牛蜱和蝇蛆病苍蝇。作为代表性的这种蠕虫和节肢动物寄生虫可以是，例如，上述列举的不同种类。
本文所用术语“预防性抗原”定义为那些能够产生宿主预防性(即免疫原性)免疫应答的抗原，这种免疫应答也就是一种宿主的反应，它能产生免疫效应因子分子、抗体或细胞以破坏、抑制或杀死寄生虫，并且从而“防止”宿主或宿主种类发生临床或临床前期疾病以及繁殖能力的丧失。这种预防性免疫应答通常会表现为产生抗体，这种抗体能够抑制寄生虫的代谢功能，导致发育迟缓，缺乏排卵和/或死亡。
对于某些后生动物寄生虫，特别是蠕虫和那些专性寄生的外寄生物，如虱和螨或那些在宿主上寄食一段时间的寄生虫，如绿头苍蝇、鸣苍蝇、旋蝇、和肤蝇幼虫，有角牛/水牛蝇，和蜱，宿主预防性免疫应答可引起感染动物的寄生虫死亡、衰弱和/或驱除。换句话说感染动物的寄生虫携带数减少了，感染动物本身直接从其自己的免疫应答受益。但是在其他情况下，可发现一种“流行病学”效应，此时直接宿主本身不必从其自己的免疫应答明显受益。例如，在免疫的宿主上寄食的结果，可使该地区的寄生虫数量减少和/或减弱，从而保护了后者宿主群。保持该免疫过程经过几个季节将继续减少寄生虫病的威胁。这对于节肢动物外寄生虫如蜱、苍蝇等来说尤其正确，这些寄生虫的寄食会很快地从一个宿主转移到另一个宿主。通过这种方式，被寄生虫摄入的抑制性抗体在寄生虫离开该宿主之后会发挥其效应，但通过杀死、使衰弱或减少寄生虫的生殖力，宿主动物群中的其他成员得到保护。
正如下面将要详细描述的，已经证实了本发明抗原的预防性、免疫原性、活性。还进一步表明，当抗原变性(如通过分离和/或还原)时这种预防活性仍然保存。的确，如上所述，血矛线虫抗原复合物H-gal-GP的某些成份表现出特别的预防性。
另一种观点是，本发明还提供了前面所定义的后生动物寄生虫抗原及其具有抗一种或多种后生动物寄生虫的预防性抗原活性的成份、片段、前体和功能等同衍生物、类似物或变异体的用途。用它们制备一种疫苗组合物，用于在人或非人类、优选哺乳动物、特别是优选反刍动物中激发抗后生动物寄生虫的免疫应答。
本发明还提供了一种用于在人或非人类、优选哺乳动物中激发抗后生动物寄生虫的免疫应答的疫苗组合物，它包含一种或多种上述定义的抗原或其具有抗一种或多种后生动物寄生虫的预防性抗原活性的成份、片段、前体和功能等同衍生物、类似物或变异体，还含有可药用载体或稀释剂。本发明还提供了在人或非人类、优选哺乳动物中激发抗后生动物寄生虫的免疫应答的方法，该方法包括给所说的动物施用上面定义的疫苗组合物。
如上所述，这种新的糖蛋白抗原的功能等同衍生物、类似物和变异体包括在本发明的范围之内。本文所用“功能等同”是定义与天然酶蛋白相关或来源于天然酶蛋白的蛋白质，其中已通过一个或多个氨基酸取代、加入和/或缺失对其氨基酸序列进行了修饰，而且用它还定义已经进行了氨基酸化学修饰(包括脱糖基化或糖基化)、但仍保留预防性抗原活性如能够激发宿主产生抗寄生虫的预防性抗体和/或功能性免疫的序列。这种功能等同性变异体可以是自然生物变异，或者是使用已知技术制备。例如，可以使用对核酸的位点诱导性突变、随机突变、或酶切割和/或连接这些已知技术制备功能等同性重组蛋白。涉及到类似抗原复合物H-gal-GP和O-gal-GP正如下面实施例详细描述的，这些功能等同性类似物可以出现在不同的寄生虫种类中。
本发明的抗原可以从广泛的后生动物寄生虫种类中获得，包括例如线虫血矛线虫、胃线虫和毛圆线虫。(为避免出现疑问，本文所用术语“胃线虫”包括Teladorsagia sp.)。优选的是那些所谓的“广谱”抗原，它们能够激发宿主的预防性免疫应答，除了能抵抗它们分离来源的寄生虫外，还能抵抗广泛的其他寄生虫。因此，例如，血矛线虫糖蛋白复合物H-gal-GP可以预防不同种类的胃线虫，反之也一样。
如上所述，本发明抗原产生其宿主预防性效应的一种方式是激发产生抑制性抗体，该抗体能抑制寄生虫的生长、维持和/或发育。这些可以是单一或多克隆的抗体及其抗原结合片段(如，F(ab)2，Fab和Fv片段，也即抗体“可变”区的片段，它包含抗原结合位点)构成了本发明的另一部分内容，这如同含有它们的疫苗组合物以及它们在制备疫苗组合物用于免疫宿主抗寄生虫中的应用一样。可以使用基因型抗体激发这种抑制性抗体。可以用抗基因型抗体作为疫苗中的免疫原。
可以使用惯用的生物化学和外科方法从寄生虫如蠕虫中提取制备本发明的抗原，这种方法如均质整个寄生虫或只均质其肠，然后用惯用的纯化方法如离心，选择性沉淀，色谱等分离所需的酶。优选方法的优点是通过利用在固相基质上固定了特异配体的新合层析系统使靶分子具有特定的选择结合活性。
因此本发明还提供了一种制备用于免疫人或非人类、优选哺乳动物抗后生动物寄生虫感染的疫苗的方法，所说的方法包括制备含有至少一种上面定义的预防性抗原的所说寄生虫的提取物，通过将所说抗原结合到一种包含所说抗原的特异性结合配体的固定相上面，然后从所说固定相上洗脱所说的抗体这一过程从中纯化所说抗原。合适的特异性结合配体包括底物类似物例如抑制剂胃酶抑素，和寡聚糖特异性植物血凝素如那些特异性结合半乳糖(特别是β-连接的N-乙酰-半乳糖胺)的植物血凝素。
的确，我们的研究已经表明某些植物血凝素特别适合用亲合层析中的配体以识别寄生虫肠腔表面上的具有预防性抗原能力的糖蛋白。
因此，本发明的另一方面提供了一种识别寄生虫中预防性抗原的方法，包括使用带有一种或多种对N-乙酰-半乳糖胺有特异性的植物血凝素的固定相，对寄生虫的完整膜部分进行亲合层析。
这些植物血凝素优选花生或jacalin植物血凝素，或者是具有β-连接的N-乙酰-半乳糖胺特异性的其他植物血凝素。
使用现有技术中公知的方法可以容易地制备寄生虫的完整膜部分，例如用Triton X-100进行洗涤剂提取。
亲合层析技术在现有技术中是公知的，并且包括床和柱基质系统。可以使用许多种可吸附植物血凝素的固相，例如凝胶如琼脂糖或Sepharose。的确，带有花生或Jacalin植物血凝素的琼脂糖凝胶珠在商业上是可得到的(Vector Laboratories)。
另外，还可以使用标准方法通过重组DNA技术制备该抗原，如由Sambrook等人所述的方法，1989，(Molecular Cloning，a laboratory manual 2nd Edition，Cold Spring Harbor Press)。
本发明的另一方面还包括含有编码本发明抗原的核苷酸序列的核酸分子。
曾对与抗原H-gal-GP相应的克隆初级序列进行了研究。其中一种克隆的序列(命名为HG3)示于图33(序列识别号1)。如图34所示的氨基酸序列(序列识别号2)所表明的，这一序列与已知的哺乳动物中性内肽酶序列表现出显著的同源性。
因此，本发明的一种优选核酸分子包含一种或多种与图33所示核苷酸序列(序列识别号1)的全部或部分基本相对应的核苷酸序列，或者是一种所说序列的降解序列或基本与之同源或与之杂交的序列。
本发明的核酸分子可以是单股或双股的DNA、cDNA或RNA，优选DNA，并且包括能够编码所说抗原或抗原片段的降解、基本同源和杂交序列。“基本同源”是指表现出至少60%，优选至少70%或80%序列同源性的序列。本发明范围内的杂交序列是那些在非严格条件下(6×SSC/50%甲酰胺，室温)结合，并以在低严格条件(2×SSC，室温，更优选2×SSC，42℃)或在高严格条件如2×SCC，65℃(其中SSC＝0.15M NaCl，0.015M枸橼酸钠，PH7.2)下冲洗的序列，以及那些可在上述条件下杂交的序列(密码子的降解除外)。
可以使用现有技术中公知的惯用方法获得能够编码本发明有抗原活性的抗原或抗原变异体的核苷酸序列衍生物。
可以通过在一种宿主细胞中表达制备重组形式的本发明抗原，所说宿主细胞中含有一种重组DNA分子，该分子含有一种上面广义定义的并人工连接到一种表达控制序列上的核苷酸序列，或者该宿主含有一种重组DNA克隆载体或者是含这种重组DNA分子的载体。以这种方式表达的合成多肽构成了本发明的另一方面内容(本文所用术语“多肽”包括全长度蛋白和较短的肽序列)。
如此表达的抗原可以是一种融合多肽，该多肽包含有全部或部分的本发明抗原和另外一种由融合其上的重组分子DNA编码的多肽。这可以是例如β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-转移酶，肝炎核心抗原或通常在现有技术的融合蛋白中使用的任何其他多肽。
因此，本发明的其他方面包括含有编码本发明抗原的DNA的克隆和表达载体，以及制备本发明重组核酸分子的方法，包括向载体核酸，如，载体DNA中插入编码该抗原的核苷酸序列。这种表达载体包括合适的控制序列如翻译(如起始和终止密码子，核糖体结合位点)和转录控制成份(例如，启动子-操纵子区，末端终止序列)，并且这些成份在配对阅读框架中与本发明的核酸分子连结。
本发明的载体可以包括根据现有技术中的公知技术和文献记载的质粒和病毒(包括噬菌体和真核病毒)，并且可以在各种不同表达系统中表达。这些系统也是现有技术文献记载和公知的。合适的病毒载体包括杆状病毒，和腺病毒以及牛痘病毒。许多其他的病毒载体在现有技术中有所记载。
可以用各种已知的技术将这些载体导入原核或真核细胞用于表达，或导入胚系或体细胞以形成转基因动物。合适的转化或转染技术在文献中有详细描述。
本发明还包括含有上面定义的本发明核酸分子的转化或转染的原核或真核宿主细胞，或转基因生物。这种宿主细胞可以例如包括原核细胞例如大肠杆菌、真核细胞如酵母或杆状病毒昆虫细胞系统、转化的哺乳动物细胞和转基因动物和植物。特别提到的是转基因线虫(见，例如，Fire，1986，EMBO J.，5.2673以便讨论线虫Caenorhabditis的转基因系统)。
本发明的另一方面内容提供了制备前面定义的本发明抗原的方法，包括培养一种宿主细胞，该宿主细胞含有编码全部或部分所说抗原的核酸分子，培养条件是指能够表达所说抗原的条件，该方法还包括回收如此生产的所说抗原。
还可以通过化学方法，如已知的Merrifield固相合成方法制备本发明的抗原及功能等同抗原变异体。
上述新抗原的水溶性衍生物构成了本发明的另一方面内容。可以通过蛋白水解消化，如使用弹性蛋白酶，来获得这种水溶形式。一般地说酶消化抗原产生两部分产物，一部分是洗涤剂可溶性成份(它保留在膜上)，另一部分是水溶性成份。
通过疫苗生产领域中的公知方法，根据本发明可制备一种疫苗组合物。传统的疫苗制剂包括一种或几种本发明的抗原或抗体，并且在合适条件下，还含有一种或多种合适的佐剂如氢氧化铝、皂草苷、quil A、或它的更纯化形式、胞壁酰基二肽、矿物油或植物油、Novasomes或非离子阻断共聚物或DEAE葡聚糖，并含有一种或多种可药用载体或稀释剂。合适的载体包括液体基质如适合于用作载体以将肽或多肽引入动物或病人的盐溶液。还可以包括其他成份如防腐剂。
另一种疫苗制剂可以含有一种病毒、或宿主细胞如微生物(如牛痘病毒、腺病毒或沙门菌)，这些微生物可以是成活的、灭活的或减毒的，并且在其中已插入本发明的核酸分子(如，DNA分子)，以用于激发一种免疫应答，抵抗由插入的核酸分子所编码的多肽。
该疫苗组合物的给药可以通过任何惯用途径，如口服或非肠道给药如肌内注射，给药间隔是可选择的如，在7-35天间隔注射两次。
本发明的抗原可以与从相同或不寄生虫种类中获得的其他预防性抗原结合使用。因此，本发明的疫苗组合物可以含有一种或多种上述定义的抗原如H-gal-GP，并且一同含有上述抗原H110D和H45。这种结合的疫苗组合物比单一的疫苗制剂(只含有所需的抗原)含有更小量的各种不同抗原。
受益于本发明的动物可以是任何的人或非人类动物，但优选的是伴生动物(尤其是狗和猫及家畜)，特别是反刍动物。特别优选的是羊、牛、猪、鹿和山羊。
本发明将对来源于捻转血矛线虫(H.Contortus)O.ostertagi和O.circumcincta的分别命名为H-gal-GP、Oo-gal-GP和Oc-gal-GP的抗原进行更为详细的讨论。如上所定义的在不限制本发明主题的同时，应当明白的是H-gal-GP、Oo-gal-GP和Oc-gal-GP和/或其分离成份在蠕虫疫苗制剂中的应用及抗原和疫苗本身构成本发明的特别优选内容。
蛋白H-gal-GP是血矛线虫属肠细胞刷缘线内的完整膜蛋白。它已被糖基化，并且选择性地结合到对N-乙酰半乳糖胺有特异性的植物血凝素上。它表现出可被胃酶抑素(一种天冬氨酰蛋白酶的特异性抑制剂)抑制的蛋白酶活性。在还原条件下于SDS-聚丙烯酰胺凝胶上它可跑出8条主要谱带。鉴于此原因，它被命名为血矛线虫属含半乳糖糖蛋白复合物或H-gal-GP。
在下面的非限制性实施例中，图的含义代表
图1表示H-gal-GP、H11OD和H-45复合物在10%丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE的比较。
泳道1至3和4至6 分别是非还原和还原样品，泳道1和4 一种富含H11和H45复合物的混合物的部分泳道2和5 H45复合物泳道3和6 H-gal-GP对泳道3中47和50kd带的N末端氨基酸序列进行了测定。
图2表示H-gal-GP在非还原条件下于5%凝胶上的SDS-PAGE概括。每个泳道含有不同的H-gal-GP含量。字母表示从羊实验5(见实施例7和图22)中的抗原上切下的样本带，如下A＝15组的230kdB＝16组的190-205kd 弥散带C＝17组的170kdD-18组的染色前谱带图3表示了在非还原条件下预先分离的主要H-gal-GP带的还原条件下分析。
泳道1 H-gal-GP泳道2 230kd)这些表现分子量的谱带泳道3 170kd)从一种5%凝胶(如图2)切下泳道4 染色前)和还原的再电泳对泳道3中的45和48kd谱带的N末端氨基酸序列进行了测定;
图4.表示制备H-gal-GP复合物的三种方法的流程图。
图5.表示H-gal-GP复合物在单Q基质上进行离子交换色谱后获得的样本的SDS-PAGE(10%凝胶，还原条件)。
a)预先由花生植物色凝素中分离的起始材料。
泳道1 装上柱子的起始材料泳道2 未结合的部分泳道3-5 用140mM NaCl洗脱的部分泳道6和7 用400mM NaCl洗脱的部分。
b)预先由jacalin植物血凝素分离的起始材料。
泳道1 装上柱子的起始材料泳道2 末结合的部分泳道3-5 用140mM NaCl洗脱的部分泳道6和7 用400mM NaCl洗脱的部分泳道8 用500mM NaCl洗脱的部分泳道9 用1M NaCl洗脱的部分;
图6.表示了已结合到花生、Vicia、莲、大豆、或Dolichos根物血凝素上的捻转血矛线虫膜的Triton X-100提取成份的SDS-PAGE比较。
将等份的捻转血矛线虫膜的Triton X-100提取物过柱，柱子中含有过量的下列琼脂糖偶含的植物血凝素-1)花生，2)Vicia Villosa，3)莲Lotus tetranoglobulus，4)大豆或5)Dolichos biflorus。用合适的糖(表2)洗脱结合的物质，并装载于非还原条件下的5%丙烯酰胶凝胶上，对泳道以相同顺序编号。
图7表示H-gal-GP亚成份与一组生物素化植物血凝素的结合。使H-gal-GP于还原条件下在10%凝胶上进行电泳，并在固定(immobilon)膜上点样。将点样样本切成标号的条状，然后分别与下列生物素化的植物血凝素一起孵育-1无(阴性对照)，2伴刀豆球蛋白A，3小扁豆，4小麦芽，5花生，6Jacalin，7大豆，8琥珀酰化的小麦芽，9 helix pomatia。第10条用考马斯(Coomassie)蓝进行蛋白染色。
图8表示了用偶氮酪蛋白作为底物的PH最佳值;(横座标表示PH，纵座标表示405nm的吸光率●H-gal-GP，▲Oc-gal-GP，+Oo-gal-GP);
图9表示以血红蛋白为底物的PH最佳值;(横座标表示PH，纵座标表示562nm的吸光率●H-gal-GP，▲Oc-gal-GP，+Oo-gal-GP);
图10表示H-gal-GP复合物与花生植物血凝素的结合(10%凝胶，还原条件)泳道1 装于花生植物血凝素柱上的血矛线虫的S3提取物泳道2-5 用0.3M半乳糖从柱子上洗脱的蜂值部分;
图11表示H-gal-GP复合物与Jacalin植物血凝素的结合(10%凝胶，还原条件)泳道1 装于Jacalin植物血凝素柱上的物质(从小麦芽植物血凝素中洗脱并结合的血矛线虫S3的部分)泳道2 未结合部分＝富含H11OD泳道4-7 用0.8M半乳糖从柱子中洗脱的峰值部分注意起始物质中的一条主要谱带是H11OD。它不与Jacalin结合，并且恰好在这些条件下被鉴别为比能与Jacalin结合的H-gal-GP的130kd成份略小。
图12表示了H-gal-GP与胃酶抑素琼脂糖的选择性结合(10%凝胶，非还原条件)泳道1 在低PH(5.5)下装于胃酶抑素琼脂糖上的血矛线虫S3泳道2 富含H11OD的未结合物质泳道3 在PH8.5洗脱的物质泳道4 用1%SDS(PH7.4)洗脱的物质泳道5 H-gal-GP(阳性对照);
图13 表示H-gal-GP与胃酶抑素琼脂糖的选择性结合和47及50Kd谱带(用抗H-gal-GP血清检测并在非还原条件下从10%凝胶电泳得到的免疫印迹)的亲合力。
泳道1 富含H11OD的未结合物质泳道2 在PH8.5洗脱的物质泳道3 用1%SDS(PH7.4)洗脱的物质泳道4 1%SDS洗脱步骤之后仍然结合到胃酶抑素琼脂糖上的物质(-由未装载柱子释放，并用含有SDS和DTT的SDS PAGE样本缓冲液煮沸琼脂糖)
泳道5 H-gal-GP(阳性对照);
图14 表示了用荧光标记的花生植物血凝素染色的捻转血矛线虫的恒冷切片。
图15 表示了用荧光标记的小麦芽植物血凝素染色的捻转血矛线虫的恒冷切片。
图16 表示了用抗H-gal-GP血清染色的捻转血矛线虫的恒冷切片;
图17 表示了从用H-gal-GP免疫的羊中获得的并用对羊免疫球蛋白有特异性的抗血清染色的捻转血矛线虫的恒冷切片;
图18 表示了捻转血矛线虫膜的PBS(S1)，吐温(S2)和Triton X-100(S3)提取物中H-gal-GP的分布;
泳道1、2和3含有从同一批蠕虫中得到的顺次PBS、吐温和Triton X-100的提取物。使样本还原，在10%凝胶上电泳，点样，过碘酸盐处理使糖类基团变性，并用抗H-gal-GP的抗血清检测;
图19 表示了H-gal-GP和H11OD与小麦芽植物血凝素的结合(10%凝胶，还原条件)泳道1 装于柱子上的血矛线虫属的S3提取物泳道2-8 用0.5M N-乙酰葡糖胺洗脱的峰值，富含H11OD和H-gal-GP的连续馏份;
图20 表示了H-gal-GP与胃酶抑素琼脂糖的结合(5%或10%丙烯酰胺凝胶，非还原条件)。
泳道1 装于胃酶抑素琼脂糖柱子上的H-gal-GP泳道2 用溶于10mM Tris-HCl、50mM NaCl(PH8.0)的1%SDS从柱子上解吸附的物质;
图21 表示了H-gal-GP的水解活性的底物凝胶分析。对含有0.1%明胶作为底物的7.5%非还原丙烯酰胺凝胶的放大观察。
泳道1 预先用胃酶抑素孵育的H-gal-GP泳道2 未处理的H-gal-GP图22 表示了使实施例7中所述的羊保护实验中所用免疫原分级分离的方案。
图23 表示了实施例7实验1的结果组平均粪便虫卵数●小麦芽(1)，▲对照(2)(横座标表示感染后的天数;纵座标表示平均卵数/g(+/-SE));
图24 表示了实施例7的实验2结果组平均粪便卵数●除去了H11(3)的小麦芽，▲未结合的植物血凝素(4)，+对照(5)(横座标表示感染后的天数;纵座标表示平均卵数/g(+/-SE));
图25表示了实施例7的实验3的结果组平均粪便卵数●H11OD(6)，▲花生(7)，+对照(8)(横座标表示感染后的天数;纵座标表示平均卵数/g(+/-SE));
图26 表示了实验4的结果组平均粪便卵数●天然(9)，▲对照(12)，+SDS(10)，◇SDS+DTT(11)(横座标表示感染后的天数;纵座标表示平均卵数/g(+/-SE));
图27 表示H-gal-GP与来源于O.circumcincta和O.ostertagi的等同蛋白间的相似性。将样本在5%非还原丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并点样到固定(immobilon)膜上。用生物素化的花生植物血凝素检测左侧的印迹，用抗H-gal-GP血清检测右侧的印迹。用抗血清检测的印迹预先用50mM过碘酸盐孵育，以使可能交叉反应的碳水化合物表位变性。在用正常血清孵育的对照印迹上没有发现染色。
泳道1 H-gal-GP泳道2 O.circumcincta-gal-GP泳道3 O.ostertagi-gal-GP;
图28表示了O.circumcincta-gal-GP与胃酶抑素琼脂糖的结合;
将等量的O.circumcincta-gal-GP加入到含琼脂糖珠的试管中，该琼脂糖珠已偶合到胃酶抑素、花生植物血凝素或dolichos植物血凝素之一上，并且将试管在4℃下轻微震荡3小时。沉淀小珠，保留未结合的上清液。洗涤三次之后，将珠子在最小量的SDS PAGE样本缓冲液中煮沸，并沉淀。使从这一步骤得到的、含有已结合到琼脂糖上的的上清液与未结合的上清液一起在非还原5% SDS PAGE凝胶上进行电泳，并点样在固定(immobilon)膜上，用生物素化的花生植物血凝素检测。
该结果表明O.circumcincta-gal-GP特异性地结合到花生植物血凝素和胃酶抑素琼脂糖上，因为它不与结合了另一种配体(dolichos植物血凝素)的琼脂糖结合。
泳道1 未结合的Dolichos泳道2 结合的Dolichos泳道3 未结合的花生泳道4 结合的花生泳道5 未结合的胃酶抑素泳道6 结合的胃酶抑素图29 表示用于进一步免疫试验的O.circumcincta的完整膜蛋白抗原制剂的SDS-PAGE图(10%丙烯酰胺凝胶;还原条件)。
泳道1 从完整蠕虫得到的O.circumcincta膜的Triton X-100提取物(S3)。
泳道2 在实施例8实验1中用于免疫羊的S3的ConA结合部分泳道3 不与ConA结合的S3部分剩余的泳道含有分子量标记物;
图30 是以组平均粪便卵数表示的、在对照小羊和用O.circumcincta完整膜蛋白的伴刀豆球蛋白A(ConA)结合部分免疫的小羊中用5000 O.circumcincta幼虫激发后的结果(横座标表示激发后的天数;纵座标表示组平均粪便卵数，平均数e.p.g(+/-SE));
图31 表示实施例8实验1中ConA结合部分的印迹(5%丙烯酰胺凝胶;非还原条件)，表明有Oc-gal-GP的存在。
泳道1 用花生植物血凝素检测的O.circumcincta的ConA S3部分泳道2 分子量标记物泳道3 用ConA植物血凝素检测的O.circumcincta的ConA S3部分图32 表示用荧光素共轭的花生植物血凝素对一般成熟O.circumcincta的恒冷切片的荧光染色;
图33 表示克隆HG3的核苷酸序列;
图34 表示派生的克隆HG3的氨基酸序列和人中性氨基肽酶的排列序列。两种序列都是从cDNA推断的。氨基酸一致程度是33%，相似水平是65%。使用威斯康星(Wisconsin)大学GCG库的BESTFIT程序可产生该排列序列;
图35 表示了证明克隆HG11与来源于各种后生动物寄生虫的并用Eco RI消化的基因组DNA杂交的Southern印迹。杂交在中等严格条件下进行。
泳道1 血矛线虫属泳道2 绿蝇属泳道3 细颈线虫属泳道4 牛蜱属实施例1H-gal-GP复合物的描术和生化特征1)SDS-PAGE概况。
通过花生植物血凝素亲合层析，并在脱盐步骤之后，用单Q基质(Pharmacia)进行阴离子交换色谱浓缩，从成熟血矛线虫属的Triton X-100提取物中分离用于此分析的H-gal-GP复合物(如下面的实施2和图4中所详细描述的)。保留在100和350mM NaCl之间的洗脱部分。一般典型的产量是Triton X-100提取物中总蛋白的约2%，等于每克蠕虫大约200μg的蛋白质。
当把H-gal-GP复合物在7.5或10%凝胶上、在非还原条件下进行电泳时，蛋白的组成是一组大约200kd或更大的多肽和大约47和50kd的浅染色谱带对(图1，泳道3)。尽管如此，如果使丙烯酰胺浓度降至5%，该高分子量物质就会分解成两个大约230和170kd的主要谱带(图2)。这些跨越一个不太清楚的205kd多肽和一个弥散染色区(图2)。较小的多肽见图1，3道在或接近染色前跑出的是未分解的带。
在还原条件下，未分级分离的H-gal-GP复合物在10%丙烯酰胺凝胶上分解成约8条带。大部分蛋白分解成45和50kd之间的3条带，但是在大约33、35、37、90和130kd也可见不清楚的带(图1，6道)。
对表1总结的未还原的多肽组合物进一步分析，方法是从5%非还原凝胶上(也即、在图2的230kd、170kd和染色前)切下3条主要带，在电洗脱和浓缩之后，将它们在还原条件下于10%丙烯酰胺上再电泳(图3)。该170kd带清楚地还原成2条大约45和48kd的重染色成份(图3，3道)。最大的谱带(230kd)更复杂，分离成分子量大约为130，90，48，40，和33kd的大约5个亚单位成份(图3，2道)。“染色前”谱带分解成大约50，47和35kd的3个成份(图3，4道)。其中前两个也在上面当非还原条件下于7.5或10%凝胶上电泳完整H-gal-GP复合物时的图1，3道中有描述。
上述谱带的蛋白全部代表本发明H-gal-GP成份。
表1对以kd表示表现分子量的H-gal-GP还原和非还原多肽的总结在非还原条件下电 在电洗脱和还原电泳之泳后观察到的成份 后的分解成份10%凝胶 5%凝胶 10%凝胶(230# =130,90,48,40,33((205)#)200-250= (190-200):#) 无数据((170# = 48*,45*,50*))47*) 染色前# = 50*,47*,35)35)＊这些多肽的N-末端氨基酸序列是确定的。
＃这些谱带被测试为实施例7羊实验5中的免疫原。注意205和190-200多肽是结合为一个部分进行测试的。
因此H-gal-GP含有一种最小量的10个清楚成份和在非还原条件下观察到的205和190-200kd物质。
2)4条谱带的N-末端氨基酸序列制备含有与图3的3道和图1的3道相同成份的凝胶并在膜上(ProBlott-Applied Biosystems)电泳。用考马斯(Coomassie)蓝染色之后，从膜上切下含有图1和3识别的多肽对的条并在Applied Biosystems Model 477 A 肽测序仪上测定每条的N-末端氨基酸组成，得到下列序列-图3，3道 45kdVal-Asp-Asn-Val-Phe-？-Pro-Asn-Val-Gly-Leu.(序列识别号3和4)48kdVal-Glu-Arg-Thr-Asp-Ala-Arg-Met-Asn-(也即-Glu-或-Asn-)(序列识别号5和6)图1，3道 47kdVal-Phe-Pro-His-Pro-Ile-Tyr-Asp-Tyr-Gln(序列识别号7)50kdAla-？-Gln-Thr-Val-Phe-Pro-His-Lys(序列识别号8)计算机检索没有发现与各种数据库储存的序列有任何显著同源性3)离子交换层析当在含有0.1%(V/V)Triton X-100的10mM Tris-HCl(PH7.4)中时，H-gal-GP复合物结合到已经用相同缓冲液平衡的Mono Q离子交换基质上。140和400mM NaCl之间的大部分H-gal-GP复合物被从柱子中洗脱出(图5a和b)。即使将其用于小扩大步骤，也没有发现此范围盐内亚成份谱带的分离。
4)植物血凝素结合a)在天然条件下使用各种与固相如琼脂糖珠交联的植物血凝素通过亲合层析从血矛线虫属膜的Triton X-100提取物中可分离H-gal-GP复合物(图10和11及实施例2)。
天然H-gal-GP复合物对特定植物血凝素的估计相对亲合力概述于表2。除Dolichos biflorus之外，对N-乙酰半乳糖胺有特异性的植物血凝素选择性地保留H-gal-GP。对Dolichos的阴性结果说明这种亲合力是对β而不α连接的N-乙酰半乳糖胺有特异性。
ConA、豌豆和莲植物血凝素也能保留H-gal-GP复合物这一发现说明它包括了带有甘露糖和/或岩藻糖的糖蛋白，而曼陀罗属和Bandeiraea的阴性结果表明它缺少含N-乙酰葡糖胺的结构(表2)。尽管如此，能够保留H-gal-GP的所有植物血凝素可以结它的全部成份，而不表现出对其亚成份的任何倾向性亲合力，如图6所示。
b)在分解和还原条件下为了确定H-gal-GP的哪一个亚成份是糖基化的，通过SDS PAGE使该复合物还原和分解，点样，用一组生物素化的植物血凝素检测。结果(图7)表明某些植物血凝素(如扁豆)结合大部分的谱带而其他的(如花生，helix Pomatia和琥珀酰小麦芽)更有选择性。除大豆外都很强地表现出130kd谱带和一种稍小的成份，给人的感觉是此区域内有两条带;某些，特别是扁豆、ConA和小麦芽在90kd谱带区中有一弥散染色区;其他的，特别是小麦芽、花生、jacalin、琥珀酰小麦芽和helix Pomatia，可散在地与考马斯蓝浅染色的大约60kd糖蛋白反应;ConA，jacalin，小麦芽和扁豆也很强地结合50kd谱带，而47kd谱带只能由扁豆表现出。
5)蛋白酶活性当用偶氮酪蛋白或血红蛋白作底物时H-gal-GP复合物表现出PH最佳值为4.0或6.0的蛋白酶活性(图7和8)。这一活性可被能强有力结合H-gal-GP的胃酶抑素所抑制。可利用后一特性通过亲合层析富集H-gal-GP复合物。
6)等电点在一种Miniphor制备性自由流动设备中用线性控制的PH梯度(2到9PH单位范围)使H-gal-GP复合物等电子聚焦。大部分复合物在PH2和7.3之间洗脱出。这一宽范围是典型的糖蛋白，其中可变性糖类残基将一个异种电荷引入该分子。
从捻转血矛线虫制备H-gal-GP复合物的两种方法这些方法概述于图4的流程图中，并在实施例2和3中有更详细的叙述。
基本上按Munn和Smith(WO90/11086)所述制备血矛线虫属膜(S3)的一种洗涤剂提取物。
实施例2在乙酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲的盐水中，于含有1mM EDTA和1mM PMSF作为蛋白酶抑制剂的酸性或中性条件下，使成熟的捻转血矛线虫在4℃均质化。在标准条件使匀浆以10，000g离心20分钟，用0.1%吐温20提取如此形成的沉淀物，并再次离心。重复此过程，然后用2% Triton X-100提取如此形成的沉淀小丸，并在标准条件下离心。使上清液以100，000g超速离心1小时，并将上清液(S3)通过一个0.22微米的过滤器，并用含有0.5M NaCl、0.01%NaN3、PH7.4的称之为10mM Tris-HCl的缓冲液稀释4倍。
用结合到琼脂糖珠上的各种植物血凝素使如此形成的稀释上清液S3进行植物血凝素亲合层析。在把稀释的上清液装柱之后，用几倍柱体积的缓冲液洗涤，然后用合适的糖洗脱植物血凝素结合的物质。
如图6所示例的在SDS-PAGE凝胶上观察测定结合到11种不同植物血凝素的每一种上的H-gal-GP的相对量。表2中的结果表明尽管几种植物血凝素可结合H-gal-GP，但只有对β连接的N-乙酰半乳糖胺有特异性的那些才可以特异性的结合H-gal-GP，并且这些当中花生和Jacalin可最有效地特异性结合。没有证明用任何植物血凝素可分离H-gal-GP的亚成份。
用花生或Jacalin植物血凝素，使蛋白H11OD和H45以及其他物质一起洗涤掉，而使H-gal-GP复合物仍被结合。它基本上以纯的形式由0.3或0.8M半乳糖从花生和Jacalin柱子中分别洗脱出(图10和11)。
使用小麦芽植物血凝素在用0.5M N-乙酰葡糖胺洗脱后可得到类似结果，例外的只是结合了一些H11OD并且H-gal-GP复合物一起被洗脱出(这是图11中装于Jacalin柱子时1道所示的物质)。
实施例3证明胃酶抑素是H-gal-GP的一种特异性和有亲合力的配体使存在于低PH、高离子强度缓冲液(即20mM乙酸钠，1M NaCl，PH5.5)中的上清液S3通过一个含有结合到琼脂糖珠上的胃酶抑素的柱子。大部分多肽，包括H11OD，不与这种基质结合(图12的1和2道)。用几倍柱体积的这种酸缓冲液洗涤之后，通过增加PH至8.5洗脱出小量的H-gal-GP和其他松散结合的物质。如果用含有低浓度、高电荷量洗涤剂(如1%十二烷基硫酸钠-SDS)的缓冲溶液洗脱柱子，所洗脱出的多肽的组成与H-gal-GP非常相似，只是通常在10%非还原凝胶上观察到的大约45kd的谱带对消失了(图12，4道)。如将柱子装载物取出，把等量份的琼脂糖在二硫苏糖醇(DTT)存在下与5%SDS一起孵育，洗脱出一富含此遗失谱带的馏份，表明这些谱带的留滞是非常亲合的(图13，4道)。在洗脱出的物质中没有检测出蛋白酶活性，表明该酶在SDS存在下无功能。
进行对照实验，从柱子中取出琼脂糖，在上述的酸洗涤阶段之后，通过反复离心洗涤，并再悬浮于单独的缓冲液中或是含有多达2%脱氧胆酸盐或多达0.1%SDS的缓冲液中。所有这些处理都没有从琼脂糖中去除大量的H-gal-GP，表明此现象不只是由于在柱子顶部物理吸附了不溶性蛋白。H-gal-GP不与某些植物血凝素琼脂糖柱子结合这一发现(表2，图5，2道)还证明与胃酶抑素琼脂糖的结合是有配体特异性的。
实施例4证明H-gal-GP位于捻转血矛线虫肠细胞刷状缘表面，并且它在此处是一种完整的膜糖蛋白。
(a)肠刷状缘定位ⅰ)用一组荧光标记的植物血凝素对成熟捻转血矛线虫的恒冷切片进行染色。发现花生和小麦芽植物血凝素都可选择性地使肠刷状缘染色(图14和15)。某些植物血凝素(如ConA)可染色大部分结构而另一些(如，Ulex)染色很少或不染色。这一结果说明肠细胞刷状缘比血矛线虫属的其他解剖结构含有更高密度的小麦芽和花生植物血凝素结合位点。由于H-gal-GP结合花生和小麦芽植物血凝素，可能这种糖蛋白存在于肠细胞的刷状缘。
ⅱ)将成熟捻转血矛线虫的恒冷切片与用H-gal-GP和弗氏完全佐剂一起免疫的羊的血清或与只用佐剂注射的对照羊的血清一起孵育(见实施例7，实验3和4有详细描述)。完全洗涤之后，将切片与用荧光素异硫氰酸盐结合的抗羊免疫球蛋白的马抗体一起孵育。进一步洗涤之后，通过荧光显微镜观察切片。
该切片与抗H-gal-GP血清的孵育显现出表皮下层及肠刷状缘膜的特异性荧光(图16)。用对照羊血清染色的切片没有发现特异性染色。这些结果说明H-gal-GP位于血矛线虫属的刷状缘膜上和皮下组织中。
ⅲ)从用H-gal-GP和弗氏完全佐剂一起免疫的羊或只用佐剂注射的羊身上获得的成熟血矛线虫属制备恒冷切片(见实施例7，实验3和4)。
将这些切片与荧光素异硫氰酸盐结合的抗羊免疫球蛋白的特异性抗体一起孵育。完全洗涤之后，如上所述在荧光显微镜下观察。
经过H-gal-GP免疫的某些(尽管不是全部)蠕虫切片显现出特异性荧光。这荧光位于肠细胞的刷状缘(图17)。对照羊的血矛线虫切片没有发现染色。
这一结果表明某些经H-gal-GP免疫的蠕虫在其肠细胞刷状缘膜上有羊免疫球蛋白包裹。因此这种膜上必定存在有H-gal-GP。没有观察到在前面一节所述“体外”试验中观察到的表皮下染色。可能是因为“体内”宿主免疫球蛋白不能与寄生虫的这部份解剖部位接触。
b)完整膜糖蛋白当用实验3中激发的抗-H-gal-GP血清对用过碘酸盐处理的含完整蠕虫的PBS、吐温和Triton X-100提取物的点样(也即，分别是图1.4中所述的S1，S2和S3)进行检测时，只在Triton X-100提取物中检测出H-gal-GP(图18)。这一结果通过一相对敏感的方法推断H-gal-GP既不是以可溶性胞质蛋白存在，也不是以外周膜蛋白存在，而且它需要Triton X-100的作用将其从细胞膜上游离下来。
该结果与植物血凝素结合性质总结于表2中，该结果足以证明H-gal-GP是完整的膜糖蛋白。
实施例5证明H-gal-GP复合物不同于蛋白对H11OD(WO90 11086)、蛋白复合物 H45(WO 90/11086)、45kd膜蛋白(WO 92/13889)或纤维蛋白溶解蛋白酶(EP-A-434909)a)H-gal-GP复合物、H11OD和蛋白复合物H45之间的区别ⅰ)植物血凝素结合H-gal-GP复合物、H11OD和H45复合物对某些植物血凝素的估计相对亲合力概述于表2中。除Dolichos biflorus不结合他们当中的任何一个外，对N-乙酰半乳糖胺有特异性的植物血凝素保留H-gal-GP复合物但不保留H11OD或H45复合物。
ⅱ)等电点H-gal-GP复合物比H11OD或H45复合物具有更低的等电点，可以通过离子交换层析与它们分离开。例如，很少H45复合物结合到已用10mM Tris-HCl(PH7.4)平衡的含有0.1%(V/V)Triton X-100的Mono Q上，这与Smith，Munn，Graham，Tavernor和Greenwood(International Journal for Parasitology 1993 23 271-280)的结果相一致。保留下的小部分可以用50mM NaCl在H11OD之前洗脱出。全部的H11OD由200mM NaCl解吸附，这在大部分的H-gal-GP复合物开始洗脱之前解吸附。
ⅲ)SDS-PAGE概况当在还原或非还原条件下电泳时在110kd处保持不变的H110D对(图1，1道和4道)，在两个位置(图1，1道与3道和4道与6道)与H-gal-GP复合物明显不同。尽管如此，因为还原条件可以明显地改变H45复合物的电泳形状(图1，2道与5道)，所以当将样本在未还原条件下(图1，2道与3道)而不是在还原条件下(图1，5道与6道)比较时，它与H-gal-GP复合物之间的区别更明显。
ⅳ)胃酶抑素结合H11OD或H45都不与胃酶抑素琼脂糖(一种H-gal-GP复合物容易结合的基质)结合。
b) H-gal-GP复合物与WO 92/13889中的45kd膜蛋白之间的区别ⅰ)植物血凝素结合在自然条件下H-gal-GP复合物与小麦芽植物血凝素结合(表2，图19)。在WO 92/13889中所提供的预防性抗原不与此植物血凝素结合，发明人专门利用此特性纯化45kd膜蛋白。
ⅱ)N-末端氨基酸序列WO 92/13889中公布的45kd膜蛋白的N-末端氨基酸序列与实施例1、部分2中所述的H-gal-GP复合物的45、47、48或50kd成份中的任何一个不具有类似的等同数据。
ⅲ)甚至当用SDS分离和用二硫苏糖醇还原之后变性时，变性抗原H-gal-GP复合物的预防能力可对羊有保护作用(见实施例7，实验4和5)。WO 92/13889中所述的45kd膜蛋白在荷兰猪中测试其变性形式时失去了它的预防性抗原能力。
c)H-gal-GP复合物与纤维溶解蛋白酶之间的区别ⅰ)底物特异性Cox、Pratt、Hageman和Boisvenue(Molecular and Biochemical Parasitology 1990 41，25-34)描述了一种来源于血矛线虫的纤维溶解蛋白酶，尽管只是从2个小羊试验得到不可信的数据，它们要求该酶具有预防性抗原能力(Cox，G.N.，Milhausen M.and Hageman R.1990 European Patent Application No.434909)。H-gal-GP复合物没表现出任何抗纤维蛋白原的蛋白水解活性(见表4和实施例6V)。
ⅱ)溶解度从血矛线虫的盐水提取物中获得由Cox等人1990年所述的纤维溶解蛋白酶。相对而言在盐水提取物中未检测出H-gal-GP复合物，该复合物只能用洗涤剂如Triton X-100从寄生虫中提取(图4.5)。
实施例6证明H-gal-GP具有天冬氨酰蛋白酶活性ⅰ)PH最佳值在初步试验中发现由花生植物血凝素纯化的H-gal-GP可水解偶氮酪蛋白尤其是偶氮胶原蛋白。用重迭0.1M乙酸盐、磷酸盐或Tris缓冲液确定此活性的最佳PH在4-9的PH范围(图8)。发现最佳活性在PH4.5和6.5之间。
ⅱ)抑制剂敏感性用花生植物血凝素纯化的H-gal-GP的4个分离制剂测试蛋白酶活性的抑制剂敏感性。在测试的所有制剂中酶活性几乎完全被胃酶抑素所抑制，这表明蛋白水解是由于一种天冬氨酰蛋白酶(表3)。
表3 与H-gal-GP和来源于O.circumcincta和O.ostertagi的等同酶相关的蛋白酶活性的抑制剂敏感性。
所表示的蛋 在抑制剂存在下抑制剂 白酶的类别 的百分活性保留H-gal-GP Oc-gal-GP Oo-gal-GPPMSF 丝氨酸(硫羟基) 100 104 84E64 硫羟基 87.8 101 1011,10邻二氮杂菲 金属 97 94 99EDTA 金属 97.8 ND ND胃酶抑素 羧基(天冬氨酰基) 8.5 23 0
(结果是用H-gal-GP 的4次分离观察和用每个Ostertagia种类的2次观察所得平均值，ND＝未测定)。
ⅲ)在胃酶抑素琼脂糖上的亲合层析使H-gal-GP(如实施例1部分1所述纯化的)通过一个用含有1M NaCl和0.1% V/V还原Triton X-100的 25mM乙酸钠缓冲液(PH4.5)平衡过的胃酶抑素琼脂糖柱子(Do.et al 1987，J.Biol.Chem.262 1037-1043)。在4.5-10PH范围广泛洗涤，解吸附很少的蛋白质。然而，用1%SDS洗脱可解吸附大部分的H-gal-GP(图20)。H-gal-GP不与结合有一个“阴性对照”配体(如Dolichos植物血凝素)的琼脂糖结合。这些结果，连同前面实施例3中所述的那些结果一起，说明H-gal-GP对胃酶抑素有很强的特异性，经证明是天冬氨酰蛋白酶的一个特征，至少是膜金属内肽酶的特征(Zoller，H1990，Handbook of enzyme inhibitors，Published by VCH，Weinheim，Germany)。在结合胃酶抑素琼脂糖之前或之后，H-gal-GP在5或10%非还原凝胶上的电泳表现是相同的(图20)。这一结果说明H-gal-GP是一种多聚酶复合物，一种胃酶抑素结合性蛋白酶的混合物，或者是这些酶及其前体的混合物。
ⅳ)底物凝胶分析预先在存在或不存在胃酶抑素的情况下孵育H-gal-GP，并在非还原条件下在含0.1% W/V明胶的7.5% SDS-PAGE凝胶上分离。电泳之后，通过在过量的Triton X-100中洗涤洗脱SDS，并且在磷酸盐缓冲液(PH6.0)中于37℃下使该凝胶保温过夜。通过考马斯兰反染色(Counterstaining)观察蛋白水解区。
结果是不稳定的，但是有一次蛋白水解与H-gal-GP复合物的主要高分子量谱带和大约45kd的较小成份均相关。所有活性区对胃酶抑素都是敏感的。另一次该活性似乎只于该复合物的170kd谱带，并且明显被胃酶抑素抑制(图21)。以往曾对天冬氨酰蛋白酶的这种可变观察结果有所叙述，并认为是由于对明胶的底物亲合力较弱的原因(Simkin，K.G.，Chapman，C.R.and Coles，G.C.1980.Experimental Parasitology 49.281-387)。因此可能 H-gal-GP具有与在非还原条件下观察到的该复合物的全部谱带相关的天冬氨酰蛋白酶活性。
ⅴ)H-gal-GP对天然血蛋白的亲合力使H-gal-GP与纤维蛋白原、白蛋白和血红蛋白以及偶氮酪蛋白一起孵育(全部都是1mg/ml，在缓冲液中，PH5.5)，然后加入等体积的1M高氯酸沉淀未消化的蛋白。通过使用水合茚三酮测试方法(Mathews，B.E.1977，Symposium of British Society of Parasitology 15103-119)检测释放的游离α-氨基氮监测蛋白水解。
结果表明H-gal-GP对血红蛋白具有明显的特异性(表4)，并且此活性的最佳PH是4.0(图9)。
表4 H-gal-GP对天然血蛋白和偶氮酪蛋白的亲合力底物 蛋白水解(在563nm的吸光率)纤维蛋白原 0.00血红蛋白 5.12白蛋白 0.77偶氮酪蛋白 0.55
ⅵ)免疫羊的血清对H-gal-GP蛋白水解活性的抑制。
将如实施例7实验3中所述的用H-gal-GP或佐剂免疫的小羊血清与等份的H-gal-GP一起孵育。接着用偶氮酪蛋白作为底物测定混合物中的蛋白水解活性。结果(表5)表明用H-gal-GP免疫激发抗H-gal-GP蛋白水解活性的特异性抑制应答，可能是由于抗体的作用。
表5 H-gal-GP的免疫血清抑制血清 蛋白水解的%抑制测试1 测试2对照小羊 0 2免疫小羊A 58 55免疫小羊B 51 59实施例7证明用H-gal-GP免疫的羊可抵抗捻转血矛线虫的激发用捻转血矛线虫的不同部分进行一系列保护试验。图22是概括用于制备5个实验中每组羊所用免疫原的方案的流程图。
保护实验的设计按照下面列出的时间顺序对19组羊进行5个免疫激发实验。在每个实验中实验组要使性别和体重平衡。
每组的计划动物数是6或7只，但是在激发前第9组和10组中各有一只羊因尿路结石死亡。用于免疫每组的抗原见表6和图22。每只羊用等剂量的蛋白免疫3次，而对于所有的对照组，只用佐剂加盐水，然后所有动物用5，000捻转血矛线虫幼虫激发。弗氏完全佐剂用于全过程，每一个接种是在每只后腿上以1或2ml的剂量肌内给药。如表7所详细描述的，每个实验之间小羊的年龄和处理的时间略有不同。
实验1目的是测定完整蠕虫膜的Triton X-100提取物的小麦芽植物血凝素结合部分的预防能力。
在激发对照羊中发现此免疫原可非常有效地抑制粪便虫卵数(图23)。同样，在宰杀时免疫组比对照组含有明显少的蠕虫，对照组含有显著高于正常的雄性与雌性比(表6)。
此结果与WO 92/13889的实验中所述的结果相反，在该实验中小麦芽植物血凝素结合部分对荷兰猪具有很差的保护作用。这种区别可能反映了所用激发系统类型间的区别或者反映了这样一个事实，即H11OD[大量H11OD也不能结合小麦芽(图19)]实际上是WO 92/13889实验中的主要预防性成份。
雌性血矛线虫比雄性对免疫作用更敏感这一发现以往在其他内脏膜抗原实验中曾有所报道(如，Smith，1993 Res Vet Sci 54 94-101)，并认为是由于这样一个事实，即由于雌性蠕虫较大，它比雄性摄取血液的速度的要快，从而接受了更高剂量比的毒性抗体。或者，这一发现的原因可能是由于这样一个事实，即雌性动物因排卵造成的合成代谢需求使得它们更易于阻滞营养收集酶。通过检查所回收蠕虫的性别比可为检测由这种方法成功免疫引起的作用提供其他的参数。
实验2由于已知组1中所用的小麦芽植物血凝素结合部分含有一些H11OD，它是一种已经表现出对血矛线虫具有高度预防作用的蛋白(Munn and Smith 1990)，因此本实验的主要目的是测试经离子交换层析已去除掉H11OD的小麦芽结合部分。为了检查非糖基化预防性膜蛋白存在的可能，再用不与小麦芽或Con A植物血凝素结合的部分免疫第二组(图22)。
两个免疫组比对照组一样具有更低的平均虫卵数(图24)，但是只有在小麦芽组，在大多数取样天数中有显著区别。没有一组免疫动物比对照组含有显著少的蠕虫，但在小麦芽组中所摄带蠕虫的雄性数比雌性数明显多(表6)。
在此实验中对照羊的组平均虫卵和蠕虫数与其他4个实验中(图24和23、25、及26，和表6)的对照值相比有实质性降低，有两只动物具有非常低的数值。这种很大的可变性(这可能反映了使用年长羊的原因)使得难于确定组3中表现出的保护作用(如果有的话)的显著性，组3需要重复实验。
实验3因此本实验目的是为了再测试年轻的、更易于感染的小羊中不含H11OD的小麦芽结合部分的功效。同时还发现由于此配体不与任何可检测的H11OD结合，因此用花生植物血凝素通过亲合层析可以更简单地制备该相同部分(图22)。因此，在此实验中对花生结合部分(也即H-gal-GP)和H11OD的预防能力进行了比较。
两组免疫小羊的粪便虫卵数与对照组比较大大地降低(图25)，并且从它们中回收的蠕虫数显著减少，雄性蠕虫与雌性比异常地高(表6)。
可以得出结论即H-gal-GP是对血矛线虫的一种预防性抗原。
实验4本实验的目的是证实用天然H-gal-GP获得的预防性结果，并确定该复合物在分离或在还原和分离状态下是否保留预防活性。
因此，通过与0.5% SDS(2.5∶1W/W SDS∶蛋白)在25℃下保温1小时来分离等份的H-gal-GP。通过用相同量的SDS与2.5mM二硫苏糖醇(DTT)结合作为还原剂一起在100℃保温5分钟进行分离使第二批相同等份量的H-gal-GP变性。组10和11用以这些相关方式处理的H-gal-GP免疫，而组9接受相同但未处理的等份天然H-gal-GP(表6)。
在全部三个免疫组(图26;表6)和对照组中发现粪便虫卵排泄量和蠕虫数显著减少，但是此效果在天然和只有SDS的组中最显著。如前述一样，雌性蠕虫比雄性对免疫作用更敏感。可以得出结论，当用SDS分离该复合物或用SDS分离并用DTT还原使之变性时，H-gal-GP的预防性表位在很大程度上都没有受到影响。这一结果与WO 92/13889中用45kd膜糖蛋白获得的结果相反，说明H-gal-GP的亚单位多肽可以在其分离和在SDS丙烯酰胺凝胶上提取之后单独地测试。
实验5因此本实验目的是测试已经通过非还原SDS-PAGE分离的H-gal-GP不同多肽亚成份的预防性抗原能力。
采用按上述实验4所述的用SDS分离的500和200μg的H-gal-GP复合物分别免疫组13和14。组15至18用在非还原条件下由SDS-PAGE分离复合物之后、从5%凝胶上切下的H-gal-GP单一成份免疫(图22)。如图2中所示。用230kd谱带成份注射组15，用弥散190-205kd区成份注射组16，用170kd谱带成份注射组17，和用染色前谱带注射组18(图2)。将含有合适谱带的凝胶块再悬浮于一合适体积的稀释剂中并与等体积的佐剂均化。计算分级分离的H-gal-GP的量以便使组15至18接受的与其相应的多肽剂量等于它们存在于500μg H-gal-GP中的量(也即等于组13)。只用佐剂免疫激发对照组(组19)。
除一只动物(4号羊)之外，用SDS分离的H-gal-GP免疫的两个阳性对照组都可以抵抗激发感染。这表现在与对照组比较虫卵数和蠕虫数减少以及雄性蠕虫比例增加，如果4号羊不计算在内的话，对组13的保护数据是-蠕虫79%和虫卵87%(18-35天的平均数)。对于组14，相同结果是蠕虫70%和虫卵84%。可以得出结论，即组14所用剂量减少没有引起任何差异，并且组13的结果与上面实验4获得的结果相似。
在用H-gal-GP的不同亚单位谱带免疫的组中发现有更大的个体差异性。尽管如此，结果表明用从凝胶上切下的个体亚单位谱带可以获得保护。在这些组中，组16(190-205kd弥散带)和18(染色前)得到最佳保护。
在最佳亚单位组中的保护作用似乎比用完整复合物免疫的组中的保护具有更小的一致性。这可能是因为电泳分离过程在某种程度上损伤了预防性表位或者因为必须是一个以上的亚单位结合使用才能获得一致性效果。
从这5个实验可以得出结论，H-gal-GP不论是在其天然状态下还是分离状态或甚至是在还原和分离状态下，都是一种新的对血矛线虫的一致性有效预防性抗原复合物。
表6羊保护实验1-4回收的血矛线的组平均蠕虫数和性别比率实验编号组 只数抗原剂量*平均数±SE %·雄性1 1 7 小麦芽结合 200 1086±326a62.3±1.9a2 7 无(对照) - 3068±416b48.6±1.5b3 6 无 H110D的小麦芽 140 1809±115a63.1±2.8a2 4 7 未结合的植血凝素 140 1387±350a49.6±4.1b5 7 无(对照) - 1644±344a51.5±1.3b6 7 H110D 100 518±133a66.8±5.4a3 7 7 花生植物血凝素(H-gal-GP) 200 1765±167b64.2±3.1a8 7 无(对照) - 3744±187c50.1±0.4b9 5 天然H-gal-GP 200 1052±424a75.5±6.2a10 5 H-gal-GP+SDS 500 902±295a65.7±3.2a4 11 6 H-gal-GP+SDS+DTT 500 1466±476a70.6±5.4a12 6 无(对照) - 3705±627b56.1±5.4b＊每只羊每次免疫所注射的μg蛋白。
每个实验的每栏中有不同标记的数值有显著性差异。
表7羊实验详细设计中的区别实验编号小羊的月龄a加强剂时间b激发间隔c处死日期d1 2 4和7 1 232 8 3和6 2 283 2 3和6 2 344 5 3和6 2 355 3 3和6 2 34或35a第一次注射时以月表示的月龄;b第一次“疫苗接种”后的周数;
c在第三次“疫苗接种”和激发之间的周数;d当处死羊时的激发后天数。
实施例8胃线虫属种类中的相同酶通过图4所示方法提取Ostertagia Circumcincta或Ostertagia ostertagi，然后用花生植物血凝素进行亲合层析，产生的蛋白复合物通过其SDS-PAGE方案(图27)判断它与H-gal-GP有广泛相似性。象H-gal-GP一样，两种提取物都对偶氮酪蛋白和羊血红蛋白表现出蛋白酶活性，其pH最佳值在4和6.0之间(图8和9)，并且该活性可被胃酶抑素特异性抑制(表3)。
将等量的Oc-gal-GP加入到试管中，该试管中含有已结合到胃酶抑素或花生植物血凝素或dolichos植物血凝素上的琼脂糖珠，使试管在4℃下轻轻振荡3小时。沉淀小珠，并保留未结合的上清液。经3次洗涤后将小珠在最小体积的SDS-PAGE样本缓冲液中煮沸，并使之沉淀。将从这一步骤得到的含有已结合到琼脂糖上的物质的上清液与未结合的上清液一起在非还原的5% SDS-PAGE凝胶上进行电泳，并印迹到固定(immobilon)膜上，用生物素化的花生植物血凝素检测。
图28中所述结果表明Oc-gal-GP可特异性地结合到花生植物血凝素和胃酶抑素琼脂糖上，因为它不与已结合了阴性对照配体(dolichos植物血凝素)的琼脂糖结合。
用按实施例7实验1和2中所述的H-gal-GP免疫的羊血清与每种胃线虫复合物的蛋白表位交叉反应(图27)。
综合这些结果说明，捻转血矛线虫、O.circumcincta胃线虫和O.ostertagi胃线虫具有一个共同的含胃酶抑素可抑制性蛋白酶活性的抗原相关性含半乳糖糖蛋白复合物的家族。
在下面的实验中描述了更具体的结果。
实验1证明用Ostertagia circumcincta胃线虫的完整膜蛋白免疫的小羊可预防用此寄生虫的激发设计一种实验，其中对用Ostertagia circumcincta完整膜蛋白的伴刀豆蛋白A(ConA)结合部分免疫的小羊用该寄生虫的感染性幼虫激发，并测定实验中产生的与激发对照组相关的保护程度。
除另有说明外，全部的抗原制备过程是在冰上或4℃进行，离心步骤是以10，000g离心15分钟。使冷冻的成熟O.circumcincta融化，并在缓冲液(磷酸盐缓冲的盐水，PH7.4，含下列蛋白酶抑制剂-1mM EDTA、1mM PMSF和1mM N-乙基顺丁烯二酰亚胺)中匀浆。使匀浆离心，把沉淀小丸再悬浮于含0.1%(v/v)吐温20的匀浆缓冲液中。再重复一次此步骤，使洗涤过的含蠕虫膜的小丸再悬浮，然后通过在含2% Triton-X-100、但不含EDT的匀浆缓冲液中充分混合2小时进行提取。使提取物再次离心，并使得到的上清液以100，000g超速离心1小时。使这种称作S3(图29，1道)并含有溶解的完整膜蛋白的上清液通过一个0.22μm孔的滤器，用缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.4，含0.5m NaCl和0.01% w/v NaN3)稀释4倍，并装入ConA-琼脂糖柱上。除去未结合的物质(图29，3和4道)。完全洗涤之后，用200mM α-甲基甘露糖苷/α-甲基葡糖苷洗脱结合的部分。(用29，2道)。通过凝胶过滤(Sephadex G-25，Pharmacia)使此馏份脱糖和脱盐，通过在Mono Q(Pharmacia)上离子交换进行浓缩，并在冷的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中稀释，然后用等体积的弗氏完全佐剂乳化。
将在设计可除掉线虫寄生虫的条件下圈养的14只Suffolk杂交小羊分成2组，每组平衡性别和体重，分成6只免疫的和8只对照小羊。在大约7个月龄时用100μg抗原给免疫组的每只羊注射，而对照组只注射佐剂。在每只后腿的半膜肌和半腱肌中注射1ml疫苗。3和6周之后每组再接受相同的接种。在最后一次加强之后两周，使全部小羊口服5，000个三期O.circumcincta幼虫进行激发。在激发后的2周开始每周计数两次粪便虫卵数，在激发后5周处死动物以计数总蠕虫数。
在整个实验中免疫小羊的组平均粪便虫卵数比对照组中的虫卵数明显低(表8和图30)。对实验的21天和35天之间的组平均数进行比较表明免疫组的虫卵排出量减少了80%以上。对皱胃内容物和粘膜消化物的亚样本(5-10%)进行蠕虫检查。所找到的蠕虫没有接近4期的幼虫，所有的蠕虫已成长到第5期或成熟期。对组蠕虫携带数进行比较表明免疫羊中的携带数低大约60%，有统计学的显著区别(表8)。
表8免疫和对照羊中粪便虫卵数和总胃线虫携带数激发感染后的天数组羊 14 18 21 25 28 32 35 蠕虫数;a免疫的 1 0b45 198 30 108 30 162 26732 0 0 1 8 36 24 15 3213 0 0 1 12 27 15 48 9054 0 0 2 24 33 15 36 3225 7 207 315 162 108 63 207 25636 0 1 63 72 198 135 189 2914平均数 1.17 42.2 96.7 51.3 85.0 47.0 109.5 1616对照 7 0 342 459 72 495 387 450 38308 6 198 450 297 720 432 558 49799 13 261 585 297 603 927 603 329210 11 432 441 252 252 693 612 399311 7 279 405 207 378 486 * 380612 9 396 297 369 1134 495 459 418913 3 27 189 108 72 162 198 208814 27 333 486 450 288 531 639 4568平均数 9.62 283.5 414.0 256.5 493.0 514.1 502.7 3843P值 <0.05 <0.01 <0.01 <0.01 <0.02 <0.01 <0.01 <0.01
a-总蠕虫数b-每克粪便中的虫卵数＊-无样本P值-T检验得出的免疫组和对照组相关平均数间的差异显著性实验2证明该预防性抗原包括含有Ostertagia circumcincta半乳糖的糖蛋白复合物(Oc-gal-GP)a)将实验1中用于免疫羊的ConA结合部分在10%还原SDS-PAGE凝胶上电泳，并印迹到固定(immobilon)膜上。用生物素化的花生植物血凝素检测该印迹，所用的花生植物血凝素是一种对Oc-gal-GP有特异性的配体(图28+29)。阳性结果(图31)表明Oc-gal-GP存在于预防性抗原制剂中。
b)为了制备Oc-gal-GP，就S3期对成熟O.circumcincta进行处理，按照上面实验1所述将其泵入并通过一个含有花生植物血凝素琼脂糖的柱子。用几倍体积的缓冲液洗涤柱子，然后用0.5M的半乳糖洗脱结合的物质得到Oc-gal-GP。
如上所述制备Oc-gal-GP的印迹，不同的是首先用高碘酸处理它们以破坏糖类表位，并减少可能的交叉反应。(Wood ward，Young and Bloodgood，1985，Journal of immunological Methods143-153)。用实施例8、实验1的免疫血清或者用从O.circumcincta自然免疫的羊获得的胃淋巴样本(Smith，Jackson，Jackson，and Williams 1985，Journal of Comparative Pathology 95235-275)检测该印迹。从实验1得到的抗ConA-结合抗原的抗血清与Oc-gal-GP反应但对于从自然免疫动物中得到的淋巴样本未见有反应。这些结果支持上述实验2(a)中的发现，即Oc-gal-GP存在于用来免疫该羊的ConA结合部分中，并且表明Oc-gal-GP也是一种“隐蔽”抗原。
实验3证明Oc-gal-GP是一种内脏膜蛋白制备O.circumcincta的恒冷切片并用荧光素结合的花生植物血凝素染色。在内脏上发现有强荧光，但对于未鉴别的内部结构也有不太强的染色(图32)。由于花生植物血凝素特异性地结合Oc-gal-GP，此结果表明Oc-gal-GP是一种内脏膜蛋白。
实施例9存在于毛圆线虫属种类中的等同酶在胃酶抑素存在下使成熟透明毛圆线虫提取物中的蛋白水解活性减少40%。另外，在非还原条件下通过明胶底物凝胶分析观察到的蛋白水解活性配对物(Mw大约为205kd)活性在胃酶抑素存在下明显减少。这些发现表明透明毛圆线虫也含有与血矛线虫(Haemonchus spp.)和胃线虫(Ostertagia spp.)中相似的天冬氨酰蛋白酶活性。
实施例10证明 H-gal-GP含有一种中性内肽酶1、检测与H-gal-GP相关的中性内肽酶样活性方法用偶氮酪蛋白作为底物在一种微量检测系统中测定蛋白酶活性。使H-gal-GP(大约5μg的20μl溶液)与200μl无菌的不含有抑制剂(对照)或含最终浓度为1mM抑制剂的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.0)在37℃下预先保温30分钟。所用的抑制剂制备成100mM的水溶液原液，例外的是使4-羟基汞基苯甲酸盐(4HMB)和胃酶抑素溶于甲醇中。试验用的抑制剂是二硫苏糖醇(DTT);L-半胱氨酸;还原的谷胱甘肽;4HMB;N-乙基马来酰亚胺;EDTA;1，10菲咯啉和胃酶抑素，并且全部购自Sigma公司。预先孵育之后，加入20μl偶氮酪蛋白(5mg/ml无菌蒸馏水;Sigma)并使反应混合物在37℃下保温过夜。在每个抑制剂试验中还包括含无菌水而不含H-gal-GP的平行空白对照。检测进行两次。加入等体积的1M高氯酸(BDH化学公司)终止反应，并保留在冰上15分钟以沉淀未消化的蛋白，然后用微量离心机以11000g短暂离心。用“Monarch”微离心分析仪(Instrumentation Laboratory，Warrington，UK)测定上清液的OD405。减去合适试剂空白之后，抑制程度表示为与对照反应相比剩余的百分活性。
2、分离中性内肽酶编码λgt11克隆并特征化1.从成熟蠕虫中分离多聚腺苷酸+mRNA从实验性感染的羊的皱胃获得成熟的捻转血矛线虫，用盐水洗涤，即刻在液氮中冷冻。用已预先冷冻到-70℃的杵和研钵将冷冻的寄生虫研磨成细粉，并溶于5ml提取缓冲液(4M异硫氰酸胍、25mM枸橼酸钠、0.5%(w/v)肌氨酸(sarcosyl)和0.7%(v/v)2-疏基乙醇的蒸馏水溶液)中。加入5ml酚/氯仿之后通过使溶液涡流5分钟，将其剧烈混合，然后在冰上保温10分钟。通过在4℃下以10000g离心30分钟分离水相和有机相，保留水相，并加入等体积的异丙醇，在-20℃冷却1小时，使RNA沉淀。将RNA沉淀成小丸，再溶于提取缓冲液中，然后按上述方法再沉淀。用70%乙醇洗涤小丸，干燥，溶于0.5ml无菌蒸馏水中。
采用Efstratiadis等人(1976，Cell，7 279-288)所述的方法，通过寡聚-脱氧胸苷-纤维素色谱分离多聚腺苷酸+mRNA。用乙醇沉淀多聚腺苷酸+mRNA，干燥，再溶于10至20μl无菌蒸馏水中。
2.cDNA合成和λgt11库的制备使用从Amersham公司购买的药盒按厂家说明从1μg多聚腺苷酸+mRNA制备双股cDNA。使用AMV反转录酶和用随机六核苷酸引物引导的反应来合成第一条链。用RNase H和大肠杆菌DNA聚合酶1合成第二条链。最后，用T4 DNA聚合酶使cDNA末端变钝。用Amersham药盒(RPN 1280)将cDNA连接到噬菌体λgt11(λgt11)上。简言之，就是把EcoR1转接体连结到cDNA库，通过凝胶过滤去除未联结的转接体分子，保留＞500bp的cDNA用于连接到λgt11臂上。在使用T4多核苷酸激酶的反应中使“转接”的cDNA末端磷酸化，并将不同量(100，75和40ng)的这种cDNA末端连接到λgt11臂上(1μg)。将连接反应混合物体外存放(Boehringer)，在异丙基硫代吡喃型半乳糖(IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷(X-gal)存在下把等份的混合物在大肠杆菌Y1090上平面培养，以能够测定重组体滴度。每个连接反应产生大约2×105个重组噬菌体。使用羊抗H-gal-GP抗血清通过免疫筛选105重组噬菌体，选择表达H-gal-GP成份的噬菌体。
3.免疫筛选把λgt11 cDNA表达文库以每升琼脂/青霉素培养基1000噬菌体的密度接种于90mm佩特里细菌培养皿中的大肠杆菌(E.coli)Y1090的平坦培养基上。使培养皿在42℃下保温直至出现可见的菌斑(4小时)，然后加上一层已预先在10mM IPTG中饱和并空气干燥的硝化纤维素滤纸。使带有滤纸的培养皿在37℃保温过夜。第二天去掉滤纸，在TBST(50mM Tris-碱，150mM NaCl，pH8.0，含有0.05% v/v吐温-20)中充分洗涤，然后在5%马血清的TBST液中孵育1小时使其阻滞。然后将滤纸与用含5%马血清的TBST稀释1/500的羊抗-H-gal-GP抗血清一起孵育4小时。用TBST进一步充分洗涤之后，将滤纸与过氧化物酶结合的马抗羊免疫球蛋白抗血清(1/200 TBST)一起孵育2小时，洗涤，并与DAB显影液(10mg二氨基联苯胺-HCl的50ml H2O溶液，含有50μl 30%过氧化氢，Sigma)一起孵育观察免疫阳性噬菌体。将免疫阳性噬菌斑挖出并再接种，通过连续性的再接种/免疫筛选循环使噬菌斑纯化。筛选105噬菌体产生7个阳性噬菌体。通过抗体洗脱对此进一步分析。
4.抗体洗脱将重组噬菌体以每90mm平板103的密度在E.coli Y1090上接种，并在42℃下保温4小时。在平板上覆盖一层IPTG饱和硝化纤维素滤纸，并在37℃保温过夜。去掉滤纸，用TBST充分洗涤，再与羊抗H-gal-GP血清一起孵育4小时。通过两次使用洗脱缓冲液(5mM甘氨酸，500mM NaCl，0.2%吐温20，pH2.3)每次2分钟洗脱结合抗体。加入200μl 1M Tris-HCl(pH7.4)使产生的抗体溶液(4ml)呈中性，用5%马血清的TBS液(不含吐温20的TBST)稀释3倍，并与通过7.5% SDS-PAGE分离的H-gal-GP Western印迹条一起孵育过夜。进一步的洗涤，与第二种抗体的孵育和用DAB溶液的观察都如上所述。
5.对免疫阳性噬菌体中cDNAs插入物的聚合酶链反应(PCR)放大的Southern印迹分析使用正对λgtll中EcoR1克隆位点旁侧区的引物(saiki et al，1988 Science 239 487-491)通过PCR放大反应获得制备量的插入cDNA。简单地说，就是从挖出的噬菌斑中洗脱噬菌体颗粒到一0.5ml oppendorf试管中的50μl无菌蒸馏水中。在一个冷冻/融化循环之后，按Saiki等人(1988)所述将25μl的这种上清液用于PCR反应。使引物在55℃退火。使PCR产物在0.8%琼脂糖凝胶上或在7.5%连续聚丙烯酰凝胶块上分级分离，并通过溴化乙锭染色(琼脂糖)或银染色(聚丙烯酰胺)观察产物。
另外，在琼脂糖凝胶上对cDNA插入物的PCR放大产物进行分级分离，并通过Maniatis等人所述的毛细管转移技术(1982，in Molecular Cloninga Laboratory manual Cold Spring Harbour Laboratory)将其Southern印迹到尼龙膜上(Hybond-N，Amersham)。如上所述通过PCR放大噬菌体HG3制备用于检测印迹的DNA(100ng)，并用毛地黄毒苷(Digoxygenin)方法按照厂家说明(核酸标记和检测药盒，Boehringer)进行标记。在高度严格条件下(5×SSC，0.5%W/V阻断剂，0.1% W/V N-月桂基肌氨酸，0.02% W/V SDS的50%甲酰胺溶液)于42℃杂交过夜。在杂交溶液中加入最终浓度为25ng/ml的探针DNA。在高度严格洗涤(最后洗涤2.1×SSC，0.1% SDS，65℃下15分钟)之后，通过使用碱性磷酸酶结合的抗-毛地黄毒苷进行免疫检测和酶催化的显色反应(Boehringer)观察杂交反应情况。
6.序列分析按照厂家详细说明把PCR放大的cDNA插入物亚克隆到PCR1000载体(In-Vitrogen)中。利用双脱氧链终止方法(Sanger et al，1977，Proceedings of National Academy of Science 79 5463-5467)测定DNA序列。用Pharmacia T7测序药盒进行测序反应，并严格按药盒详细说明进行引物退火和测序反应。用Tris/乙酸盐/EDTA电泳缓冲液在6%聚丙烯酰胺、50%尿素凝胶平板上以50W恒定功率对反应产物分级分离多达6小时。电泳之后，将凝胶浸泡于乙酸∶甲醇∶水(5∶5∶90)中40分钟，在Whatman 31滤纸上干燥，然后于室温下通过放射自显影过夜检测分解的DNA片段。将DNA和推断的氨基酸序列与GENBANK和EMBL数据库中存在的序列比较。
结果1、H-gal-GP中的中性内肽酶-生化检测使用偶氮酪蛋白作为底物通过鉴别蛋白酶抑制剂敏感性检测与H-gal-GP相关的中性内肽酶样活性。典型分析的结果见表9。
表9 在PH7条件下由H-gal-GP进行的偶氮酪蛋白蛋白水解对一组蛋白酶抑制剂的敏感性抑制剂 %活性保留无抑制剂对照 100 100二硫苏糖醇 48 44半胱氨酸 0 0谷胱甘肽 87 854-羟基汞基苯甲酸盐 88 91
N-乙基马来酰亚胺 74 77EDTA 25 101,10菲咯啉 26 23胃酶抑素 75 85%抑制表示为与无抑制剂对照组相比剩余的百分活性。两种分离分析的结果是对同一批H-gal-GP表示的。
该酶活性可被螯合剂EDTA和1，10菲咯啉以及硫醇类试剂二硫苏糖醇和半胱氨酸所抑制。其活性不受4-羟基汞基苯甲酸钠、N-乙基马来酰亚胺、胃酶抑素和谷胱甘肽的影响。这种抑制的表现与以前报道的哺乳动物来源的中性内肽酶的抑制(由Kenny报道，1977，InProteinese in mammalian Cells and tissues，EdBarret，A.J.Elsevier)是一致的。
2.H-gal-Gp阳性λgt11重组体的分子分析免疫筛选105λgt11重组体产生7个免疫阳性噬菌体。抗体洗脱实验表明只有从命名为HG3的重组噬菌体中洗脱出的抗体才可清楚地识别从还原SDS-PAGE凝胶制备的Western印迹条上的H-gal-GP。从非重组λgt11中洗脱的抗体不识别表明HG3反应特异性的H-gal-GP成份。用从HG3放大的插入DNA探测从其他免疫阳性噬菌斑放大的插入DNA的Southern印迹，重组HG11给出一阳性杂交信号。在HG3和HG11中的cDNA插入物的大小分别为212bp和1019bp。
测定了HG3的全部核苷酸(图33)和氨基酸(图34)序列。HG3与人中性内肽酶表现出33%的一致性和65%的相似性，也即非常显著的同源性。对HG11的序列测定仍在继续进行，但已识别出与HG3对应的区，并且表现出96%核苷酸水平的一致性。因此HG11似乎是HG3的变异体。这种变异可能是由于在不同菌株和蠕虫不同生长周期之间存在有自然生物变异的原因。而且，还可能存在在不同来源的菌株中或在寄生虫发展过程中特异表达的多酶形式(同功酶)。
实施例11表明在各种后生动物寄生虫中存在有中性内肽酶-编码基因;克隆HG11与从EcoRI消化的后生动物寄生虫中获得的基因组DNA杂交为了从各种后生动物寄生虫(血矛线虫属、绿蝇属、细颈线虫属、和牛蜱属)中制备基因组DNA，将2克已在液氮中快速冷冻的每种寄生虫在液氮中研磨成细粉。将细粉缓缓加入到25ml的溶解缓冲液中(0.05M Tris-HCl(pH8.0)，0.1M EDTA，1% W/V肌氨酸(sarkosyl)，0.05mg/ml蛋白酶K)，并在65℃下保温两小时。用1倍体积的酚和氯仿提取该悬浮液两次，再用两倍体积的氯仿提取两次，然后乙醇沉淀。将沉淀物再悬浮于20ml的Tris、EDTA缓冲液(TE，PH8.0)中，于4℃在振荡床上过夜，然后在一升TE中透析两次。再与最终浓度为20μg/ml的无DNase的I型RNase A(Sigma)在37℃下保温1小时，然后如上所述用酚-氯仿提取1次，用氯仿提取1次，然后乙醇沉淀除去RNA。用70% V/V乙醇洗涤沉淀物两次，并如上所述再悬浮于1ml的TE中。
在37℃下用EcoRI消化5μg的基因组DNA过夜，然后在1% W/V琼脂凝胶上于Tris-乙酸盐缓冲液中以每道5μg进行电泳。按Maniatis等人所述(1982)通过毛细管转移到Hybond-N膜(Amersham International)上对凝胶进行Southern印迹分析。根据厂家的建议用紫外光将DNA固定在膜上。
用SacI和BamHI消化HG11克隆，使其电泳，回收一种750bp的片段。用一种购自Promega Bioteoh的Nick Translation药盒根据厂家的说明用32P-dCTP放射标记该插入物。通过旋转柱色谱将标记的DNA与未结合的标记物分离。
使Southern印迹在杂交溶液(6×SSC，50%甲酰胺，5×Denhardt′s溶液，0.1%SDS)中于28℃下预先杂交3小时，然后在放射标记探针的存在下于28℃、中等严格条件下杂交过夜。在室温下洗涤印迹10分钟，接着于42℃下第二次洗涤1小时，均是在2×SSC、0.1%SDS中洗涤。放射自显影之后，在0.4N氢氧化钠中于42℃下孵育30分钟以去除探针印迹。探针的去除可通过放射自显影过夜得到证实。
然后用相同的探针在低严格条件下与印迹再杂交。如上所述进行预杂交和杂交，不同的是使用24℃的温度。洗涤也如同上述，不同的是第二次洗涤在24℃下进行30分钟。
用HG11探针进行Southern印迹分析表明不仅与血矛线虫属来源的DNA结合，而且也与其他后生动物寄生虫血矛线虫属、绿蝇属、细颈线虫属、牛蜱属的DNA结合，如图35中的1-4道所分别表示的。这可以在中等和低严格条件下进行杂交得到证实。
权利要求
1.一种预防性后生动物寄生虫抗原或其抗原片段、成份或前体以及其具有抗一种或几种后生动物寄生虫的预防性抗原活性的功能等同衍生物、类似物或变异体，该抗原的特征在于能够结合胃酶抑素，并且其天然形式是一种完整膜蛋白或蛋白复合物。
2.一种如权利要求1所述的抗原或其抗原片段、成份、前体或功能等同衍生物、类似物或变异体，其进一步的特征在于(a)具有蛋白水解活性;(b)其天然形式位于寄生虫内脏的肠刷状缘;和(c)能够结合小麦芽植物血凝素和对β-连接的N-乙酰基半乳糖胺有特异性的植物血凝素。
3.一种如权利要求1所述的抗原或其抗原片段、成份、前体或其功能等同衍生物、类似物或变异体，其天然状态能够结合ConA、豌豆、莲、Helix Pomatia，花生和Jacalin植物血凝素。
4.一种如权利要求1至3中任何一项所要求的抗原或其抗原片段、成份或前体或其功能等同衍生物、类似物或变异体，其中该抗原的进一步特征在于具有天冬氨酰蛋白酶样和/或中性内肽酶样活性。
5.一种如权利要求1至4中任何一项所要求的抗原或其抗原片段、成份或前体或其功能等同衍生物、类似物或变异体，可以从血矛线虫属、胃线虫属或毛圆线虫属的蠕虫中获得。
6.一种如权利要求1至5中任何一项所要求的抗原或其抗原片段、成份或前体或其功能等同衍生物、类似物或变异体，具有表1中所列出的SDS-PAGE分子量分布，或其成份。
7.一种如权利要求1至6中任何一项所要求的抗原或其抗原片段、成份或前体或其功能等同衍生物、类似物或变异体，该抗原可以从血矛线虫的内脏获得，并且具有在非还原条件下于5%凝胶上通过SDS-PAGE测定为大约190至205kd的分子量，或具有在非还原条件下于10%凝胶上通过SDS-PAGE测定的大约为35或45至50kd的分子量。
8.一种如权利要求1至7中任何一项所要求的抗原或其抗原片段、成份或前体或其功能等同衍生物、类似物或变异体，可用于在人或非人类动物中激发抗后生动物寄生虫的免疫应答。
9.一种如权利要求1至7中任何一项所要求的一种后生动物寄生虫抗原和其成份片段前体和功能等同衍生物、类似物或变异体的用途，可用于制备疫苗组合物，以用于在人或非人类动物中激发抗后生动物寄生虫的免疫应答。
10.一种可用于在人类或非人类动物中激发抗后生动物寄生虫的免疫应答的疫苗组合物，包括一种或多种如权利要求1至7中任何一项所要求的抗原或其成分、片段、前体或功能等同衍生物、类似物或变异体，还包括可药用载体或稀释剂。
11.一种如权利要求10的组合物，包括一种或多种所说的抗原和一种或多种选自抗原H11OD和H45及其成份的其他抗原。
12.一种激发人或非人类动物体内抗后生动物寄生虫的免疫应答的方法，包括给所说动物施用如权利要求10或11所定义的疫苗组合物。
13.一种抗体或其抗原结合片段，它能够选择性地结合如权利要求1至7中任何一项所定义的抗原或其抗原片段、成份或前体或其功能等同衍生物、类似物或变异体，或结合所说结合抗原抗体的基因型。
14.一种制备用于激发人或非人类动物体内抗后生动物寄生虫感染的疫苗的方法，所说的方法包括制备含有如权利要求1至7中任何一项所定义的至少一种预防性抗原的所说寄生虫的提取物，通过将所说抗原结合到一种包含该抗原特异性结合配体的固定相上并从所说固定相中进一步洗脱所说抗原，可从中纯化所说抗原。
15.一种在后生动物寄生虫中识别预防性抗原的方法，包括使用一种携带有对N-乙酰基半乳糖胺有特异性的一种或多种植物血凝素的固定相将所说寄生虫的完整膜部分进行亲合层析。
16.一种如权利要求14或15中所述的方法，其中所说的特异性结合配体或植物血凝素是花生或jacalin植物血凝素。
17.一种核酸分子，包括一种编码如权利要求1至7中任何一项所定义的抗原或其抗原片段、成份或前体或其功能等同衍生物、类似物或变异体的核苷酸序列。
18.一种如权利要求17所要求的核酸分子，它包括一种或多种基本上与图33(序列识别号)所示的全部或部分核苷酸序列对应的核苷酸序列或包括一种与所说序列基本同源或与所说序列杂交或其变性的序列。
19.一种含有如权利要求17或18所定义的核酸分子的表达或克隆载体。
20.一种含有如权利要求17或18所定义的核酸分子的宿主细胞或转基因生物。
21.一种制备如权利要求1至7中任何一项所要求的抗原或其抗原片段、成份或前体或其功能等同衍生物、类似物或变异体的方法，包括在可表达所说抗原的条件下，培养一种含有可编码全部或部分所说抗原的一种核酸分子的宿主细胞，并回收如此产生的所说抗原。
22.一种预防性后生动物寄生虫抗原或其抗原片段、成份或前体和其具有抗一种或多种后生动物寄生虫的预防性抗原活性的功能等同衍生物、类似物或变异体，该抗原的特征在于具有天冬氨酰蛋白酶样和/或中性内肽酶样活性，并且其天然形式是一种完整的膜蛋白或蛋白复合物。
23.一种预防性后生动物寄生虫抗原或其抗原片段、成份或前体和其具有抗一种或多种后生动物寄生虫的预防性抗原活性的功能等同衍生物、类似物或变异体，该抗原是(或构成部分的)可从血矛线虫内脏获得的完整膜蛋白或蛋白复合物，并且具有在非还原条件下于5%凝胶上通过SDS-PAGE测定的大约190至205kd的分子量或具有在非还原条件于10%凝胶上通过SDS-PAGE测定的大约35或45至50kd的分子量。
全文摘要
本发明提供了新的后生动物寄生虫抗原、编码，它们的核酸及其在控制由蠕虫和其他后生动物寄生虫、尤其是家畜动物中的蠕虫和节肢动物寄生虫引起的疾病中的应用。本发明特别提供了预防性后生动物寄生虫抗原或其抗原片段、成分或前体和其具有抗一种或多种后生动物寄生虫的预防性抗原活性的功能等同衍生物、类似物或变异体。该抗原的特征在于能够结合胃酶抑素，并且其天然形式是一种完整的膜蛋白或蛋白复合物。本发明还提供了具有天冬氨酰蛋白酶样和/或中性内肽酶样活性特征的抗原。
文档编号A61P33/00GK1088217SQ9311688
公开日1994年6月22日 申请日期1993年7月21日 优先权日1992年7月21日
发明者W·D·史密斯, S·K·史密斯, J·默里, S·利德尔, D·P·诺克斯 申请人:皮特曼-穆尔公司