专利名称：促肝康颗粒剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种促肝康颗粒剂，它是在哺乳动物肝脏经Hemoflow F50柱的提取物中加入保护剂和增效剂组成，本发明所述的促肝康颗粒剂对于防止肠道内毒素对细胞的损害，促进免疫功能有明显效果。
注射用肝细胞生长素研制和临床应用国内已有报导，但由于其制备工艺要求严格，有效成份利用率低而使其成本昂贵；现有的各种保肝营养液一般都是配制型的，即使是提取物，也都不带有生物活性；本发明的目的在于利用动物肝脏经Hemoflow F50柱的提取物，再配以其它的辅助成份，提供一种具有广谱营养效果，尤其对肝脏器官有特别明显保护作用的营养性颗粒剂。
本发明所述的促肝康颗粒剂主要成份是从SD或Wislan大鼠、乳牛、乳猪、乳羊的新鲜肝脏中制取。并以幼龄猪、幼龄牛、幼龄羊、幼龄SD、或Wistan大鼠离体不超过6小时的新鲜肝脏为最佳。本发明所述的促肝康颗粒剂的具体制法是将除去肝膜和韧带后切碎的新鲜肝脏按1克肝加入2～4克蒸馏水的比例在高速捣碎机中制成匀浆，离心沉淀取上清液，然后用Hemoflow F50柱截取分子量小于50000道尔顿以下的成份，进行多肽含量的测定，调整多肽含量不小于5毫克/毫升，所制备的提取物采用正压超滤除菌。之后，向上述提取物中加入一定量的保护剂和增效剂，保护剂为上述提取物的
(上述采用柱截取或采用的正压超滤只是实现本发明的方法之，实际上，只要能满足本发明所述的要求，其它装置或方法也能为本发明所采用。)0.001～0.2％，增效剂为上述提取物的0.5～2.4％。再经制粒(过14目筛)，过20目和50目筛进行整粒而成淡桔黄色均匀颗粒。
上述的保护剂可以从现有技术中选用，其目的是保护促用康颗粒剂在常温下能保持生物活性；保护剂和增效剂的作用除以上所述外，还能使促肝康颗粒剂在人体肠胃中尽可能少的受胰蛋白酶的破坏。本发明所述保护剂或增效剂可从市场购。
本发明所述的促肝康颗粒剂经临床试用，对肝功能有障碍者具有显著疗效并且无副作用；并能明显改善患者疼痛、乏力、腹胀等症状及增加食欲。
下面将结合对本发明所述的促肝康颗粒剂的分析结果以及利用各图表对本发明所述的促肝康颗粒剂作进一步说明。用高效液相色谱对促肝康颗粒剂的组份分析结果表明促肝康颗粒剂主要组份峰与肝细包生长素的色谱图谱基本一致，说明促肝康颗粒剂和肝细胞生长素存在相似的色谱行为，但是其有效成份的含量和氨基酸以及微量元素的种类和含量有明显的提高；促肝康颗粒剂在波长180～380mm的扫描图谱中存在两个吸收峰，196.7及257.5吸收值分别为2.43及0.478，表明促肝康颗粒剂的主要成份是多肽和核酸。
下表为促肝康颗粒剂所含氨基酸测定结果及和肝细胞生长所含氨基酸的比较肝细胞生长素促肝康颗粒剂名称含量W％ 含量W％Asp 1.39 1.52-1.64Thr 0.39 0.42-0.47Ser 0.72 0.78-0.82Glu 3.14 3.40-3.77Pro 0.94 1.03-1.11Gly 1.23 1.33-1.45Ala 1.18 1.28-1.4Cys 微量Val 0.84 0.91-1.00Met 0.56 0.60-0.62Ile 0.67 0.73-0.78Leu 1.66 1.82-1.84Tyr 0.48 0.51-0.57Phr 0.73 0.81-0.82Hls 0.58 0.63-0.71Try 2.48 2.61-2.88Lys 1.11 1.22-1.35Arg 6.96 7.00-7.03
下表为促肝康颗粒剂所含微量元素分析结果及和肝细胞生长素所含微量元素的比较肝细胞生长素 促肝素名称含量(μg/ml)含量(μg/ml)Fe 7.89.86Se ＜0.05 ＜0.07Mg111.5 111Zn 15.817.4Na＞500 ＞500Ca 35 41Mn 0.400.41Co ＜0.005痕量Cu 0.760.83K＞2000 ＞2000通过上述表可表明，促肝康颗粒剂含有K、Na、Ca、Mg以及比正常人血清高数十倍的Zn和微量的Se，同时含有数十种对人体有益的氨基酸；但由于更加充分的利用了原材料，本发明所述促肝康颗粒剂含有的微量原素和氨基酸，尤其是对人体有益的微量元素和氨基酸的含量要比现有的产品高出约十个百分点。
本发明所述的促肝康颗粒剂经高效液相色谱分析高效液相色谱的条件为色谱仪Hplc-P4000型(US)色谱柱SPHERI-5RP-18 5V220×4.6mm(U.S)流动相甲醇∶水＝10∶901(V/V)检测器Speetrer fo cusλ＝25 40nm流 速0.8ml/min进样体积20μl试样浓度每ml中含2mg的溶液。
其色谱图为
图1色谱图表明，本发明所述的促肝康颗粒剂有明显促进单层细胞DNA合成的高活性生物活性物质，这种生物活性物质除包括肝细胞生长素所含的生物活性物质外，还含有新的生物活性物质。
图2为本发明提供的促肝康颗粒剂紫外扫描图谱，图谱表明λ＝204.5nm及256.0nm处的吸收峰分别为3.1048和1.0299，表明主要成份为肽及少量核酸。
本发明提供的促肝康颗粒剂与现有技术相比，具有以下优点1.本发明所用的动物肝脏提取物分子量为5万以下道尔顿，这样可获得比肝细胞生长素多的活性物质，提高了促肝康颗粒剂中活性物质的相对活性和相对浓度，又保留了肝细胞内其它物质的综合利用，原料利用率高；2.制备方法更加简单，成本低，仅为注射液成本的四分之一，产量高易于推广应用；3.避免了注射液的过敏和副作用，便于长期常温贮存和运输；4.本发明由于含有一定量的保护剂和增效剂，使得促肝康颗粒剂的生物活性免受胰蛋白酶的破坏，由于其生物活性相对稳定，在体内滞留时间相对延长，更加容易为人体所吸收；5.该促肝康颗粒剂能刺激肝细胞DNA的合成，促使肝细胞再生，防止肠道内毒素对肝细胞的损害；刺激胰岛素分泌，促使与肝细胞结合增加，利于肝细胞修复；大量的支链氨基酸的存在，促使肝昏迷后的苏醒；多量的微量元素锌，促进免疫功能；而对脾、肾、和骨髓等的细胞则无作用。
6.本发明提供的促肝康颗粒剂具有降低ALT、消除黄疸及改善肝脏病变的功能，可改善患者疼痛，乏力，腹胀等症状及增加食欲。
实施例1-3采用前述的制备方法制取肝脏的提取物，将提取物的分子量控制在5万道尔顿以下，将保护剂和增效剂按一定比例加入配成促肝康颗粒剂，检测其氨基酸和微量元素的含量氨基酸名称 含量W％1 2 3Asp 1.521.571.64Thr 0.420.470.44Ser 0.770.790.82Glu 3.403.773.32Pro 1.031.011.11Gly 1.331.451.37Ala 1.281.311.41Cys 微量Val 0.880.911.00Mat 0.600.630.62Ile 0.730.690.78Leu 1.871.851.84Tyr 0.510.540.57Phr 0.810.810.82Hls 0.630.670.71Try 2.612.742.88Lys 1.221.351.28Arg 7.007.007.03
微量元素 含量(μg/ml)1 2 3Fe 9.869.84 9.88Se 0.070.07 0.06Mg 108 111114Zn 17.117.4 16.8Na 551 504533Ga 41 40 43Mn 0.410.41 0.44Co 痕量Cu 0.830.80 0.79K 19932054 2104注1——批号940301的促肝康颗粒剂2——批号940302的促肝康颗粒剂3——批号940303的促肝康颗粒剂上述实施例1、2、3、所制得的促肝康颗粒剂体外促进肝细胞DNA合成试验如下试验方法活性测定法DNA掺入法(由广医微生物教研室协助测定)试剂1.Hank’；s液(1)取氯化钠160.0g、氯化钾8.0g、硫酸镁(MgSo4H2o)2.0g，加水使溶解，加2.8％的氯化钙100ml，加水稀释至1000ml。(2)取磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2o)3.04g、磷酸氢二钾1.2g、葡萄糖20.0g，加水使溶解，加入0.4％的酚红溶液(0.4g酚红，加氢氧化钠液＜0.1mol/l＞10ml使溶解，加水稀释至100ml)100ml加水稀释至1000ml。
临用前取(1)、(2)各50ml，加水稀释至1000ml，115℃30分钟灭菌，冷至室温后，加无菌6.5％碳酸氢钠液调节PH值在7.2-7.6，即得。
2.肝素RPMI-1640液取肝素1支(12000μ)，RPMI-1640液120ml使溶解，即得。
3.RPMI-1640液取RPMI-1640 1.0g，加水使溶解成100ml，用6.5％碳酸氢钠调PH值至7.2-7.4，即得。
4. 10％小牛血清RPMI-1640液取小牛血清10ml，加入RPMI-1640液90ml中，即得。
5.3H-Tdr；取1mic/ml3H-Tdrlml，加RPMI-1640液至50ml，即得。
6. 10％三氯醋酸液取三氯醋酸10.0g加水使之溶解成100ml，即得。
7. 1％台盼兰试液取台盼兰1.0g，加水使溶解成100ml，即得8.肝细胞悬液的制备无菌取SD雄性大鼠(200-250g)肝脏一只，用PH值7.2Hank’s液冲洗，用手术剪除去包膜，然后剪成1mm3以下小块，加入含有肝素(100μ/ml)的RPMI-1640液用玻璃珠轻轻抽打，静置5min，悬液用150目筛网过滤，离心1000rpm，5min，去上清液，再加RPMI-1640液稀释，同法洗细胞三次，用1％台盼兰染色活细胞率＞90％，最后加入10％小牛血清RPMI-1640液，37℃，5％CO2条件下培养8-12小时，取出，1000rpm，5min离心，去上清液，用RPMI-1640液同法洗三次，取适量无小牛血清RPMI-1640液搅拌匀成悬液，制成每1ml含1.9×105细胞数即得。
供试品溶液的制备取本品加RPMI-1640液制成每1ml含300μg，即得。
测定法取细胞，接种于96乳细胞培养板内，每孔0.1ml，另加入供试品0.1ml，设阳性对照孔、空白对照孔(不加供试品)，37℃、5％CO2条件下培养24小时后加入0.05mlRPMI-1640液(含3H-Tdrluci)/孔，再以同样条件培养6小时。收集细胞于49型玻璃纤维滤膜上，用10％三氯醋酸洗涤5次，测定3H-Tdrcpm，按下式计算，即得。 (实验组与空白组均按6重复孔均数±SD表示数值)(本发明中所列数据、图谱行为都是采集乳猪肝脏并按本发明所述的方法提取后进行的检测，但其它哺乳动物，如乳牛、羊等，有着相同和相近似的成份和谱图行为，在此不一一列举。)试验结果促肝细胞生长素颗粒剂活性测定结果
△与*组比较P＞0.05△与空白参照组比较P＜0.01试验结论上表显示三个批号的促肝细胞生长素颗粒剂体外均能够促进体外培养单层肝细胞DNA合成，与肝细胞生长素颗粒剂原料药比较，促进DNA合成作用相似，显示了良好的生物学活性。
权利要求
1.一种促肝康颗粒剂，其特征在于它是在哺乳动物肝脏经Hemoflow F50柱的提取物中加入保护剂和增效剂组成，提取物分子量均在50000道尔顿以下，含有多种微量元素和氨基酸。
2.按权利要求1.所述的促肝康颗粒剂，其特征在于所含的微量元素如下微量元素含量(μg/ml)Fe9.86-9.84Se0.05-0.07Mg108-114Zn16.8-17.4Na551-504Ga40-43Mn0.41-0.44Co痕量Cu0.83-0.79K 1993-2054
3.按权利要求1.所述的促肝康颗粒剂，其特征在于所含的氨基酸如下 含量W％Asp 1.52-1.64Thr 0.42-0.47Ser 0.78-0.82Glu 3.40-3.77Pro 1.03-1.11Gly 1.33-1.45Ala 1.28-1.4Cys 微量Val 0.91-1.00Met 0.60-0.62Ile 0.73-0.78Leu 1.82-1.84Phr 0.81-0.82Hls 0.63-0.71Try 2.61-2.88Lys 1.22-1.35Arg 7.00-7.03
4.按权利要求1.所述的促肝康颗粒剂，其特征在于促肝康颗粒剂含有明显促进单层细胞DNA合成的高活性生物活性物质，这种生物活性物质除包括肝细胞生长素所含的生物活性物质外，尚含有新的生物活性物质。下列色谱作为其特征高效液相色谱的条件为色谱仪Hplc-P4000型(US)色谱柱SPHERI-5RP-18 5V220×4.6mm(U.S)流动相甲醇∶水＝＜10∶901(V/V)检测器Speetrea fo cusλ＝254nm流 速0.8ml/min进样体积20μl试样浓度每1ml中含2mg的溶液。
5.按权利要求4.所述的促肝康颗粒剂，其特征在于所述的生物活性物质的紫外扫描图谱特征是在λ＝204.5nm及256.0nm处的吸收峰分别为3.1048和1.0299，表明主要成份为多肽及少量核酸。
6.按权利要求1.所述的促肝康颗粒剂，其特征在于所述的原料哺乳动物肝脏以幼龄猪、幼龄牛、幼龄羊、幼龄SD或Oistan大鼠离体不超过6小时的新鲜肝脏为最佳。
全文摘要
本发明涉及一种对于防止肠道内毒素对细胞的损害，促进免疫功能有明显效果的促肝康颗粒剂，它是在哺乳动物肝脏经Hemoflow F50柱的提取物中加入保护剂和增效剂组成，该促肝康颗粒剂分子量小于50000道尔顿，提供了一种具有广谱营养效果，尤其对肝脏器官有特别明显保护作用的营养剂；经临床试用、对肝功能有障碍者可降低ALT、消除黄疸及改善肝脏病变且无副作用，并能明显改善患者疼痛、乏力、腹胀等症状及增加食欲。
文档编号A61K35/37GK1146896SQ9510587
公开日1997年4月9日 申请日期1995年5月30日 优先权日1995年5月30日
发明者张宜俊, 郑国池, 孔祥平 申请人:中国人民解放军第458医院