专利名称：用于自身免疫性疾病的诊断及治疗的肽的制作方法
技术领域：
本发明述及由HLA-B27的α1,α2功能域或人类角蛋白Ⅵ衍生而来的肽，以及这种特定的由HLA-B27α1,α2功能域或人类角蛋白Ⅵ衍生而来的肽在HLA-依赖性自身免疫疾病的诊断及治疗中的应用。
自身免疫性疾病，如风湿，银屑病，多发性硬化，溃疡性结肠癌及自身免疫性眼色素层炎，是当机体防御系统(免疫系统)不再耐受作为机体自身一部分的结构，而是将其作为外侵病原体来攻击时产生的一种疾病。将导致机体自身组织损伤甚至损毁，引起疼痛及生理功能失常的症状例如风湿病中出现关节僵化；银屑病中出现炎症，皮肤剥落甚至有时出现大面积皮肤损伤；多发性硬化中出现遗传性低角质化，意志丧失及语言障碍；溃疡性结肠癌中出现的严重腹泻及营养失调，甚至致命的肠穿孔；眼色素层炎中出现的视力减退甚至导致失明。
多数自身免疫病症为慢性进程，有时能够维持在某一病程期，有时则持续恶性发展。免疫系统损毁的组织很少能够再生。风湿病中，自身攻击免疫反应导致疼痛的关节炎症及关节退化，最终导致功能丧失。银屑病中出现的皮肤损伤，有时是大面积的，有强烈的搔痒感并且十分明显，常引起病人心理问题，给人际交往带来问题。
这些自身免疫性疾病发生的原因大多还未知。一些病例中，伴有细菌或病毒感染，因而误导免疫系统，这也许是引起自身免疫性疾病的主要原因。在风湿病和银屑病的病理形成过程中，细胞免疫反应起着重要作用，与此同时，也能检测到抗体反应。
传统用于自身免疫性疾病治疗的手段不但影响免疫系统自身反应(自身攻击)部分，同时抑制了抵抗外侵病原体或肿瘤细胞的免疫反应细胞。传统的免疫抑制剂如皮质类固醇，环孢霉素A及细胞生长抑制剂不但引起全身免疫抵抗力下降，肿瘤发病率增加，而且有许多非免疫的，有时危及生命的副作用。
自身免疫性疾病的遗传素因可能与特定的主要组织相容性抗原(MHC)或称HLA(人类白细胞抗原，最初是以移植抗原而发现的)间存在统计学关系。其机制应建立在免疫系统将病原抗原(细菌和病毒)与自身HLA抗原混淆的基础上。
HLA-B27抗原是一个特例，它经常与特定的某些自身免疫性疾病如虹膜炎，银屑病及风湿病如Bechterew′s病(关节强硬性脊椎炎)，银屑病性关节炎以及男孩常发的青少年类风湿关节炎伴随出现。
在自身免疫性眼色素层炎疾病中已发现(G.Wildner,&R.Thurau,Eur.J.Immunol.24,2579-2585(1994))HLA-Ⅰ类抗原在病理形成过程中并不作为抗原呈递因子，而是本身作为抗原，以肽的形式，由HLA-Ⅱ类或其它分子呈递。自身攻击免疫反应中的组织特异性也可以用与特异自身抗原交叉反应来解释。(例如，眼色素层炎疾病中的视黄醛S抗原)与本发明相联系，HLA抗原在病理形成中起主要作用的自身免疫性疾病称之为“HLA-依赖”自身免疫性疾病。
在风湿病综合征(关节强硬性脊椎炎，反应性关节炎及银屑病关节炎)中的HLA-依赖疾病中，迄今为止，最可能的抗原是由HLA-Ⅰ、Ⅱ类分子呈递的细菌蛋白，有时倾向于HLA-B27，或其它(关节特异性)Ⅱ型胶原，而它与HLA-B27间的联系尚未建立起来。链球菌蛋白及角化细胞蛋白可能是银屑病中的抗原。
风湿病及银屑病病人对HLA-B27和/或皮肤角质素序列肽的细胞免疫反应表明这些肽是潜在的自身抗原肽，即不再被识别为自体肽或自身肽。对HLA-B27前两个功能域的免疫反应在1986年即有报道(G.Wildner et al,Abstract 2.33.13,Sixth Intenational Congress ofImmunology,Toronto,Canada,6 toll July 1986；G.Wildner,disswetation,LMU munich,1987；G.wildner et al.,Mol.Immunol.26,33-40,1989)。
近年来，为恢复存在于自身耐受与病原体抵抗间的正常平衡，进行了许多免疫系统控制的尝试。着眼点不再是非特异的抑制所有的免疫反应，而是只影响作用于自身攻击的免疫反应。因此，其副作用如增加感染几率或肿瘤形成率很有希望能够避免。
在此联系中，比较已知的能引起自身免疫性疾病或急性慢性移植排斥的生理机制十分重要。这些机制曾为寻求治疗这些病症的方法而深入研究过。现在认为细胞毒作用，特别是CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞，在急性移植排斥中起主要作用，而在慢性移植排斥中细胞毒作用作为次等重要因素。CD4阳性T淋巴细胞，尤其是辅助性T淋巴细胞和抑制性T淋巴细胞，细胞因子在细胞免疫反应水平上更为重要。以目前的知识，自身免疫性疾病与慢性移植排斥的情况类似。
与抑制急性移植排斥方法不同，治疗自身免疫性疾病的方法不需要由调节细胞毒性T淋巴细胞活性主导，而是可以在细胞和体液免疫反应两种水平进行更广泛的尝试。
作为解决上文所述与HLA-依赖自身免疫性疾病相关的方法，特别是HLA-Ⅰ类相关、HLA-Ⅱ类相关的自身免疫性疾病，尤其是些特异与HLA-B27相关者，对于本发明而言，包括应用特定的由HLA-B27α1,α2功能域或人类角蛋白Ⅵ衍生而来的肽来诊断及治疗HLA-依赖性自身免疫疾病的方法。
1986,1987及1989年，G.Wildner等人(loc.cit.)描述了包含由HLA-B27α1,α2功能域衍生蛋白的融合蛋白。由HLA-Ⅰ类分子α1,α2功能域衍生而来的肽被Krensky等人在WO 88/05784中，CA.Clayberger和A.M.Krensky在WO 93/17699中，C.A.Clayberger等人的WO 95/26979中描述，并为C.A.Claybergeh和A.M.Krensky在Current Opinion in Immunology 7,644-648(1995),E.Nossner等人在JExp.Med.183,339-348,(1996)上发表。
文件WO 88/05784,WO 93/17699,WO 95/26979,CurrentOpinion in Immunology(1995,loc.cit)和J.Exp.Med.(1996,loc.cit)发表的特定类肽是为-调节病人的细胞毒性T细胞的细胞毒性/细胞溶解活性，特别是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，对于病人来说，称为--抑制CTL活性，·通过将肽结合到CTL上，特别是通过T细胞受体，抑制由CTL引起的靶细胞溶解(可能是通过与CTL正常结合的配体的竞争(Current Opinion Immunol.(1 995),a.a.0.)和/或·通过与HSP70热休克蛋白家族成员，以与其它免疫调节复合物如FK506和环孢霉素A行为类似的方式结合，这是因为探测与相关T细胞表面有关的热休克蛋白并不容易(J.Exp.Med.(1996),a.a.0.)·通过抑制/阻断CTL分化(WO 93/17699)，或--将MHC限制性靶细胞敏化，使其具有CTL/刺激CTL活性，可能通过在MHC介入条件下将肽呈递给CTL，利用将CTL与相应肽结合来鉴定CTL，或诊断特异CTL的出现，-利用将特异CTL群体与相应肽结合使其从混合T细胞中分离出来。
所有文件将所描绘肽的申请领域定位于移植药物，特别是与急性移植排斥相结合(见Clayberger等人的WO 95/26979,C.A.Claybergeh和A.M.Krensky的Current Opinion in Immunology 7,644-648(1995),E.Nossner等人的J.Exp.Med.183,339-348,(1996))以及在病毒，细菌和寄生虫感染的治疗和瘤形成的治疗上。
文件WO 88/05784和WO 93/17699仅概括提到利用肽诊断和/或治疗自身免疫性疾病，而没有具体化，例如并未考虑到特殊的自身免疫性疾病。但是，正如上文解释过的，在自身免疫性疾病中，特异辅助性T淋巴细胞和抑制性T淋巴细胞中CD4阳性T淋巴细胞的活性，细胞因子和其它机制在细胞免疫反应水平上比细胞毒性T淋巴细胞活性更为重要，就治疗自身免疫性疾病而言，一种其它的，被设想可能具有更广谱活性的肽是必要的。
用肽代替完整抗原蛋白或由蛋白的衍生长链片段具有一些说服性的原因，特别是在计划给予人或动物时采用完整抗原蛋白或衍生长链片段带来了以下的困难1)所谓“加工”，即免疫活性片段(表位)的精确删除并不总在受体机制中起作用。
2)无论怎样，抗原“重组”合成需要很大的花费和努力。
3)抗原一般从自然组织中分离。在此联系中，细菌，病毒和/或病毒体感染很易出现，可能由(逆)病毒或细菌DNA引起继发转染。
4)抗原蛋白即使在干燥形式和特殊、精细的保存条件下也可能仅有很短的保存时间。
5)敏化的危险，当将抗原用于人类或动物时引起典型的食物或接触过敏，这是由于浆细胞及嗜酸性细胞表面的IgE很易发生交叉反应。
正如前文所述及，本发明所基于的物质是在由HLA-B27α1,α2功能域或人类角蛋白Ⅵ衍生而来的肽在HLA-依赖性自身免疫疾病的诊断及治疗中的应用中获得的。
这里所考虑的自身免疫性疾病包括HLA-Ⅰ类相关和HLA-Ⅱ类相关自身免疫性疾病，特别是，但并不排除，风湿病综合征的疾病，例如关节炎，类风湿和反应性关节炎，银屑病关节炎和青少年类风湿关节炎，以及虹膜炎，银屑病及眼色素层炎。本发明上文定义的肽能够应用于HLA-B27相关自身免疫性疾病的诊断与治疗，这种病也将述及。病症中存在与HLA-B27抗原的联系，例如，关节强硬性脊椎炎(Bechterew′s病)和上文述及的风湿病综合征特殊病症，特别是青少年类风湿关节炎和银屑病关节炎，以及虹膜炎，眼色素层炎和银屑病的特殊病症。需要强调的是上文定义的肽，其适用性并不局限于诊断和治疗和/或抑制HLA-B27相关自身免疫性疾病。相反，它可以扩展到那些与Ⅰ类HLA抗原相关的自身免疫性疾病，例如非HLA-B27相关的青少年类风湿关节炎和银屑病关节炎。其适用性也可以扩展到HLA-Ⅱ类相关自身免疫性疾病，例如特异的HLA-Ⅱ类相关的关节炎。
本发明所用的肽包括由HLA-B27α1,α2功能域或人类角蛋白Ⅵ衍生而来的肽，更精确的说，是核心序列B27PA,B27PA*,B27PB,B27PC和Ker333或其衍生物肽B27PA:Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Tle-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln-Thr-Asp-Arg-Glu-Asn-Leu-Arg-Thr,肽B27PA*:Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln,肽B27PB:Leu-Leu-Arg-Gly-Tyr-His-Gln-Asp-Ala-Tyr肽B27PC:Arg-Val-Ala-Glu-Gln-Leu-Arg-Ala-Tyr-Leu-Glu-Gly-Glu-Cys-Val肽Ker333:Leu-Asp-Leu-Asp-Ser-Ile-Ile-Ala-Glu-Val-Lys-Ala-Gln-Tyr-Glu-Glu-Ile-Ala-Asn-Arg-Ser依照由H.Szots,G.Riethmuller,E.Weiss和T.Meo在Proc.Natl.Acad.Scj.USA83,1428-1432(1986)提供的HLA-B27氨基酸序列，-肽B27PA与HLA-B27的α1功能域内60-80氨基酸相对应，-肽B27PA*与HLA-B27的α1功能域内60-72氨基酸相对应，-肽B27PB与HLA-B27的α2功能域内109-118氨基酸相对应，和-肽B27PC与HLA-B27的α2功能域内151-165氨基酸相对应。
本发明发现仅有所述核心序列中不连续分布的有限数量的氨基酸是抑制或治疗HLA-依赖性自身免疫性疾病的肽活性所必需的。因此，在这方面不重要的氨基酸位点可以被进一步删除，插入，转换及替代，而不损坏肽所述及的生物学活性。基本的氨基酸的衍生及修饰(甲基化，酰胺化，糖基化，结合脂肪酸残基(饱和及不饱和脂肪酸残基)，等)也包括在本文中。
肽相对于核心序列的改变的关键是使形成的肽表现出一种空间或称三维结构，基于本发明之目的。此结构并不比上文定义序列形成的带电和/或表面结构逊色。更优越的是这种改变肽的空间结构在其表面结构和电荷分布上与上文述及核心肽或至少其中为生物活性所必需的核心肽之片段是一致的。
因此，本发明可用的肽及由B27PA,B27PA*和Ker333而来的衍生物可用下文的公式表示BL1-X-BL2-Y-BL3-Z-BL4-W-BL5和BL1-X-BL2-Y-BL3-Z简写BL代表与下文表中所给信息相关的氨基酸嵌段，可以包括1-8个氨基酸。单独的氨基酸或氨基酸集团(X,Y,Z和W)定位在这些氨基酸之间，它们很有特点并且很可能在上文述及生物活性中起重要作用。肽B27PAh和Ker333是以X,Y,Z和W的氨基酸位置为基础分别从其全序列中选出来的。
但是，还需考虑到在核心序列中的其它氨基酸在肽的生物学活性中也很重要。正如上文所述及的，在本文中很重要的是所得肽的空间或三维结构与上文述及核心肽或至少一部分一致。
在上文所提及B27PA和/或B27PA*的核心序列中-X(在肽的2位；相当于Szots等人报道的61位(a.a.O.))相当于天冬氨酸(Asp)，-Y(在肽的7位；相当于Szots等人报道的66位(a.a.O.))相当于异亮氨酸(Ile)，-Z(在肽的11-13位；相当于Szots等人报道的70-72位(a.a.O.))相当于三肽序列Lys-Ala-Gln，或Lys-Ala-Glu,-W(在肽的20位；相当于Szots等人报道的79位(a.a.O.))相当于精氨酸(Arg),所有这些在替代中优先考虑同系(例如，结构和化学性质相近的)的氨基酸或氨基酸集团。
在上文提及的Ker333核心序列中，残基X,Y,Z和W对应于由B27PA和B27PA*衍生而来的肽中相同的氨基酸，例如，-X(在肽的2位；)相当于天冬氨酸(Asp),-Y(在肽的7位；)相当于异亮氨酸(Ile),-Z(在肽的11-13位；)相当于三肽序列Lys-Ala-Gln，或Lys-Ala-Glu,-W(在肽的20位；)相当于精氨酸(Arg),所有这些在替代中优先考虑同系的(例如，结构和化学性质相近的)的氨基酸或氨基酸集团。
在下文表中给出的嵌段序列BL的氨基酸和肽与肽B27PA,B27PA*和Ker333中相同位置的氨基酸一致；其中BL1是1到2个氨基酸的嵌段，如Trp或Leu，正如在肽B27PA,B27PA*和Ker333的同样位置上所出现的。设计的BL2包括一个含有4到5个氨基酸的嵌段。还可以想象这两个嵌段的进一步转换，修饰和替代结果。同样情况，BL3到BL5肽嵌段分别含有3到4个，6到8个和1到2个氨基酸。尽管在BL的位置上，可以在维持所需生物学活性的同时进行更广泛的替代，但在这种情况下，替代中仍优先考虑B27PA,B27PA*和Ker333核心序列的同系氨基酸，正如前文多次述及的，最重要的是产生空间结构，此结构的并不比上文定义序列形成带电和/或表面结构逊色，更优越的是这种修饰肽的空间结构在整体上，或至少在长度上多于6，最好是8个氨基酸，其表面结构和电荷分布上与上文述及核心肽或相关片段的是一致的。BL1XBL2Y BL3ZBL4W BL5名称1-2as (2) 4-5as (7)3-4as (11,12,13) 6-8as (20) 1-2asAsp Ile Lys-Ala-GlnArg或Lys-Ala-GluTrp ″ Arg-Glu ″ Cys-Lys-Ala″Thr-Asp- ″ ThrB27PA-Thr-Gln Arg-Glu-或Asn-LeuIleTrp ″ Arg-Glu ″ Cys-Lys-Ala″ - - - B27PA*-Thr-GlnLeu ″ Leu-Asp ″ Ala-Glu-Val″ Thr-Glu- ″ SerKer333-Ser-Ile Glu-Ile-Ala-Asn由上文述及核心序列B27PA衍生而来的肽中，BL4也可以特异表达以下其中一个氨基酸集团Thr-Asp-Arg-Glu-Asp-Leu或Thr-Asp-Arg-Glu-Ser-Leu或
Thr-Tyr-Arg-Glu-Asn-Leu或Thr-Tyr-Arg-Glu-Asp-Leu或Thr-Tyr-Arg-Glu-Ser-Leu这也同样适用于由上文述及的核心序列B27PB和B27PC衍生的及含有以下序列的肽。
BL6-O-BL7-M-BL8肽B27PB和B27PC在设计的O和M肽位点是一致的。
优选的，在上文述及的核心序列B27PB中-O(在肽的2-3位；相当于Szots等人报道的110-111位(a.a.O.))相当于二肽序列Leu-Arg，和-M(在肽的5位；相当于Szots等人报道的113位(a.a.O.))相当于酪氨酸(Tyr)。
在上文述及的核心序列B27PC中-O(在肽的6-7位；相当于Szots等人报道的156-157位(a.a.O.))同样相当于二肽序列Leu-Arg，和-M(在肽的9位；相当于Szots等人报道的159位(a.a.O.))相当于酪氨酸(Tyr)。
这种情况下，O和M位点，及BL位点在替代中优先考虑同系(例如，结构和化学性质相近的)的氨基酸或氨基酸集团。氨基酸的替换，修饰，转换，删除和插入可能处于这样的程度之内基于本发明的目的，这些改变不会不利地影响以上定义序列造成的电荷和/或表面结构。优选地，基于表面结构的空间结构和电荷分布与核心片段的至少一部分，在长度上多于6，最好是多于8个氨基酸的，对肽的生物学活性至关重要的片段一致。
下表主要通过举例说明在基本核心序列B27PB和B27PC中找到的相应氨基酸或肽序列位点。名称BL6OBL7M BL81-5as 2as 1as 1as0-6asLeu-Arg TyrB27PB Leu ″ Gly ″ His-Gln-Asp-Ala-TyrB27PC Arg-Val-Ala-Glu-Glu ″ Ala ″ Leu-Glu-Gly-Glu-Cys-Val但是，必须强调的是由上文述及一般公式中得来的肽并不需要有同样的所研究的活性谱，例如，HLA-依赖自身免疫性疾病治疗活性。单个或仅仅一些氨基酸变异足以使之能够作为成功治疗HLA-依赖自身免疫性疾病的肽，如虹膜炎，银屑病及风湿病如Bechterew′s病(关节强硬性脊椎炎)，银屑病性关节炎以及男孩常发的青少年类风湿关节炎，它与开始用的肽不同。
上文所示序列中由8-20个，较好的是10-18个，更好的是12-16个氨基酸氨基酸组成的肽也是本发明述及的与上文描述的应用于诊断和治疗的肽。
在本发明方法中，肽的N-末端和/或C-末端进行替换；例如脂肪酸和磷酸脂，糖基和C1-C12-烷基或C1-C12-链烯残基所需偶联制剂和偶联方法为技术熟练人员所知。用甲基二硫苯甲酸(MDTB)通过肽的NH2基团，与激活的烯烃结合，运用双功能连接试剂，如MBSE，戊二醛和甲基二硫苯甲酸(MDTB)与磷酸脂如磷酸酰胆碱或磷酸酰乙醇胺偶联可作为例子。
本发明方法中肽直接或通过取代基或偶联系统(如生物素/结合素)与有机或无机支持物，或如下文将详细介绍的通过直接或间接可探测的标记物结合或吸附。
上文定义的肽可以进行很多改变而不丢失其基本功能，例如1)肽可在N-末端或C-末端扩展。2)肽可在N-末端或C-末端截短，然而仅限于至少含有6个氨基酸的肽，最好是至少8个氨基酸。
尤其是在由B27PA和Ker333衍生的肽中，几个特征性氨基酸之外N-末端或C-末端的截除可以不引起上文定义的生物学活性的丢失。举一个C-末端截除的例子，B27PA衍生肽B27PA*，如同上文述及，含有由Szots等人(a.a.O.)编号的HLA-B27序列中60-72的氨基酸。
本发明还包括以下用在本发明中的肽肽B27PA:Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln-Thr-Asp-Arg-Glu-Asn-Leu-Arg-Thr,肽B27PA*:Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln,肽B27PB:Leu-Leu-Arg-Gly-Tyr-His-Gln-Asp-Ala-Tyr,肽B27PC:Arg-Val-Ala-Glu-Gln-Leu-Arg-Ala-Tyr-Leu-Glu-Gly-Glu-Cys-Val,肽Ker333:Leu-Asp-Leu-Asp-Ser-Ile-Ile-Ala-Glu-Val-Lys-Ala-Gln-Tyr-Glu-Glu-Ile-Ala-Asn-Arg-Ser.
本发明还与由上文述及肽序列衍生、和本申请所具有的HLA-依赖自身免疫性疾病治疗活性具有可比性的肽相关，可比活性是指高达200％，某些情况下高达300％，或低于25％的活性。本发明所述由上文述及序列衍生的肽主要是由单一氨基酸或较小的氨基酸集团替代序列衍生而来的。这些肽优选用以下方法衍生-少量，不超过4或5个氨基酸，单一或小集团被一个或几个，最好是同系氨基酸替代，和/或-少量，不超过3个氨基酸的特定氨基酸加至N-末端和/或C-末端，和/或-肽在N-末端和/或C-末端截除一小部分氨基酸；一般只在含多于6，最好是8个氨基酸的肽中截除。
正如前文所述，肽B27PA和Ker333是根据与某些特定位点氨基酸序列同源性，由各自全序列中选择出来的。现认为至少一些特异氨基酸位点在肽的生物学活性中很重要。在以下核心序列B27PA和Ker333，和通过C-末端截除衍生于B27PA的核心序列B27PA*中，具有相同的单个氨基酸，下文用下划线表示肽B27PA:Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln-Thr-Asp-Arg-Glu-Asn-Leu-Arq-Thr,肽Ker333:Leu-Asp-Leu-Asp-Ser-Ile-Ile-Ala-Glu-Val-Lys-Ala-Gln-Tyr-Glu-Glu-Ile-Ala-Asn-Arq-Ser,肽B27PA*:Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln.
同系氨基酸的替代优先在下划线的氨基酸位点上进行，反之非同系氨基酸的替代以一定的程度可能发生在其余位点上。但是，必须考虑到肽序列中其它氨基酸位点对肽的生物学活性也很重要。正如前文述及多次，肽形成的三维结构对肽的生物学功能至关重要结构的变化，只要是对于上文定义序列的带电和/或表面结构，最好是修饰肽的三维结构与核心序列的或生物学功能必需的核心序列之段的结构保持基本不变，即为可行。
上文所述在HLA-依赖自身免疫性疾病诊断中具有可比应用性，和/或治疗中具有可比活性的方案，基于上述声明中肽的空间结构，除替代之外，同样也包括本发明中通过对上文述及序列的个别氨基酸或相对较小的氨基酸集团修饰(例如，甲基，脂肪酸或糖基基团的修饰)转换，删除和/或插入的肽结构。
另外，本发明还涉及按照正确顺序和已知方法通过连接氨基酸及其衍生物产生上文定义肽的方法。
按照上文所述核心序列产生肽的策略包括依照核心序列或这些核心序列片段的空间结构设计的特异方法。以上文所述同系氨基酸的替代为例来说明计算机辅助分子模型，以建立影响所得肽空间结构最大可能的氨基酸替代，修饰，删除或插入为目的。肽构建学的概念，以产生非肽类似物为目的，是建立与所给原始肽十分类似的三维结构，对上文述及核心序列或其片段而言，提供一个与“正常”氨基酸形成嵌段所不同的替代方案。
与上文定义相似的肽还包括上文述及的与之结合的标记物质，此标记物并不显著影响肽诊断HLA-依赖性自身免疫性疾病的适用性。
本发明中可用的肽，或发明中的肽，可由多种制备方法。例如，化学合成可以用自动或手动操作市售肽合成仪，例如，Beckman或实用性Biosystems公司。这种情况下，肽合成的操作按照仪器制造商所提供的包括在方法容许条件下所用试剂的明确介绍。
其它的可能性包括在手工操作化学合成中。以下是一些关于技术熟练人员所知方法的参考文献，R.B.Merrifield所用的固相方法(“固相合成”，Science232,341-347(1986))，此方法是通过用二环己碳二亚胺(DCCI)激活原始氨基酸复合物的羰基或所需结构的原始肽部分序列的羰基，和通过一定复合物或最终肽中定位于相同位点的片段中的氨基官能团激活具有活化羰基末端的复合物。后一种方法中，需要封闭在同等条件下具有活性的反应物的基团；例如，用三丁氧羰基基团(t-BOC基团)处理氨基。
肽可以由自然来源分离，特别是某些由DNA编码肽转染的细菌或真核细胞，在这些细胞中可以表达DNA。所用方法为技术熟练人员所掌握，例如DNA扩增，转染和肽纯化分离，例如用层析方法，(离子交换层析和免疫亲合层析，胶滤过等)和电泳。这种由自然来源分离的肽十分适用于HLA-依赖自身免疫性疾病的治疗。
正如前文所述，本发明特别包括所述肽在HLA-依赖自身免疫性疾病的诊断和治疗中的应用。a)HLA-依赖自身免疫性疾病的诊断由HLA-B27和角蛋白Ⅵ衍生而来的肽用于诊断中，来检测细胞和体液免疫反应。这使临床综合征的免疫分类更为精确，使特异治疗成为可能。在所描绘的基础上，这些肽呈递了更为特异的抗原而非相对完整抗原。另外，对角蛋白来说，与蛋白不同，肽的可溶性在应用上更为优越。
这里所述的自身免疫性疾病包括HLA-Ⅰ类相关和HLA-Ⅱ类相关的自身免疫性疾病，特别是，并不限于，风湿病复合征，如关节炎，类风湿和反应性关节炎，银屑病关节炎和青少年类风湿关节炎，还有虹膜炎，银屑病和眼色素层炎。还提及可用于HLA-B27相关自身免疫性疾病诊断和治疗的本发明上文定义的肽。在关节强硬性脊椎炎(Bechterew′s疾病)以及上文提及风湿病综合征的某些情况下，存在与HLA-B27抗原的联系，特别是某些青少年类风湿关节炎和银屑病关节炎，及某些虹膜炎，眼色素层炎和银屑病。必须强调的是，上文定义的肽并不限于适用于HLA-B27相关自身免疫性疾病的诊断和治疗和/或抑制HLA-B27-相关自身免疫性疾病。相反，还可以用在与其它HLA-Ⅰ类抗原相关的自身免疫性疾病，如非-HLA-B27-相关青少年类风湿关节炎和银屑病关节炎。另外，其实用性还可扩展到HLA-Ⅱ类相关自身免疫性疾病，如特异HLA-Ⅱ类相关关节炎。
这些肽特别适用于作为检测抗体的体外测试系统的抗原，如在酶联免疫吸收测试(ELISA)或免疫荧光测试，和适用于细胞免疫反应，如T细胞刺激测试。
在这些测试中，肽可以直接在溶解状态或吸附或共价结合于支持物上使用。所用肽与可探测的标记底物直接或间接结合。如技术熟练人员所知，这些标记底物包括荧光底物，酶，含放射活性元素(3H,13C,32P,35S,125I，等)的基团或分子，和磁性粒子，通过直接结合或结合系统(如生物素/抗生物素蛋白)来结合。另外，肽的游离或相应修饰形式可以以试剂盒的形式获得，其中包括检测方法中所需的其它试剂。
肽也可以直接用于人类诊断。在这种情况下，可通过皮内或皮下注射以溶液或吸收或结合于支持物形式存在的肽产生免疫反应，然后测定。肽尤其适用于作为在健康受试者身上引起的延迟性免疫反应的诊断研究方法，或用于特殊诊断的病人。肽通过传统途径给予，如口服。静脉注射，皮下注射，肌内注射，等，以包括添加或辅助成分的形式给予，这是由技术熟练人员所熟悉的应用。b)HLA-依赖自身免疫性疾病的抑制/治疗上文定义的由HLA-B27和角蛋白Ⅵ衍生而来的肽，可以以a)中例子中的方法作为以上所列HLA-依赖自身免疫性疾病的治疗剂。
本发明还与抑制或治疗HLA-依赖自身免疫性疾病的肽的应用，特别是为抑制和/或治疗HLA-依赖自身免疫性疾病制备制剂的应用有关。
本发明还与治疗人类HLA-依赖自身免疫性疾病的方法有关，包括给予上文定义的肽。
本发明中，给予所述肽的目的是为使受试对象耐受作为免疫活性引起的免疫反应靶体的不同自身抗原。在这种情况下，肽产生特异免疫反应，包括特异-T细胞的耐受，灭活或消除。但是，耐受也可以由封阻消化性(professionell)或非特定抗原呈递细胞上的抗原呈递限制因子而引起。
如上文所述，与自身免疫性疾病相关的免疫系统的反应并不局限在血淋巴细胞中。体液免疫反应，通过抗体，巨噬细胞和其它免疫系统细胞，也应包括本发明中肽的可能靶体。
病人和正常志愿者的实验发现可以用于确定肽的治疗强度。一方面，例如，体外检测Bechterew′s疾病(关节强硬性脊椎炎)病人和正常志愿者的外周血(PBL)中分离的淋巴细胞。这些淋巴细胞用不同的蛋白和肽及反应进行孵育，细胞扩增增加，用3H-胸腺嘧啶掺入检测。在此联系中发现，Bechterew′s疾病病人的淋巴细胞与正常志愿者不同，对肽B27PA*的反应强于肽B27PD(与上文定义不同)。可以通过肽的一级结构(氨基酸序列)推论淋巴细胞表现的交叉反应活性正是自身免疫反应的原因。
另外，用肽B27PA*和Ker333在大鼠上作免疫实验，引起类似银屑病关节炎的指关节肿胀例数分别为四个中有一个，两个中有一个。这些发现同时表明在反应动物中，肽能够表现出与正常存在于指关节区的表位的交叉反应活性。此交叉反应活性为自身免疫性疾病的原因。如果能够获得这方面的结果，那么正如前文举例描述，将相同肽包括在诊断和进一步判定自身免疫性疾病的类型就很有价值。
在自身免疫眼色素层炎中，前文已经提到交叉反应活性直接提供了治疗方法(见，如，WO 95/29194；S.R.Thurau，等人，ImmunologyLetters 57,193-201(1997))。肽免疫反应活性的知识在治疗病人中有诊断重要性，因为此反应活性直接提供这些肽用于治疗的可能性，如，通过它们调节自身攻击免疫反应。
可以通过静脉注射，皮下或肌内给予，特别是，向予粘膜表面如鼻腔气管区，肺或胃肠道(特别是口服给予)上文定义的肽，或含有这些肽的制备物，产生耐受。
在此联系中，要考虑到单个给予或两个或多个上文定义的肽结合给予。当两个或多个肽给予时，可以同时或次序给予。
制备包括所述肽可以干粉，溶液，悬浊液或气溶胶，如鼻喷雾或吸入喷雾形式给予。制备包括活性底物和传统的辅助和携带底物。肽可以每日10微克到1000微克每公斤体重的剂量给予。
本发明中的优选给予模式是通过粘膜，特别是鼻腔，肺和胃肠道粘膜，用鼻腔或吸入喷雾或口服给予肽。口服，鼻或吸入产生耐受机制还属未知，目前的知识认为细胞效应并不重要，至少不通过CTL的途径。由给予粘膜抗原产生的调节细胞还未完全分辨或功能定性。
口服给予时，可以用释放系统，如，胶囊，肽可以通过它在特定的胃肠道部位释放，如小肠的某段区域，通过这种释放，在其特定位置，持续一个相对较长的时间。这样可以，例如，使制备物免于与胃中的攻击性，酸性物质接触。植入的缓释设计也可用于皮下给予。技术熟练人员对上文所述类型的缓释设计很熟悉。
虽然本文并不排除以治疗为目的通过皮肤给予肽，以目前的知识它并不作为优选方案。例如，在银屑病中，皮肤溃疡处的自身攻击T淋巴细胞能够将皮肤给予的肽识别为已制备的在相应MHC条件下的抗原，如，蛋白水解裂解，这样会加强自身攻击反应。
与目前一些中心所尝试的用完整蛋白诱导耐受的方法相比，用上文所述肽诱导耐受在HLA-依赖自身免疫性疾病中有很多优越性，如1)肽可以用蛋白化学相对简单的合成。
2)肽并不由天然组织中分离得到。减少了组织可能感染的病毒，病原体或细菌感染的可能性，和由相应(逆)病毒或细菌DNA引起的二次感染的可能性。
3)作为由动物物质分离蛋白的替代方法的重组产生方法并不需要，因为很费力且产量相对低。
4)肽在干粉状态有很长的保存寿命，且并不需要如何特殊的储存条件。
5)与蛋白相比较，以食物或接触过敏为形式的敏化危险，在肽中并不出现，因为它不能与浆细胞或嗜酸性细胞表面的IgE发生交联效应。
6)如上文描述，肽在免疫系统中有调节效应。实施例本发明中，上文定义的肽，用作测定细胞免疫反应的体外探测系统抗原的适用性，由肽B27PA*一系列检测来例证。肽所测试肽是上文提及的肽B27PA*，它是由B27PA的核心序列的C-未端截除8个氨基酸所得，其包括Szots等人(Loc.cit.)所述HLA-B27序列中的60-72氨基酸B27PA*:
Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln及对照肽B27PD，它与本发明可用的肽情况不同，包含Szots等人(Loc.cit)所述HLA-B27序列中的125-138氨基酸B27PD:
Ala-Leu-Asn-Glu-Asp-Leu-Ser-Ser-Trp-Thr-Ala-Ala-Asp-Thr.
肽B27PD在实验性自身免疫眼色素层炎(EAU)大鼠模型中引起眼色素层炎(WO 95/29194；G.Wildner&S.R.Thurau,Eur.J.Immunol.24,2579-2585(1994))。
肽B27PA*是在半自动肽合成仪上按照制造商说明书制备的。肽B27PD由Neosystems,Strasbourg,France制备。肽由未添加RPMI-1640溶解。病人所探测的外周血T淋巴细胞(PBL)来源于有关节强硬性脊椎炎(AS)的HLA-B27+病人，其它脊椎关节病HLA-B27+病人，有类风湿关节炎(RA)的HLA-B27-病人，健康HLA-B27+对照主体和健康HLA-B27-对照主体。有关节强硬性脊椎炎(AS)的HLA-B27+病人本研究中有关节强硬性脊椎炎(AS)的55个病人完全符合Newyork修正的关于准确AS的定义(S.Vander Linden,H.A.Valkenburg,A.Cats,Arthritis Rheum.27,361-368,(1984)):(36男性和19女性；平均年龄40.9年，年龄范围18-71岁)。所有病人符合临床“急性”病的前提条件。其它脊椎关节病HLA-B27+病人本研究中的28个患有其它脊椎关节病HLA-B27+病人包括5个有反应性关节炎，10个有银屑病关节炎和13个有肠病关节炎并发Crohn′s疾病或溃疡性大肠炎(15男性和13女性；平均年龄42.4年，年龄范围22-76岁)的病人。健康HLA-B27+对照主体本研究中包括30个主体(18男性和12女性；平均年龄46.2年，年龄范围20-78岁)。健康HLA-B27-对照主体本研究中包括22个主体(10男性和12女性；平均年龄30.8年，年龄范围22-53岁)。有类风湿关节炎(RA)的HLA-B27-病人本研究中包括7个急性类风湿关节炎(RA)的HLA-B27-病人(1个男性和4个女性；平均年龄56.8年，年龄范围30-72岁)。
对照血捐献者中没有人有脊椎关节炎个人或家族发病史，也没有近期发生过胃肠道或泌尿生殖道感染。外周血淋巴细胞(PBL)的分离由肝素化外周血获得的PBLs是用Ficoll-Hypaque梯度标准离心，三次清洗并重悬于RH10培养基中(含2mM L-谷氨酰胺，HEPES,100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素和10％热灭活人类AB血清的RPMI-1640基质)。淋巴细胞扩增检测用或不用刺激物，用RH10培养基在96孔圆底微孔板(Nunc,Roskilde,Denmark)上制备5×10E4 PBLs，终体积为10ul。所用肽终浓度为10ug/ml。所有实验重复三次。培养物在潮湿环境(5％CO2,95％空气)下37摄氏度孵育6天。第5天，向每孔加入0.25uCi3H-胸腺嘧啶(3H-TdR；Amersham,Braunschweig,Germany)。第6天，细胞用标准收集法通过玻璃滤纸收集。3H-TdR掺入用液闪计数定量。结果以刺激结果([有刺激物的cpm-无刺激物的cpm][无刺激物的cpm])表示。肽B27PA*剂量/反应曲线的测定与B27PA*反应的来源于病人(AS1)的1×10E5 PBLs在不含或含0.1到50.0ug/ml不同浓度的合成肽B27PA*的100ulRH10培养基中孵育6天，在第5天用0.25uCi的3H-胸腺嘧啶(3H-TdR)刺激，第6天用玻璃滤纸收集。结果用每分平均计数(cpm)+-三次重复结果的标准误差。B27PA1*特异T细胞系的产生3×10E6PBLs在含10ug肽B27PA*/ml的总体积为2ml的RH10培养基的12孔板上孵育。PBLs由有关节强硬性脊椎炎的AS1和AS2病人和健康HLA-B27+(H1)血液捐献者分离得到，所有测试者在开始淋巴细胞扩增鉴定(见“结果”)中表现出对B27PA*明显的淋巴细胞增殖反应；有关节强硬性脊椎炎，AS2，而不表现出增殖反应的病人的PBLs作为对照。经过3天的培养，培养基由新鲜添加20U重组IL-2(rIL-2,Boehringer Ingelheim,Germany)/ml的RH10替代。在第10天，培养物用自体，照射(4000rads)过的PBLs作为饲细胞，添加了10ug的B27PA*肽/ml和rIL-2的RH10清洗和再刺激。再刺激过程中，每1×10E6反应者细胞用2×10E6饲养细胞，所得T细胞系用淋巴细胞增殖检测进行功能定性，其中用1×10E4T细胞为反应细胞和1×10E4自身E-(例如，通过绵羊红细胞玫瑰花形成实验由自身PBLs中分离单核细胞/B细胞侵蚀部分)作为饲养细胞，总体积为150ulRH10，以上方法在E.Hermann,B.Fleischer,W.-J.Mayet,T.Poralla,K.-H Meyer zum Buschenfelde,Clin Exp.Immunol.75,365-370(1989)中描述过。肽B27PA*(10或1ug/ml)和B27PD(10ug/ml)作为刺激剂，植物血凝素(PHA；1ug/ml)作为阳性肽。为了检测单克隆抗体(Mabs)阻断肽-特异T细胞增殖的能力，Mabs w6/32(抗-HLA-Ⅰ类，1∶400),DA6.231(抗-HLA-Ⅱ；1∶400)和1ug/ml TCR-δ1(γδ-TCR的δ-链上片段决定蔟特异性；T Cell Sciences,Cmbridge,MA,USA)加入含B27PA*的培养物。培养的第3天，细胞用0.25uCi的3H-TdR刺激并按上文描述收获和计数。肽刺激T细胞系的表现型分析(FACS)在培养第8和20天的培养物中T细胞系，及未刺激的PBLs用细胞分类器分析。每次实验开始3×10E5细胞用未结合Mabs抗-CD3(OKT3)，抗-CD4(OKT4)，抗-CD8(OKT8)(混合上清液)BMA.031(TCR-αβ上片段决定蔟特异性)和TCR-δ1标记，然后用RPMI-1640/10％胎牛血清中荧光素异硫氰酸盐结合的多克隆羊抗小鼠-IgG抗体(Medac,Hamburg,Germany)标记。用荧光活化细胞分类器(FACStar,Becton Dickinson)进行细胞荧光测定分析，每个样品中6000个细胞计数。结果用单克隆抗体(Mabs)-描述阳性染色细胞的百分比比上所有CD3-阳性T细胞百分比来表示。结果PBLs对HLA-B27-衍生肽的增殖反应如表1所示，B27PA*在17/55有AS(SI在2.5和17之间)的测试病人和3/30正常HLA-B27+血液捐赠者(SI在2.5和9.8)中引起明显PBL扩增(SI＞=2.5)。有AS的测试病人和3/30正常HLA-B27+血液捐赠者组间有明显差异(p=0.0135；Mann-Whitneyrank sum test；Stat Exact Programme)。在2/28其它HLA-B27-相关脊椎关节炎和2/22正常HLA-B27-对照主体中只有轻微PBL增殖(SI=2.5)由于已知一些T细胞对抗原反应时可以被刺激后分泌细胞因子而不增殖，对肽反应(AS1)或不反应(AS2)的病人的PBLs中分泌IFN-γ的T细胞比例用酶联免疫点印迹(ELISPOT)测定(按D.M.Klinman,T.B.Nutman修正的，“ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells″,in:Current Protocols in Immunology,7th edition,Eds:J.E.coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach,W.Strober,Brooklyn,New York,Greene PublishingAssociates,1994)灵敏的ELISPOT技术表明10E5的AS1病人PBLs中的8个和10E5的AS2病人PBLs中的1个表现出B27PA*-刺激T细胞产生IFN-γ的特异性。
RA病人PBLs并不被这两种所用肽刺激。
有趣的是，健康的HLA-B27+血液捐赠者(称为H1)，健康的HLA-B27+实验主体组中一个30岁男性血液捐赠者对B27pA*肽(SI=9.8)表现出最强的PBL扩增反应，在我们取血样8个月后，表现出炎症类型的后期疼痛，僵直持续1h。不幸的是，此人，H1，并未为风湿病学者进行病理检查。
如下表所示，一个AS病人的PBLs的B27PA*特异反应(为PBLs对肽的反应)，是剂量依赖并在培养基终浓度为10ug/ml时达到最大。肽终浓度B27PA*:(ug/ml)cpm±标准误0 165±200.1 218±251.0 565±475.0 1576±707.5 2492±7210.0 2718±7620.0 2695±8850.0 2733±84这些结果表明有HLA-B27序列合成的肽，如B27PA*，被有关节硬化脊椎炎HLA-B27+病人的PBLs作为自身抗原特异识别，至少还能为HLA-B27+对照主体以较低程度识别。
尽管HLA-B27衍生肽B27PA*和B27PD对PBL捐赠者为外源，在HLA-B27-对照主体中不诱导增殖或仅有轻微增殖。缺乏与这些HLA-B27决定蔟反应的对照PBLs的增殖可以解释为这种反应活性表现出的“间接共识别”，其特点是宿主MHC-限制性T细胞共反应固定地指向外源MHC抗原上单一或一些主要决定簇。(G.Benichou,R.C.Tam,L.R.B.Loares,E.V.Fedoseyeva,Immnol.Today18:67-71(1997))另外，在本研究中所检测的肽并不表现出与可能在HLA-B27-志愿者中引起共反应T细胞反应的HLA-B27分子相同的决定簇。B27PA*-特异T细胞系的功能鉴定如上文所描述，3个不同的B27PA*-特异T细胞系通过培养和再刺激含B27PA*肽的来源于病人AS1和AS3及健康HLA-B27+血液捐赠者(H1)的PBLs而产生。AS1和AS3是其PBLs在与肽B27PA*反应时强烈增殖的病人(AS1∶SI=17.5；AS3∶SI=15.4)。血液捐献者H1的PBLs用B27PA*(SI=9.8)刺激。对照T细胞系B27PA*-AS2由与B27PA*(SI=1)反应不增殖的PBLs衍生而来。T细胞系在培养第20天分析。如下表所示，细胞系B27PA*-AS1,B27PA*-AS3,B27PA*-H1与B27PA*肽反应特异性增殖，而对照细胞系B27PA*-AS2并不如此。不可能用抗-MHC-Ⅰ类Mabs(w6/32)或抗MHC-Ⅱ类Mabs(DA6.231)抑制这种特异的T细胞增殖。而单克隆抗体TCR-δ1抗-γδ-TCR)可以阻断大于50％的用1ug/mlB27PA*刺激的培养物中B27PA*特异性增殖反应，而对PHA诱导的增殖没有效应。
T-细胞系B27PA*-AS1 B27PA*-AS3 B27PA*-H1B27PA*-AS2T+培养基72±5 75±868±8 86±9T+E-+培养基 89±9 96±11 85±10114±16T+E-+B27PA*(10μg/ml) 1548±34 1120±48 1368±58 134±18+w6/32 1576±55 1105±41 1379±67n.best.
+DA6.2311513±102 1077±83 1322±117 n.best.
+TCR-δ1 855±85635±64 893±82n.best.T+E-+B27PA*(1μg/ml) 912±90725±48 816±55126±22+w6/32 925±82730±50 827±69n.best.
+DA6.231 896±77695±55 803±53n.best.
+TCR-δ1 411±42304±29 410±40n.best.T+E-+B27PD(10μg/ml)101±16 95±10 94±21125±12T+E-+PHA(1μg/ml) 3689±177 4248±1243480±145 4068±170+TCR-δ13650±158 4268±1353538±170 4103±182nh=未确定B27PA*特异性T细胞系的流式细胞分析从上表可以看出，与未刺激的PBLs(0天)或仅用rIL-2刺激的PBLs系相比较，B27PA*特异性T细胞系B27PA*-AS1,B27PA*-AS3,B27PA*-H1(培养第8和20天的产物)表现型源于B27PA*-刺激细胞系中γδ-TCR+淋巴细胞的扩展。在第20天，γδ-TCR+淋巴细胞在所有CD3阳性细胞中分别含有25.5％(志愿者AS1),30.4％(志愿者AS3),32.7％(志愿者H1)。相反，B27PA*-刺激对照细胞系B27PA*-AS2仅含7.4％γδ-TCR+细胞。下表数据以占总CD3-阳性T细胞的百分比形式给出。
TCR-αβ(％) CD4(％) CD8(％)TCR-γδ(％)供体AS1新鲜分离的PBLs 93.5 69.8 24.6 5.3B27PA*刺激，第8天 84.9 52.9 28.2 13.7B27PA*刺激，第20天 73.6 45.1 30.5 25.5rIL-2刺激，第20天93.0 67.7 26.7 6.3供体AS3新鲜分离的PBLs 93.3 71.0 22.4 5.8B27PA*刺激，第8天 83.6 63.5 21.3 15.5B27PA*刺激，第20天 59.2 34.4 25.6 30.4rIL-2刺激，第20天92.2 75.8 16.6 7.2供体H1新鲜分离的PBLs 95.7 73.1 22.3 4.1B27PA*刺激，第8天 85.2 58.4 26.5 14.0B27PA*刺激，第20天 67.1 34.9 31.5 32.7rIL-2刺激，第20天93.7 75.0 18.4 6.0供体AS2新鲜分离的PBLs 94.1 66.3 27.4 5.3B27PA*刺激，第8天 92.3 68.6 24.0 7.2B27PA*刺激，第20天 91.9 70.2 21.4 7.8rIL-2刺激，第20天92.1 74.3 18.5 7.4用Mabs阻断B27PA*-特异性T细胞系的FACScan分析和实验数据表明γδ-TCR+T细胞，比起CD4-阳性αβ-TCR+T细胞，在与HLA-B27-衍生肽体外孵育后刺激和膨胀细胞中占多数。在此联系中，值得一提的是自身反应γδ-TCR+细胞可能与一些人类自身免疫性疾病有关(J.Soderstrom,E.Halapi,e.Nisson,A.Gronberg,j.van Embden,L.Klareskog,R.Kiessling,Scand.J.Immunol.32,503-515(1990))，包括类风湿关节炎，尽管在RA病人的外周血或滑液和膜中γδ-TCR+细胞的相对数量并不增加。(M.Smith,B.Broker,L.Moretta,E.Ciccone,C.E.Grossi,J.C.W.Edwards,F.yuksel,B.Colaco,C.Worman,L.Mackenzie,R.Kinne,G.Weseloh,K.GLuckert,P.M.Lydyard,Scand.J.Immunol.32,585-593(1990))在脊椎关节炎中，Klebsiella肺炎中增殖的γδ-TCR+细胞(E.Hermann,B.Sucke,U.Droste,K.-H Meyer zum Buschenfelde,Arthtisis Rheum.38,1277-1282,(1995))或对自身靶体，Daudi细胞系或感染了肠细菌的B细胞系表现出细胞毒性的γδ-TCR+细胞(E.Hermann,B.Ackermann,R.Duchmann,K.-H.Meyer zum Buschenfelde,Clin.Exp.Rheumatol.13,187-191,(1995))由滑液中分离得到。按照脊椎关节炎的病理机制推论，γδ-TCR+细胞可能在抗感染致关节炎的细菌的细胞或自身相同的炎症“应激”组织的早期防御机制中起作用(E.Hermann,B.Ackermann,R.Duchmann,K.-H.Meyer zum Buschenfelde,Clin.Exp.Rheumatol.13,187-19l,(1995)。另一个着眼于HLA-B27肽特异性γδ-TCR+细胞作用的观察是在实验自身免疫眼色素层炎(EAU)的动物模型中进行。从由口服产生眼色素层炎自身抗性S-Ag肽或交叉反应肽B27PD诱导耐受的大鼠转移出来的γδ-TCR+细胞能够以抗原特异的形式抑制眼色素层炎(G.Wildner,T.Hunig,S.Thurau,Eur.J.Immunol.26,2140-48,(1996))。在结果中能够获得具有对源于HLA-B抗原B27肽的特异性的γδ-TCR+细胞，其中与疾病有关的HLA-B抗原B27可能与免疫调节，甚至下调人类关节强硬性脊椎炎中的炎症有关。这项在以上文描述检测方法进行的观察中，健康者，HLA-B27阳性血捐献者的周边T细胞与B27PA*肽反应这一现象与后期可能性并不矛盾。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人(A)名称Wildner,Gerhild(B)街道Rupprechtstrasse 8a(C)城市Munich(E)国家Germany(F)邮编(ZIP):80636(ⅱ)发明题目用作自身免疫疾病的诊断和治疗剂的肽(ⅲ)序列数11个(ⅳ)计算机可读形式(A)媒体类型Floppy disk(B)计算机IBMPC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0,Version#1.30(EPO)(Ⅴ)目前申请数据申请号PCT/EP97/05124(Ⅵ)先有申请数据(A)申请号DE 196 38 108.08(B)申请日18-SEP-1996(2)SEQ ID NO:1信息(ⅰ)序列描述(A)长度21个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假说的非(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)原始来源(A)生物人类
(ⅸ)特征’(A)名称/关键词肽(B)位置1…21(D)其它信息/标记=来自HLA-B27的α-1-结构域的肽B27PA(氨基酸60-80)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:1的序列描述Trp Asp Arg Glu Thr Gln Ile Cys Lys Ala Lys Ala Gln Thr Asp Arg1 5 10 15Glu Asn Leu Arg Thr20(2)SEQ ID NO:2信息(ⅰ)序列描述(A)长度13个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假说的非(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)原始来源(B)生物人类(ⅸ)特征’(A)名称/关键词肽(B)位置1…13(D)其它信息/标记=来自HLA-B27的α-1-结构域的肽B27PA*(氨基酸60-72)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:2的序列描述Trp Asp Arg Glu Thr Gln Ile Cys Lys Ala Lys Ala Gln1 5 10(2)SEQ ID NO:3信息(ⅰ)序列描述(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假说的非(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)原始来源(C)生物人类(ⅸ)特征’(A)名称/关键词肽(B)位置1…10(D)其它信息/标记=来自HLA-B27的α-2-结构域的肽B27PB(氨基酸109-118)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:3的序列描述Leu Leu Arg Gly Tyr His Gln Asp Ala Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO:4信息(ⅰ)序列描述(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假说的非(ⅴ)片段类型内部的
(ⅵ)原始来源(D)生物人类(ⅸ)特征’(A)名称/关键词肽(B)位置1…15(D)其它信息/标记=来自HLA-B27的α-2-结构域的肽B27PC(氨基酸151-165)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:4的序列描述Arg Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Glu Cys Val1 5 10 15(2)SEQ ID NO:5信息(ⅰ)序列描述(A)长度21个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假说的非(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)原始来源(E)生物人类(ⅸ)特征’(A)名称/关键词肽(B)位置1…13(D)其它信息/标记=来自人类角蛋白Ⅵ的肽Ker333(ⅹⅰ)SEQ ID NO:5的序列描述Leu Asp Leu Asp Ser Ile Ile Ala Glu Val Lys Ala Gln Tyr Glu Glu1 5 10 15Ile Ala Asn Arg Ser20(2)SEQ ID NO:6信息(ⅰ)序列描述(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线型(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特征’(A)名称/关键词区域(B)位置1(D)其它信息/标记“Xaa=1-2个氨基酸，例如，由B27PA衍生的肽中的Trp或，例如由Ker33衍生的肽中的Leu。
(ⅸ)特征’(A)名称/关键词区域(B)位置3(D)其它信息/标记“Xaa=4-5个氨基酸，例如，由B27PA衍生的肽中的Cys-Lys-Ala或，例如由Ker33衍生的肽中的Ala-Gly-Val。
(ⅸ)特征’(A)名称/关键词区域(B)位置9(C)其它信息/标记“Xaa=6-8个氨基酸，例如，由B27PA衍生的肽中的Thr-Asp/Tyr-arg-Glu-Asn/Asp/Ser-Leu或，例如由Ker33衍生的肽中的Tyr-Glu-Glu-Ile-Ala-Asn。
(ⅸ)特征’(A)名称/关键词区域(B)位置11(D)其它信息/标记“Xaa=1-2个氨基酸，例如，由B27PA衍生的肽中的Thr or Ile或，例如由Ker33衍生的肽中的Ser。
(ⅸ)特征’(A)名称/关键词肽(B)位置1…11(D)其它信息/标记=衍生于肽B27PA或肽Ker333的肽，如果合适，在其C或N端延长或截短(截短通常限于至少6个氨基酸的肽)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:6的序列描述Xaa Asp Xaa Ile Xaa Lys Ala Gln Xaa Arg Xaa1 5 10(2)SEQ ID NO:7信息(ⅰ)序列描述(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线型(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特征’(A)名称/关键词区域(B)位置1(D)其它信息/标记“Xaa=1-2个氨基酸，例如，由B27PA衍生的肽中的Trp或，例如由Ker33衍生的肽中的Leu。
(ⅸ)特征’(A)名称/关键词区域(B)位置3(D)其它信息/标记“Xaa=4-5个氨基酸，例如，由B27PA衍生的肽中的Arg-Glu-Thr-Gln或，例如由Ker33衍生的肽中的Leu-Asp-Ser-Ile。
(ⅸ)特征’(A)名称/关键词区域
(B)位置5(D)其它信息/标记“Xaa=3-4个氨基酸，例如，由B27PA衍生的肽中的Cys-Lys-Ala或，例如由Ker33衍生的肽中的Ala-Glu-Val。
(ⅸ)特征’(A)名称/关键词区域(B)位置9(D)其它信息/标记“Xaa=6-8个氨基酸，例如，由B27PA衍生的肽中的Thr-Asp/Tyr-Arg-Glu-Asn/Asp/Ser-Leu或，例如由Ker33衍生的肽中的Tyr-Glu-Glu-Ile-Ala-Asn。
(ⅸ)特征’(A)名称/关键词区域(B)位置11(D)其它信息/标记“Xaa=1-2个氨基酸，例如，由B27PA衍生的肽中的ThrorIle或，例如由Ker33衍生的肽中的Ser。
(ⅸ)特征’(A)名称/关键词肽(B)位置1…11(D)其它信息/标记=衍生于肽B27PA或肽Ker333的肽，如果合适，在其C或N端延长或截短(截短通常限于至少6个氨基酸的肽)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:7的序列描述Xaa Asp Xaa Ile Xaa Lys Ala Glu Xaa Arg Xaa1 5 10(2)SEQ ID NO:8信息(ⅰ)序列描述(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线型
(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特征’(A)名称/关键词区域(B)位置1(D)其它信息/标记“Xaa=1-2个氨基酸，例如，Trp。
(ⅸ)特征’(A)名称/关键词区域(B)位置3(D)其它信息/标记“Xaa=4-5个氨基酸，例如，Arg-Glu-Thr-Gln。
(ⅸ)特征’(A)名称/关键词区域(B)位置5(D)其它信息/标记“Xaa=3-4个氨基酸，例如Cys-Lys-Ala。
(ⅸ)特征’(A)名称/关键词肽(B)位置1…8(D)其它信息/标记=衍生于肽B27PA*如果合适，在其C或N端延长或截短(截短通常限于至少6个氨基酸的肽)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:8的序列描述Xaa Asp Xaa Ile Xaa Lys Ala Gln1 5(2)SEQ ID NO:9信息(ⅰ)序列描述(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线型(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特征’
(A)名称/关键词区域(B)位置1(D)其它信息/标记“Xaa=1-2个氨基酸，例如，Trp。
(ⅸ)特征’(A)名称/关键词区域(B)位置3(D)其它信息/标记“Xaa=4-5个氨基酸，例如，Arg-Glu-Thr-Gln。
(ⅸ)特征’(A)名称/关键词区域(B)位置5(D)其它信息/标记“Xaa=3-4个氨基酸，例如Cys-Lys-Ala。
(ⅸ)特征’(A)名称/关键词肽(B)位置1…8(D)其它信息/标记=衍生于肽B27PA*如果合适，在其C或N端延长或截短(截短通常限于至少6个氨基酸的肽)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:9的序列描述Xaa Asp Xaa Ile Xaa Lys Ala Glu1 5(2)SEQ ID NO:10信息(ⅰ)序列描述(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线型(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特征’(A)名称/关键词区域(B)位置1
(D)其它信息/标记“Xaa=1-5个氨基酸，例如，衍生于B27PB的肽中的Leu，或，衍生于B27PC的Arg-Val-Ala-Glu-Gln。
(ⅸ)特征’(A)名称/关键词区域(B)位置4(D)其它信息/标记“Xaa=1个氨基酸，例如，衍生于B27PB的肽中的Gly，或，衍生于B27PC的Ala。
(ⅸ)特征’(A)名称/关键词区域(B)位置1(D)其它信息/标记“Xaa=0-6个氨基酸，例如，衍生于B27PB的肽中的His-Gln-Asp-Ala-Tyr，或，衍生于B27PC的Leu-Glu-Gly-Glu-Cys-Val.
(ⅸ)特征’(A)名称/关键词肽(B)位置1…6(D)其它信息/标记=衍生于肽B27PB或肽B27PC，如果合适，在其C或N端延长或截短(截短通常限于至少6个氨基酸的肽)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:10的序列描述Xaa Leu Arg Xaa Tyr Xaa1 5(2)SEQ ID NO:11信息(ⅰ)序列描述(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假说的非(ⅴ)片段类型内部的
(ⅵ)原始来源(A)生物人类(ⅸ)特征’(A)名称/关键词肽(B)位置1…14(D)其它信息/标记=可比于肽B27PD(ⅹ)公开信息(A)作者Wildner,GerhildThurau Stephan(C) 杂志Eur.J,Immunol.
(D) 卷24(E) 页2579-2585(F) 日期1994(ⅹⅰ)SEQ ID NO:11的序列描述Ala Leu Asn Glu Asp Leu Sar Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr1 5 10
权利要求
1．含有以下用来诊断和/或治疗HLA-依赖自身免疫性疾病的下列通式序列的一个或多个肽的应用BL1-X-BL2-Y-BL3-Z或BL1-X-BL2-Y-BL3Z-BL4-W-BL5其中BL1表示1到2个氨基酸，X表示天冬氨酸，BL2表示4到5个氨基酸，Y表示异亮氨酸，BL3表示3到4个氨基酸，Z表示Lys-Ala-Gln或Lys-Ala-Glu,BL4表示6到8个氨基酸，W表示精氨酸，BL5表示1到2个氨基酸，单个氨基酸或相对较小的氨基酸集团的插入，删除，替代，修饰和转换(Inversion)也包括在内，合适的话，包括C-末端和/或N-末端呈现相应的氨基酸残基，糖基，脂肪酸残基或烷基/链烯残基(C1-C16)，和/或在C-末端和/或N-末端截除相应的一个或多个氨基酸。
2．权利要求1的用途，其中，肽Trp-Asp-Arg-Glu--Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln-Thr-Asp-Arg-Glu-Asn-Leu-Arg-Thr或由上文提及的序列通过替代，修饰，删除，插入和/或末端加入单个氨基酸或相对较小的氨基酸集团衍生而来的肽的应用。
3．权利要求1的用途，其中，肽Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln或由上文提及的序列通过替代，修饰，删除，插入和/或末端加入单个氨基酸或相对较小的氨基酸集团衍生而来的肽的应用。
4．权利要求1的用途，其中，肽Leu-Asp-Leu-Asp-SeR-Ile-Ile-Ala-Glu-Val-Lys-Ala-Gln-Tyr-Glu-Glu-Ile-Ala-Asn-Arg-Ser或由上文提及的序列通过替代，修饰，删除，插入和/或末端加入单个氨基酸或相对较小的氨基酸集团衍生而来的肽的应用。
5．含有以下用来诊断和/或治疗HLA-依赖自身免疫性疾病的通式序列的一个或多个肽的应用BL6-O-BL7-M-BL8其中BL6表示1到5个氨基酸，O表示Leu-Arg,BL7表示1个氨基酸，M表示酪氨酸，及BL8表示0到6个氨基酸，单个氨基酸或相对较小的氨基酸集团的插入，删除，替代，修饰和转换也包括在内，合适的话，包括C-末端和/或N-末端呈递相应的氨基酸残基，糖基，脂肪酸残基或烷基/链烯残基(C1-C16)，和/或在C-末端和/或N-末端截除相应的一个或多个氨基酸。
6．权利要求5的应用，其中，肽Leu-Leu-Arg-Gly-Tyr-His-Gln-Asp-Ala-Tyr或由上文提及的序列通过替代，修饰，删除，插入和/或末端加入单个氨基酸或相对较小的氨基酸集团衍生而来的肽的应用。
7．权利要求5的应用，其中，肽Arg-Val-Ala-Glu-Gln-Leu-Arg-Ala-Tyr-Leu-Glu-Gly-Glu-Cys-Val或由上文提及的序列通过替代，修饰，删除，插入和/或末端加入单个氨基酸或相对较小的氨基酸集团衍生而来的肽的应用。
8权利要求1到7中定义的用于HLA-依赖自身免疫性疾病诊断和/或治疗的一个或多个肽以合适的顺序的结合应用。
9．权利要求1到7中定义的用于HLA-Ⅰ类相关或HLA-Ⅱ类相关的依赖自身免疫性疾病诊断和/或治疗的一个或多个肽的应用。
10．权利要求10的，权利要求1到7中定义的用于以下非-HLA-B27相关自身免疫性疾病诊断和/或治疗的一个或多个肽的应用。这些疾病包括虹膜炎，眼色素层炎，银屑病或风湿病。
11．权利要求10的，权利要求1到7中定义的用于风湿病综合征如关节炎，银屑病关节炎或青少年类风湿关节炎的诊断和/或治疗的一个或多个肽的应用。
12．权利要求1到7中定义的用于HLA-B27相关自身免疫性疾病诊断和/或治疗的一个或多个肽的应用。
13．权利要求12的，权利要求1到7中定义的用于关节强硬性脊椎炎(Bechterew′s疾病)，银屑病关节炎，青少年类风湿关节炎，虹膜炎，眼色素层炎或银屑病的诊断和/或治疗的一个或多个肽的应用。
14以含有给予权利要求1到7中定义的一个或多个肽为特点的，治疗患有HLA-依赖的自身免疫性疾病病人的治疗方法。
15．以含有给予人体权利要求1到7中定义的一个或多个肽为特点的，体内诊断人HLA-依赖的自身免疫性疾病的方法。
16．用于诊断HLA-依赖性自身免疫性疾病的试剂盒，其中包括权利要求1到7中定义的一个或多个肽以及测试中所需的其它试剂。
17．具有下列序列的肽Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln-Thr-Asp-Arg-Glu-Asn-Leu-Arg-Thr或具有由上文提及的序列通过替代，修饰，删除，插入和/或末端加入单个氨基酸或相对较小的氨基酸集团衍生而来序列的肽。
18．具有下列序列的肽Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln或具有由上文提及的序列通过替代，修饰，删除，插入和/或末端加入单个氨基酸或相对较小的氨基酸集团衍生而来序列的肽。
19．具有下列序列的肽Leu-Asp-Leu-Asp-Ser-Ile-Ile-Ala-Glu-Val-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln-Tyr-Glu-Glu-Ile-Ala-Asn-Arg-Ser或具有由上文提及的序列通过替代，修饰，删除，插入和/或末端加入单个氨基酸或相对较小的氨基酸集团衍生而来序列的肽。
20．具有下列序列的肽Leu-Leu-Arg-Gly-Tyr-His-Gln-Asp-Ala-Tyr或具有由上文提及的序列通过替代，修饰，删除，插入和/或末端加入单个氨基酸或相对较小的氨基酸集团衍生而来序列的肽。
21．具有下列序列的肽Arg-Val-Ala-Glu-Gln-Leu-Arg-Ala-Tyr-Leu-Glu-Gly-Glu-Cys-Val或具有由上文提及的序列通过替代，修饰，删除，插入和/或末端加入单个氨基酸或相对较小的氨基酸集团衍生而来序列的肽。
22．通过常规方式按正确顺序将氨基酸连接起来，制备按照权利要求18到22之一的肽的方法。
全文摘要
本发明述及由HLA－B27的α1，α2功能域或人类角蛋白Ⅵ衍生而来的肽，以及这种特定的由HLA－B27α1，α2功能域或人类角蛋白Ⅵ衍生而来的肽在HLA－依赖性自身免疫疾病的诊断及治疗中的应用。
文档编号A61P19/02GK1237981SQ97199833
公开日1999年12月8日 申请日期1997年9月18日 优先权日1996年9月18日
发明者格希尔德·韦尔纳 申请人:格希尔德·韦尔纳