具有促进免疫能力的草药提取物组合物和方法

专利名称：具有促进免疫能力的草药提取物组合物和方法
技术领域：
描述草药学的历史无法避免地与现代药物紧密相关。已经从与特殊植物有关的古代传统疗法中开发出了许多类似的现代药物。许多植物的药物特性与已被分离、纯化并且在许多情况中是以合成方式再生的特殊化学方法制备的化合物相一致。许多众所周知的药物最初来源于植物。阿司匹林的前体水杨酸最初分离自白柳的树皮和合子叶属的植物。用于治疗疟疾的奎宁来源于金鸡纳树属。用于治疗癌症的长春新碱来源于滨螺属。治疗癌症的药物紫杉醇最初来源于太平洋紫杉树的树皮和针叶。也许最著名的是吗啡和可待因，它们来源于罂粟。吗啡仍然是所确定对疼痛具有缓解作用的新型合成药物的标准。
在有记载的历史之前就有将植物用于药物目的的应用。在伊拉克，已经发现旧石器时代的人骨周围仔细地放置了药用蜀葵根、风信子和欧蓍草。药用蜀葵根是一种具有抗炎特性的缓和的草药且可以将它用于治疗红肿或受刺激的粘膜。将风信子用作可促进组织排泄多余的水的利尿药。欧蓍草是一种传统治疗发冷和发热的药物，目前这种药物的应用一度如阿司匹林一样广泛。
现代的临床医生、特别是在美国的临床医生倾向于依赖使用合成的或化学方法制备的药物的疗法。药理学家们倾向于从植物中鉴定、分离、提取并合成活性化合物来用于治疗而不是在治疗中使用完整的植物或植物的提取物。然而，这种方法还存在缺点。在植物中除存在各种有生理活性的化合物外，还有矿物、维生素、糖苷、油、生物碱、生物类黄酮(bioflavinoids)和其它物质，它们在保持特定植物的药物特性方面可以起重要作用。这些另外的物质可以提供一种协同作用，而当单独使用纯化的或合成的有生理活性的化合物时，这种协同作用是不存在的。此外，纯化的有生理活性的化合物的毒性一般高于这些有生理活性的化合物与其它植物物质一起存在时的毒性。
各种草药的药剂、提取物、饮剂和治疗方法的功效是众所周知的且有治疗作用的草药产品正日益被看作是合成药物的替代品。例如，美国专利4,446,130中公开了人参提取物具有刺激和利尿作用的用途。美国专利4,886,665中公开了燕麦和荨麻提取物的药物制剂的用途。美国专利4,671,959中公开了天然油混合物用于缓解紧张的用途。美国专利5,064,675中涉及提供镇定作用的一种草药提取物组合物。美国专利5,407,675中公开了一种用于治疗头皮的草药提取物。美国专利5,178,865中公开了一种可在体外抑制人免疫缺陷病毒或HIV感染的草药提取物。美国专利5,500,340和美国专利5,294,443中公开了将草药提取物用于免疫抑制和自身免疫缺陷治疗的用途。
人体的免疫反应是极其复杂的并且需要通过免疫系统中所涉及的细胞的持续相互作用。胞内通讯由称作细胞因子的化学信使蛋白的分泌来促进，所述的化学信使蛋白通过促进细胞生长、促进细胞活化、指导细胞运输、刺激巨噬细胞功能、破坏抗原和其它功能来起作用。细胞因子一般包括由T-淋巴细胞分泌的淋巴因子和由单核细胞分泌的单核因子。用于防御病毒感染和肿瘤细胞生长的干扰素是一类重要的细胞因子。细胞因子还包括涉及细胞分化的白细胞介素和涉及介导炎症和细胞毒性反应的肿瘤坏死因子和转化生长因子。人体免疫反应中的另一组重要的蛋白质是由B淋巴细胞分泌的免疫球蛋白。免疫球蛋白用作抗病毒、细菌和其它抗原的抗体。
患有免疫抑制性疾病或疾患诸如人免疫缺陷病毒(HIV)、癌症、肝炎、肾衰竭、糖尿病、哮喘、关节炎等的人通常经历有淋巴细胞水平的下降和相应的细胞因子水平的下降。例如，如果个体被HIV所感染，那么带有称作CD4的细胞表面抗原的淋巴细胞以不典型的较低数量存在。而在健康的个体中，这些CD4淋巴细胞的细胞浓度约为800个细胞/毫升血清，当感染机会增加时，HIV感染的个体每毫升血清具有与200个一样少的CD4细胞。称作TH1和TH2细胞的特殊类CD4淋巴细胞似乎在对HIV感染的细胞介导的反应中特别重要。TH1细胞产生白细胞介素-2(IL-2)和γ-干扰素(IFNγ)。TH2细胞产生白细胞介素-4、-5和-10(IL-4、IL-5和IL-10)。认为由TH1和TH2细胞分泌的细胞因子相互具有对抗作用，由TH1细胞分泌的细胞因子起调节TH2细胞的细胞因子产生的作用，且反之亦然。在HIV感染过程中的早期，TH1反应占主导地位，而由TH1细胞分泌的IL-2可提高CD8淋巴细胞的活性。
将由淋巴细胞分泌的天然出现的干扰素、白细胞介素和免疫球蛋白适当设计以用于调节人体免疫反应，且用干扰素、白细胞介素和免疫球蛋白治疗免疫缺陷或免疫抑制的病人可以是有效的。借助于遗传工程技术进行工业化生产干扰素、白细胞介素和免疫球蛋白是众所周知的，其中将导致产生这些蛋白质的基因引入细菌，然后使所述细菌生长并收集它们。接着将由遗传修饰的细菌分泌的干扰素、白细胞介素和免疫球蛋白进行纯化并通过注射器或静脉内给药的方法将它们转运入患者体内。还没有获得用于将干扰素、白细胞介素和免疫球蛋白给予患者的口服给药方法，因为在它们被转运入血流前，胃酸和酶会破坏这些蛋白质。
认为各种草药对人体免疫系统具有有益的作用。例如认为紫松果菊和Echinacea Angustifolia可刺激T-细胞活性。见Mowery，D.B.；《草药的科学性论证》(The Scientific Validation of Herbal Medicine)，Keats Publisheng，Inc.，New Canaan Press，1986.P.118-119。认为黄芪能够刺激小鼠体内的干扰素和免疫球蛋白A和G(IgA和IgG)的产生。见Kaiser，J.D.；《免疫能力》(ImmunePower)。见《HIV的综合治疗程序》(A Comprehensive Treatment Program forHIV)，St.Martin’s Press，New York，1993，p.59-60。
然而，迄今还不了解来源于植物的或草药的提取物可有效地对人体免疫系统提供刺激或促进作用。
因此，存在一种对可提供身体保健以及对患抑制免疫反应的疾病或疾患的人体或动物体一般治疗的草药提取物组合物和方法的需求。本发明满足了这些需求以及其它需求并且一般克服了背景技术领域中发现的那些缺陷。
发明概括本发明涉及一种草药提取物组合物及其制备方法和将其用于刺激或促进人体和动物体内免疫反应的用途。将用于本发明的植物或草药的名称、分类和地理来源提供在下面的表1中。
表1所用的植物名 分类 来源 药用部位

一般来说，可以将上述各植物或草药的新鲜或干燥的叶、种子、树皮、果实、果皮、花和/或根用于制备如下详述的本发明的草药提取物组合物。当然，用于提取过程的疆南星属、石榴属、木槿属和茶的优选药用部位如表1中所示。尽管可以选择用水醇溶液和乙醇进行提取，但是一般用热水提取所述草药。
概括地说，本发明的草药提取物组合物包括疆南星属植物的提取物。本发明的另一个实施方案是包括约10％-约90％的疆南星属植物提取物和约10％-约90％的石榴属植物提取物的草药提取物组合物。本发明的草药提取物可以组合物进一步包括约10％-约90％的木槿属植物提取物和/或约10％-约90％的茶提取物。优选的情况是，本发明的草药提取物组合物包括通常为等份的疆南星属植物提取物、石榴属植物提取物、木槿属植物提取物和茶提取物。
本发明的草药提取物组合物为人饮食提供了一种健康和营养补剂，即它含有维生素C、维生素E、维生素D2、维生素D3、维生素K、溶解的矿物包括磷、钠、钾、锌、镁和铜、以及大量有益的蛋白质。所述的蛋白质包括各种细胞因子或细胞因子样蛋白质以及免疫球蛋白和免疫球蛋白样蛋白质，认为这些物质可对免疫系统提供一种刺激或促进作用。作为一种营养补剂，本发明的草药提取物组合物可以通过口服、或可以通过局部给药来吸收。
实验结果(下述)表明本发明的草药提取物组合物可有效地促进人体免疫反应。体外实验证明本发明的草药提取物组合物通过刺激淋巴细胞的胚细胞样转变或胚细胞转化并通过刺激来自正常人体、来自白血病患者和来自患肾衰竭病人淋巴细胞悬浮液中的细胞因子产生来刺激细胞介导的免疫性。最初的实验结果还表明本发明的草药提取物组合物可有效地抑制内外的HIV感染。这些实验和产生的数据证实本发明的草药提取物组合物是有潜力的免疫疾病疗法的一种有用的来源或候选者。
本发明草药提取物组合物的制备方法优选包括制备疆南星属植物提取物、制备石榴属植物提取物、制备木槿属植物提取物、制备茶提取物并且将疆南星属植物、石榴属植物、木槿属植物、茶的提取物进行合并的步骤。
用于刺激体外细胞介导的免疫性的本发明的使用方法包括使细胞与有效量的一种制剂接触或使细胞暴露在该制剂中的步骤，所述的制剂主要由疆南星属植物提取物、石榴属提取物、木槿属植物提取物和茶提取物组成。
用于刺激体外淋巴细胞胚细胞样转变的本发明的使用方法包括使淋巴细胞悬浮液与有效量的一种制剂接触或使淋巴细胞悬浮液暴露在该制剂中的步骤，所述的制剂主要由疆南星属植物提取物、石榴属植物提取物、木槿属植物提取物和茶提取物组成。
用于刺激体外外周单核血细胞中细胞因子产生的本发明的使用方法包括使这类细胞与有效量的一种制剂接触或使这类细胞暴露在该制剂中的步骤，所述的制剂主要由疆南星属植物提取物、石榴属植物提取物、木槿属植物提取物和茶提取物组成。
本发明的一个目的是提供一种作为患免疫抑制和自身免疫疾病、障碍、感染或疾患的人体和动物体的疗法和治疗的有用来源或候选者的草药提取物组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种对人体和动物体提供营养饮食补剂的草药提取物组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种可刺激或促进人体和动物体内免疫反应的草药提取物组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种可刺激体外细胞介导的免疫性的草药提取物组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种可刺激人体或动物体内细胞介导的免疫性的草药提取物组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种可刺激体外淋巴细胞胚细胞转化或胚细胞样转变的草药提取物组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种可刺激人体和动物体内淋巴细胞的胚细胞转化或胚细胞样转变的草药提取物组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种可刺激体外外周单核血细胞中细胞因子产生的草药提取物组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种可刺激人体和动物体内细胞因子产生的草药提取物组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种可刺激体外抑制gp120与MT4细胞结合的草药提取物组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种可体外抑制MT4细胞的HIV感染的草药提取物组合物和方法。
用于抑制人体内HIV感染的草药提取物组合物，该组合物包括疆南星属植物提取物、石榴属植物提取物、木槿属植物提取物和茶提取物。
本发明的另一个目的是提供一种用于治疗免疫抑制性疾病和疾患的草药提取物组合物和方法，该组合物和方法相对来说是无毒性的。
本发明的另一个目的是提供一种包括各种细胞因子和/或细胞因子样蛋白质以及免疫球蛋白和/或免疫球蛋白样蛋白质的草药提取物组合物。
本发明的另一个目的是提供一种含有维生素C、维生素E、维生素D2、维生素D3、维生素K、溶解的矿物包括磷、钠、钾、锌、镁和铜、以及大量有益蛋白质的草药提取物组合物。
本发明的另外的目的和优点将在本说明书的下述部分中阐述，其中具体的描述是用于完整地公开本发明优选实施方案的目的而非用来限制本发明。
附图的简要描述本发明参照下列附图来更完整地理解，这些附图仅用于解释的目的。
附

图1是本发明草药提取物组合物对正常淋巴细胞的胚细胞样转变的作用的图解。
附图2是本发明草药提取物组合物对来自白血病患者淋巴细胞的胚细胞样转变的作用的图解。
附图3是本发明草药提取物组合物对来自患肾衰竭病人淋巴细胞的胚细胞样转变的作用的图解。
优选实施方案的详细描述本发明一般涉及疆南星属、石榴属、木槿属和茶的草药提取物及其各种组合物用于促进或刺激人体和动物体内免疫反应的用途、用于治疗患免疫抑制和自身免疫疾病或疾患的人体或动物体的用途以及用于抑制人体内HIV感染的用途。
实施例1说明了疆南星属、石榴属、木槿属和茶的草药提取物的制备方法和组合物。实施例2涉及包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物用于体外正常淋巴细胞悬浮液的胚细胞转化的用途。实施例3涉及包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物用于体外来自患急性白血病病人外周血液淋巴细胞的胚细胞样转变的用途。实施例4涉及包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物用于体外来自患肾衰竭病人外周血液淋巴细胞的胚细胞样转变的用途。实施例5涉及包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物用于体外刺激来自正常患者外周单核血细胞(PMBC)中的细胞因子产生的用途。实施例6描述了包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物用于体外抑制如用OKT-4AmAb结合物所测定的gp120与MT-4细胞结合的用途。实施例7描述了包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物用于体外抑制如抗gp120 mAb所测定的gp120与MT-4细胞结合的用途。实施例8描述了合并的疆南星属、石榴属、木槿属和茶的提取物的分析实验。
实施例1
提取物的制备本实施例描述了疆南星属、石榴属、木槿属和茶的提取物的制备方法和组合物。用于提取过程的疆南星属、石榴属、木槿属和茶的优选植物部位参照上述表1中来确定。可以将下述工艺扩大至生产较大量的提取物。用于制备下列提取物的具体工艺反映了目前优选的用于提取物制备的方法且不应将它们看作起限定作用。下述的用量和时间基实际上可以改变以提供合适的本发明的疆南星属、石榴属、木槿属和茶的提取物。
1.疆南星属植物提取物的制备将约20g干燥的、精细粉碎的疆南星属植物和1升蒸馏水加入到一种不锈钢压力蒸煮容器中并用不锈钢盖加以密封。将其中的混合物加热至沸腾(约100℃)并使其沸腾约45分钟，然后将其加热至130℃并沸腾约15分钟，接着使其冷却至100℃以下以得到一种疆南星属植物的液体提取物。按照下述方式使用仍然是温或热的疆南星属植物提取物。
2.石榴属植物提取物的制备将约60g干燥的、精细粉碎的石榴属植物和1升蒸馏水加入到一种不锈钢压力蒸煮容器中并用不锈钢盖加以密封。将其中的混合物加热至沸腾(约100℃)并使其沸腾约45分钟，然后将其加热至130℃并沸腾约15分钟，接着使其冷却至100℃以下以得到一种石榴属植物的液体提取物。按照下述方式使用仍然是温或热的石榴属植物提取物。
3.木槿属植物提取物的制备将约15g干燥的、精细粉碎的木槿属植物和1升蒸馏水加入到一种不锈钢压力蒸煮容器中并用不锈钢盖加以密封。将其中的混合物加热至沸腾(约100℃)并使其沸腾约45分钟，然后将起加热至130℃并沸腾约15分钟，接着使其冷却至100℃以下以得到一种木槿属植物的液体提取物。按照下述方式使用仍然是温或热的木槿属植物提取物。
4.茶提取物的制备将约40g干燥的、精细粉碎的茶和1升蒸馏水加入到一种不锈钢压力蒸煮容器中并用不锈钢盖加以密封。将其中的混合物加热至沸腾(约100℃)并使其沸腾约45分钟，然后将其加热至130℃并沸腾约15分钟，接着使其冷却至100℃以下以得到一种茶的液体提取物。按照下述方式使用仍然是温或热的茶提取物。
5.合并的疆南星属和石榴属提取物的制备将仍然是温或热的(约40℃-100℃)疆南星属植物提取物和石榴属植物提取物各约50ml转入一种不锈钢压力蒸煮容器中并用不锈钢盖加以密封、彼此加热、同时在约100℃下持续混合或搅拌约1.5小时。可以将如此获得的混合物冷却并在冷藏条件下保存、或者如下所述将仍然是温或热的混合物用于制备进一步的提取物组合物。通过一般相同的工艺步骤还可以制备合并的疆南星属和木槿属的提取物、合并的疆南星属和茶的提取物、合并的石榴属和木槿属的提取物、以及合并的石榴属和茶的提取物。
6.合并的疆南星属、石榴属、木槿属和茶的提取物的制备将仍然是温或热的(约40℃-100℃)如上所述制备的约100ml合并的疆南星属和石榴属的提取物与如上所述制备的木槿属提取物和如上所述制备的茶的提取物各约50ml一起转入一种不锈钢压力蒸煮容器中并用不锈钢盖加以密封、彼此加热、同时在约100℃下持续混合或搅拌约1.5小时。如此获得的混合物一般含有如上所述等份的每一种疆南星属、石榴属、木槿属和茶的提取物。使合并的疆南星属、石榴属、木槿属和茶的提取物的混合物冷却至室温。在冷却过程中，将缓冲溶液(Na2PHO4/NaH2PO4)加入所述的合并的混合物中，此时该混合物处于约30℃-60℃的温度下，从而使该混合物的pH呈弱酸性。尽管达到pH低于7是合适的，但是优选的情况是将所述合并的提取物的pH调节至约4.0，且更优选调节至约3.8。在上述过程之后，将合并的疆南星属、石榴属、木槿属和茶的提取物在约4℃的冷藏条件下保存。可以向所述合并的提取物中加入微量的苯甲酸钠作为一种防腐剂，如果需要可以加入调味剂或食用色素。
疆南星属、石榴属、木槿属和茶的提取物的合并的混合物的化学分析结果如下列实施例8中中所述。
通过省去茶提取物的步骤而将上述工艺步骤用于制备合并的疆南星属、石榴属和木槿属的提取物的混合物。通过省去木槿属提取物的步骤还将上述工艺步骤用于制备合并的疆南星属、石榴属和茶的提取物的混合物。通过省去疆南星属提取物的步骤而进一步将上述工艺步骤用于制备合并的石榴属、木槿属和茶的提取物的混合物。通过省去疆南星属和茶的提取物的步骤而进一步将上述工艺步骤用于制备合并的石榴属和木槿属的提取物的混合物。
实施例2来自正常患者淋巴细胞的体外胚细胞(Blast)转化本实施例描述了实施例1中所述的包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物对细胞介导的免疫性的作用，它由体外正常淋巴细胞的胚细胞转化或胚细胞样转变来确定。
胚细胞样转变是诱导细胞介导的免疫性的起始步骤并且与主要导致免疫系统胞内相互作用的各种白细胞介素的释放或分泌有关。细胞介导的免疫性涉及人体对恶性肿瘤、包括HIV在内的某些病毒感染、胞内细菌感染的防御作用以及调节不同细胞和体液免疫相互作用和预防自身免疫反应。
通过常规的淋巴细胞刺激试验来测定胚细胞的转化，其中将3H(氚化的)胸苷加入淋巴细胞悬浮液，随后温育、收集细胞并测定所收集细胞的放射活性。高放射活性计数表明所述淋巴细胞已经经受了转化过程并吸收了3H胸苷。
通过菲可甲泛影钠(Ficoll Isopaque)上的密度梯度分离来获得来自3个正常患者全血的淋巴细胞。在多孔微量滴定板中制备Hanks溶液中含有淋巴细胞的悬浮液，所述的Hanks溶液用10％胎牛血清、青霉素和链霉素补充。向所述平板的各孔中加入5μl、10μl和20μl的疆南星属、石榴属、木槿属、茶的提取物的合并的混合物。各孔中淋巴细胞悬浮液的终体积为0.2ml。然后在37℃下的CO2培养箱中将所述的微量滴定板温育72小时。向各孔中添加0.05ml的3H(氚化的)胸苷，随后在37℃下进一步温育24小时，此后，用自动多功能收集器收集孔中物并用一种闪烁计数器来测定放射活性。从合并提取物的各自浓度的平均计数来计算刺激指数。结果如表2和附图1中所示。
表2

表2和附图1中解释的结果证实向淋巴细胞悬浮液中添加增加量的合并提取物这一过程导致淋巴细胞转化或胚细胞样转变的量或程度增加，正如因3H吸收增加而导致放射计数增加所证实的一样。这些结果表明包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物可通过刺激正常人体中胚细胞样转变和产生的细胞因子分泌来促进或刺激细胞介导的免疫性。这些结果进一步证明本发明的草药提取物组合物是有潜力的免疫疾病疗法和治疗的有用的来源或候选者。
实施例3来自患急性白血病病人的外周血液淋巴细胞的体外胚细胞样转变本实施例描述了实施例1中所述的包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物对细胞介导的免疫性的作用，它进一步由来自5个白血病患者淋巴细胞的体外胚细胞转化或胚细胞样转变或来确定。PHA(植物凝集素)是一种公知的强力促分裂原，它可刺激淋巴细胞转化，将它用作对照以计量或测定所述合并的提取物的功效。
在多孔微量滴定板中制备Hanks溶液中含有的来自5个白血病患者的淋巴细胞悬浮液，所述的Hanks溶液用10％胎牛血清、青霉素和链霉素补充。向所述平板的各孔中加入5μl、10μl和20μl的疆南星属、石榴属、木槿属、茶的提取物的合并的混合物。另外，将PHA(植物凝集素)按照1∶50和1∶100的浓度添加到孔中作为对照。各孔中淋巴细胞悬浮液的终体积为0.2ml。然后在37℃下的CO2培养箱中将所述的微量滴定板温育72小时。此后向各孔中添加0.05ml的3H(氚化的)胸苷，随后在37℃下进一步温育24小时。用自动多功能收集器收集孔中物并用一种闪烁计数器来测定放射活性。对合并提取物的各自浓度计算刺激指数。结果如表3和附图2中所示。
表3<


表3和附图2中解释的结果证实向来自白血病患者的淋巴细胞悬浮液中添加增加量的合并提取物这一过程导致淋巴细胞转化或胚细胞样转变的量的增加，正如因3H吸收增加而导致放射计数增加所证实的一样。包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物表现出一种至少与PHA同样大的可刺激淋巴细胞转化的能力。用最高(20μl)为306％的浓度可增加胚细胞转化的刺激程度。这些结果表明包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物可通过刺激患白血病病人的淋巴细胞中淋巴细胞胚细胞样转变和由此产生的细胞因子分泌来促进或刺激体外细胞介导的免疫性。这些结果进一步证明本发明的草药提取物组合物是有潜力的免疫疾病疗法和治疗的有用的来源或候选者。
实施例4来自患肾衰竭病人的外周血液淋巴细胞的体外胚细胞样转变本实施例描述了实施例1中所述的包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物对细胞介导的免疫性的作用，它进一步由来自15个患肾衰竭病人淋巴细胞的体外胚细胞转化或胚细胞样转变来确定。将两种浓度的PHA(植物凝集素)用作对照以计量或测定所述合并的提取物的功效。
在多孔微量滴定板中制备Hanks溶液中含有的淋巴细胞悬浮液，所述的Hanks溶液用10％胎牛血清、青霉素和链霉素补充。向所述平板的各孔中加入5μl、10μl和20μl用量的疆南星属、石榴属、木槿属、茶的提取物的合并的混合物。将PHA(植物凝集素)按照1∶50和1∶100的浓度添加到孔中作为对照。各孔中淋巴细胞悬浮液的终体积为0.2ml。然后在37℃下的CO2培养箱中将所述的微量滴定板温育72小时。此后向各孔中添加0.05ml的3H(氚化的)胸苷，随后在37℃下进一步温育24小时。用自动多功能收集器收集孔中物并用一种闪烁计数器来测定放射活性。对合并提取物的各自浓度计算刺激指数。结果如表4和附图3中所示。
表4

表4和附图3中解释的结果证实向来自肾衰竭患者的淋巴细胞悬浮液中添加增加量的合并提取物这一过程导致淋巴细胞转化或胚细胞样转变的量的增加，正如因3H吸收增加而导致放射计数增加所证实的一样。包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物表现出一种至少与PHA同样大的可刺激淋巴细胞转化的能力。用最高(20μl)为306％的浓度可增加胚细胞转化的刺激程度。这些结果表明包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物可通过刺激患肾衰竭病人的淋巴细胞中淋巴细胞胚细胞样转变和产生的细胞因子分泌来促进或刺激体外细胞介导的免疫性。这些结果进一步证明本发明的草药提取物组合物是有潜力的免疫疾病疗法和治疗的有用的来源或候选者。
实施例5正常人体中刺激细胞因子的产生使用由D.Schols和E. De Clencq在《病毒学杂志》第70卷第4954-4960页(1996)中发表的“人体免疫缺陷病毒gp120型通过诱导白细胞介素产生而在人体外周血液淋巴细胞中诱导无反应性”中所述的


正如在表5中可以观察到的，包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物的存在可诱导产生的大量白细胞介素10(IL-10)和γ-干扰素(IFN-γ)超过了在不含草药提取物的孔中分泌的水平。在孔中检测到了白细胞介素2(IL-2)，孔中存在的合并的提取物的浓度为10％。正如由锥虫蓝所测定的，在10％浓度的合并提取物下在细胞培养物中没有观察到毒性。这些结果表明合并的疆南星属、石榴属、木槿属和茶的提取物可促进或刺激体外来自正常人体PMBCs中的细胞因子的产生。这些结果进一步证明本发明的草药提取物组合物是有潜力的免疫疾病疗法和治疗的有用的来源或候选者。
实施例6用OKT-4A单克隆抗体测定的gp120与MT-4细胞结合的体外抑制使用由J.Neyts，D.Reymen，D.Letourneur，J.Jozefonvicz，D.Schols，J.Este，G.Andrei，P.Mckenna，M.Witvrouw，S.Ikeda，J.Clements和E.De Clercq在《生物化学和生物药理学》(Biochem.Pharmacol.)第50卷第743-751页(1995)中的“衍生的葡聚糖的不同抗病毒活性”一文(将该文献的内容引入本文作为参考)中所述的方法来测定包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物(“合并的提取物”)对如用OKT-4A单克隆抗体(mAb)检测到的rpg120与MT-4结合的作用。与OKT-4A表位结合的HIV包被蛋白gp120阻断了OKT-4AmAb的竞争性结合。合并的疆南星属、石榴属、木槿属和茶的提取物阻断了gp120的结合，如表6中所示。
表6

正如在表6中可以观察到的，增加量的包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物可导致增加对gp120与MT-4细胞结合的抑制。这些结果证明本发明包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物是有潜力的体内抗HIV疗法和受感染宿主内疗法的有用的来源或候选者。
实施例7用抗-gp120单克隆抗体测定的gp120与MT-4细胞结合的体外抑制使用由D.Schols，M.Baba，R.Pauwels和E.De Clercq在“为证明抗-HIV-1剂是否抑制病毒粒子结合T4+细胞的流式细胞法”一文(将该文献的内容引入本文作为参考)中所述的方法来测定包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物(“合并的提取物”)对如用抗-gp120单克隆抗体(mAb)检测到的rpg120与MT-4结合的作用。合并的疆南星属、石榴属、木槿属和茶的提取物阻断了gp120的结合，如表7中所示。
表7

正如在表7中可以观察到的，增加量的包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物可抑制gp120与MT-4细胞的结合。这些结果证明本发明包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物是有潜力的体内抗HIV疗法和受感染宿主内疗法的有用的来源或候选者。
实施例8合并的提取物的化学分析使用常规的分析技术来检测包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物的化学组成，所检测的对象是各种维生素、脂肪、染料、蛋白质、矿物和其它化合物。将这些分析结果概括在表8中。
表8


正如在表8中可以观察到的，包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物包括大量的主要维生素包括维生素C、维生素E、维生素K、维生素D2、维生素D3以及各种主要的矿物和其它有益的物质且由此在口服吸收时可提供一种有用的营养饮食补充。
表7中所示的分析结果还表明在包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物中存在细胞因子或细胞因子样蛋白质。特别地，在合并的疆南星属、石榴属、木槿属和茶的提取物中存在可检测到量的IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ和IFN-α。另外，看起来在包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物中存在微量的IgG或免疫球蛋白样蛋白质。存在的人体L-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、IFN-α和IgG与草药提取物组合物中的植物来源稍有不同。然而，公知植物抗病毒因子(AVF)具有与人体β-干扰素(IFNβ)同源的封闭序列，且认为与人体干扰素具有类似方式的突出抗病毒活性。因此，上述IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、IFN-α和IgG的阳性结果可能是由于包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物中存在的白细胞介素样蛋白质、干扰素样蛋白质、TNF样蛋白质和免疫球蛋白样蛋白质所导致的。因此，应将本文所用的术语“包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物”理解为还包括或含有IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、IFN-α和IgG以及白细胞介素样蛋白质、干扰素样蛋白质、TNF样蛋白质和免疫球蛋白样蛋白质。
讨论上述体外实验和产生的数据证明本发明的草药提取物组合物是对有疾病、疾病感染或疾患的人体和动物体的免疫促进疗法和治疗的有用的和有潜力的来源或候选者，所述的疾病或疾病感染和疾患包括因白血病、肾衰竭、各种癌症和肿瘤、病毒感染、细菌感染和寄生虫感染导致的免疫抑制性疾患。还没有阐明导致刺激体外胚细胞转化和细胞因子产生的准确的化学成分和药理学机理。本发明的草药提取物组合物可以含有一种单一的药理学上的活性组分、成分或单独起作用的试剂或这类组分、成分或试剂的组合物和/或其单独或协同起作用的生物代谢物或衍生物。使用本发明草药提取物组合物的体内疗法和治疗可能以所述草药提取物组合物口服吸收的液体或固体剂型为主。本发明草药提取物组合物的体内给药方式还可能是通过直肠、非肠道、静脉、局部、雾化吸入或皮下的给药途径。还可以将所述的草药提取物组合物以与合适的赋形剂、载体、抗病毒剂、免疫调制剂、化疗剂、抗体或其结合物的混合物或组合物的方式进行体内给药。本发明的药物制剂可以是诸如片剂、胶囊、栓剂、安瓿或计量的液体或气雾剂这样的剂型。
目前，认为疆南星属和/或石榴属中存在本发明的药理学上的活性成分。最初的实验表明单一的疆南星属提取物、单一的石榴属提取物和合并的疆南星属和石榴属的提取物表现出某些免疫促进作用。不过，本发明的优选实施方案包括合并的疆南星属和石榴属以及木槿属和茶的提取物。认为木槿属植物和茶具有起赋形剂或载体的另外的成分或试剂的作用或者它们另外与由疆南星属和石榴属提供的成分一起具有一种协同作用。此外，认为包括疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物的草药提取物组合物的优选的制备方法(其中将合并的提取物在如实施例1中所述的阶段中进行加热)比仅将疆南星属提取物、石榴属提取物、木槿属提取物和茶提取物相互混合或合并而不对其另外进行加热的方法更具有优点。
上述体外实验和产生的数据还证明本发明的草药提取物组合物是对患HIV、其它病毒感染、或与这类病毒感染相关的合并症或疾患的人体和动物体的抗HIV和其它抗病毒疗法和治疗的有用而有潜力的来源或候选者。本发明的草药提取物组合物大概可以抑制或预防细胞被各种不同病毒感染，所述的病毒包括但不限于单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、痘苗病毒、疱疹性口腔炎病毒、柯萨奇病毒、合胞病毒、巨细胞病毒、和水痘-带状疱疹病毒。具有抗-HIV活性的本发明草药提取物组合物可以含有一种单一的药理学上的活性组分、成分或单独起作用的试剂或这类组分、成分或试剂的组合物和/或其生物代谢物或衍生物。使用本发明草药提取物组合物抗-HIV和抗病毒治疗的体内疗法和治疗可能以所述草药提取物组合物的口服吸收或局部施用的液体或固体剂型为主。本发明草药提取物组合物的体内给药方式还可能是通过直肠、非肠道、静脉、雾化吸入或皮下的给药途径。作为用于免疫抑制性治疗的疗法，还可以将所述的草药提取物组合物以与合适的赋形剂、载体、抗病毒剂、免疫调制剂、化疗剂、抗体、抗病毒剂或其结合物的混合物或组合物的方式进行抗病毒疗法的体内给药。本发明的药物制剂可以是诸如片剂、胶囊、栓剂、洗剂、安瓿或计量的液体或气雾剂这样的剂型。
因此，可以看出本发明提供了一种可提供营养补充的草药提取物组合物，它可刺激体外细胞介导的免疫性、刺激体外淋巴细胞胚细胞样转变、通过淋巴细胞刺激体外细胞因子的产生、抑制体外HIV感染；且本发明提供的草药提取物组合物还为促进或刺激人体和动物体内的免疫反应治疗和疗法提供了一种有潜力的候选者。尽管上述描述包括了许多特征，但是不应将它们看作用来限定本发明的范围，而仅是对目前本发明的优选实施方案提供一种解释性说明。因此，本发明的范围由所附的权利要求及其符合权利要求的相同内容来确定。
权利要求
1.一种用于刺激细胞介导的免疫性的草药提取物组合物，包括疆南星属植物的提取物。
2.一种如权利要求1中所述的草药提取物组合物，进一步包括石榴属植物的提取物。
3.一种如权利要求1中所述的草药提取物组合物，进一步包括木槿属植物的提取物。
4.一种如权利要求1中所述的草药提取物组合物，进一步包括茶的提取物。
5.一种如权利要求2中所述的草药提取物组合物，进一步包括木槿属植物的提取物。
6.一种如权利要求2中所述的草药提取物组合物，进一步包括茶的提取物。
7.一种如权利要求5中所述的草药提取物组合物，进一步包括茶的提取物。
8.一种用于刺激细胞介导的免疫性的草药提取物组合物，包括石榴属植物的提取物。
9.一种如权利要求8中所述的草药提取物组合物，进一步包括木槿属植物的提取物。
10.一种如权利要求8中所述的草药提取物组合物，进一步包括茶的提取物。
11.一种如权利要求9中所述的草药提取物组合物，进一步包括茶的提取物。
12.一种制备用于刺激细胞介导的免疫性的草药提取物组合物的方法，包括下列步骤(a)通过在水中煮沸干燥的、精细粉碎的疆南星属的植物来制备疆南星属植物的提取物；和(b)通过在水中煮沸干燥的、精细粉碎的石榴属的植物来制备石榴属植物的提取物；和(c)合并所述的疆南星属植物的提取物和所述的石榴属植物的提取物并且煮沸所述合并的疆南星属植物和石榴属植物的提取物。
13.一种如权利要求12中所述的制备草药提取物的方法，进一步包括下列步骤(a)通过在水中煮沸干燥的、精细粉碎的木槿属的植物来制备木槿属植物的提取物；(b)通过在水中煮沸干燥的、精细粉碎的茶来制备茶的提取物；和(f)将所述的木槿属植物的提取物和所述的茶的提取物与所述合并的疆南星属植物和石榴属植物的提取物进行合并并且将所述合并的疆南星属植物、石榴属植物、木槿属植物、茶的提取物煮沸。
14.一种用于在体外刺激细胞介导的免疫性的方法，包括使细胞与有效量的一种制剂接触的步骤，所述的制剂主要由疆南星属植物的提取物、石榴属植物的提取物、木槿属植物的提取物和茶的提取物组成。
15.一种如权利要求14中所述的用于在体外刺激细胞介导的免疫性的方法，其中所述的细胞包括来源于普通病人的细胞。
16.一种如权利要求14中所述的用于在体外刺激细胞介导的免疫性的方法，其中所述的细胞包括来源于患白血病病人的细胞。
17.一种如权利要求14中所述的用于在体外刺激细胞介导的免疫性的方法，其中所述的细胞包括来源于患肾衰竭病人的细胞。
18.一种用于在体外刺激淋巴细胞胚细胞样转变的方法，包括使淋巴细胞悬浮液与有效量的一种制剂接触的步骤，所述的制剂主要由疆南星属植物的提取物、石榴属植物的提取物、木槿属植物的提取物和茶的提取物组成。
19.一种如权利要求18中所述的用于在体外刺激细胞介导的免疫性的方法，其中所述的淋巴细胞悬浮液包括来源于普通病人的淋巴细胞。
20.一种如权利要求18中所述的用于在体外刺激细胞介导的免疫性的方法，其中所述的淋巴细胞悬浮液包括来源于患白血病病人的淋巴细胞。
21.一种如权利要求18中所述的用于在体外刺激细胞介导的免疫性的方法，其中所述的淋巴细胞悬浮液包括来源于患肾衰竭病人的淋巴细胞。
22.一种用于在体外刺激细胞因子产生的方法，包括使外周单核血细胞与有效量的一种制剂接触的步骤，所述的制剂主要由疆南星属植物的提取物、石榴属植物的提取物、木槿属植物的提取物和茶的提取物组成。
23.一种如权利要求22中所述的用于在体外刺激细胞介导的免疫性的方法，其中所述的外周单核血细胞从普通病人中获得。
24.一种如权利要求22中所述的用于在体外刺激细胞介导的免疫性的方法，其中所述的外周单核血细胞从患白血病的病人中获得。
25.一种如权利要求22中所述的用于在体外刺激细胞介导的免疫性的方法，其中所述的外周单核血细胞从患肾衰竭的病人中获得。
26.一种用于在体外抑制HIV感染的方法，包括使细胞与有效量的一种制剂接触的步骤，所述的制剂主要由疆南星属植物的提取物、石榴属植物的提取物、木槿属植物的提取物和茶的提取物组成。
27.一种用于在体外抑制gp120与MT-4细胞结合的方法，包括使所述的MT-4细胞与有效量的一种制剂接触的步骤，所述的制剂主要由疆南星属植物的提取物、石榴属植物的提取物、木槿属植物的提取物和茶的提取物组成。
28.一种用于刺激细胞介导的免疫性的草药提取物组合物，包括疆南星属植物的水提取物、石榴属植物的水提取物、木槿属植物的水提取物和茶的水提取物的混合物。
29.权利要求28的草药提取物组合物，其中所述的组合物进一步包括至少一种细胞因子。
30.权利要求29的草药提取物组合物，其中所述的细胞因子是一种白细胞介素。
31.权利要求29的草药提取物组合物，其中所述的细胞因子是一种干扰素。
32.权利要求28的草药提取物组合物，其中所述的组合物进一步包括至少一种肿瘤坏死因子。
33.权利要求28的草药提取物组合物，其中所述的组合物进一步包括至少一种免疫球蛋白。
34.权利要求28的草药提取物组合物，其中所述的组合物进一步包括多糖。
35.权利要求28的草药提取物组合物，其中所述的组合物进一步包括蛋白质。
36.权利要求28的草药提取物组合物，其中所述的组合物进一步包括RNA。
37.权利要求28的草药提取物组合物，其中所述的组合物进一步包括DNA。
38.权利要求28的草药提取物组合物，其中所述的组合物含有大约等份的所述植物的水提取物。
全文摘要
一种草药提取物组合物,包括疆南星属植物的提取物、石榴属植物的提取物、木槿属植物的提取物和茶的提取物。本发明的草药提取物组合物可在体外显示出刺激淋巴细胞转化和细胞因子产生的作用并可在体外显示出抑制gp120结合的作用,且本发明的草药提取物组合物为免疫疾病和HIV感染的疗法和治疗提供了具有潜能的候选药物。
文档编号A61K36/00GK1272792SQ99800880
公开日2000年11月8日 申请日期1999年6月19日 优先权日1998年6月23日
发明者阿迈德·A·谢哈德 申请人:阿迈德·A·谢哈德