一种调节免疫力的中药组合物及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：一种调节免疫力的中药组合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药领域，尤其涉及具有调节免疫力的中药组合物。
背景技术：
免疫力是机体以免疫器官和免疫球蛋白等免疫组分为物质基础、识别和排除抗原性异物的功能，即机体区分自己和非己的功能，从而抵抗疾病、维持机体生理平衡。它能通过人体免疫系统识别人体内正常与不正常的微生物和细胞等，并通过免疫应答排除内、外致病微生物和变性、衰老的细胞。通俗地说免疫力就是免疫系统发挥出来的保护我们机体的能力，可以作为免疫功能的衡量指标。
T细胞是白血球细胞，在免疫系统中扮演很重要的角色。人体内有二种主要的T细胞，其中一种是称为CD4的细胞，在T细胞的表面。这些CD4细胞又称为免疫系统的“辅助手”(helper)，能指挥身体对抗微生物，例如病毒。根据世界卫生组织报道，正常人类CD4的值在700-1100个/立方毫米范围内，该值在一定程度上说明了人体免疫力的正常值。一般说来，当人体CD4的值不在上述范围内时，人体的免疫功能过度或低下，即免疫功能失调，可能会引发疾病。
免疫系统的作用是搜寻、识别并攻击引起疾病的物质或病原体，如细菌或病毒。当免疫系统功能失调，即人体免疫力不正常时，会引发很多疾病，例如过激的免疫反应会引起自体免疫性疾病，如糖尿病等；当免疫功能低下或缺乏时会引发免疫缺陷疾病；当免疫监视功能失调时(此时免疫力低于正常值)，会导致免疫系统不能及时识别和清除体内产生的变异细胞，这是产生肿瘤、发生癌变的主要原因和决定因素。就是说，当人体免疫力过高和过低时，都会引发疾病。因此调节免疫力对保障人体健康是非常重要的。
艾滋病(AIDS)医学全名为“获得性免疫缺陷综合征”。它是由艾滋病病毒，即人类免疫缺陷病毒(HIV)侵入人体后，破坏人体免疫功能而使人体发生一系列不可治愈的感染和肿瘤，最后导致患者死亡的传染病。艾滋病病毒攻击对象是CD4细胞，通过攻击T4细胞来破坏人体的免疫系统。当CD4下降到一定程度，而CD8数量还保持在较高水平时，人体免疫系统将被抑制，免疫能力遭到破坏。所以其检测结果对艾滋病治疗效果的判断和对患者免疫功能的判断有重要作用。病毒载量是指血液中艾滋病病毒核酸拷贝数，即病毒数量。反映了病毒的繁殖水平，是检测感染情况、指导治疗、反映疗效和预后的重要指标。当前国际治疗艾滋病的目标为，尽可能降低病毒载量，获得免疫功能重建和/或维持免疫功能(主要表现为CD4细胞数量的上升)，提高其生活质量并延长患者生命。
现有治疗艾滋病的药物，一般是通过杀死HIV病毒来起到治疗效果的，但是其无法提高CD4细胞数量，而且往往由于杀死HIV病毒致使杀死病毒寄宿的CD4细胞而导致CD4细胞数量下降，所以不能改善患者或病毒携带者的免疫功能。
糖尿病的症状主要表现为高血糖值，还表现为多尿、多饮、消瘦等，其具有多种并发症，例如疲乏无力、容易感染、皮肤感觉异常(如麻木、搔痒、蚁走感、针刺感等)、视力障碍，这些并发症波及全身多个器官，尤其是并发症导致的致残率和致死率极大地威胁人类健康。
癌症，即恶性肿瘤，常见癌症有宫颈癌、肺癌、神经母细胞瘤、肝癌、结肠癌等，是致死率极高的疾病。
到目前为止，还没有公开过关于调节免疫功能，尤其是可以治疗艾滋病、糖尿病和癌症等由免疫功能失调引发的疾病的中药组合物。

发明内容
本发明的目的在于提供一种中药组合物，其可以调节人体免疫力。
本发明的另一目的在于提供制备上述中药组合物的方法。
本发明的另一目的还在于提供上述中药组合物的用途。
本发明的另一目的还在于提供使用上述中药组合物调节人体免疫功能的方法。
本发明的另一目的还在于提供使用上述中药组合物治疗由于免疫功能失调而引发的疾病的方法。
本发明的另一目的还在于提供使用上述中药组合物治疗艾滋病的方法。
本发明的另一目的还在于提供使用上述中药组合物治疗糖尿病的方法。
本发明的另一目的还在于提供使用上述中药组合物治疗癌症的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现。
本发明提供了一种中药组合物，其可以调节人体免疫力，该中药组合物由黄芪、侧耳、鬼箭羽和桑叶制成，特别地，所用原料的重量配比为黄芪5-60份、侧耳10-100份、鬼箭羽10-100份和桑叶3-40份，优选为，黄芪10-30份、侧耳20-50份、鬼箭羽20-50份和桑叶5-20份，更优选为，黄芪15-25份、侧耳30-40份、鬼箭羽30-40份和桑叶10-15份，最优选为，黄芪20份、侧耳35份、鬼箭羽35份和桑叶12份。
上述所用原料，黄芪、侧耳、鬼箭羽和桑叶都可以从市场购得。
黄芪(拉丁名称Astragalus membranaceus)，是多年生草本植物，又名蒙古黄耆，可以从医药商店或市场购得。
侧耳是拉丁文名称为Pleurotus ostreatus的菌类的药物名称(参见上海科学技术文献出版社2000年1月1日出版的《蕈菌医方集成》第422-425页，陈士瑜、陈海英主编)，其有很多异名，例如鲍鱼侧耳、台湾平菇、鲍鱼菇、平菇等，全国范围内俗称平菇，在国内各地均有分布，目前主要人工栽培。
鬼箭羽，拉丁文名称Euonymus alatus。
桑叶，拉丁文名称Folium Mori。
上述所用原料黄芪、侧耳、鬼箭羽和桑叶药材，其重量配比都是以干燥药材计算的，当然可根据药材干燥过程中的失水比例来计算出新鲜药材重量配比。
上述中药组合物可以制成口服剂型，例如颗粒剂、片剂、胶囊、散剂、口服液、粉剂和丸剂等，优选颗粒剂和口服液。
本发明还提供了上述中药组合物的制备方法，该方法包括将黄芪、侧耳、鬼箭羽和桑叶用水或醇提取，得到提取液，其中可以将黄芪、侧耳、鬼箭羽和桑叶一起提取，也可以将黄芪、鬼箭羽和桑叶一起提取而将侧耳单独提取，然后混合；将提取液离心过滤，将离心液按本领域常规方法和赋形剂(如果需要的话)制成各种口服剂型，例如将离心液浓缩、喷物干燥制散剂，或者将离心液浓缩制成稠膏，干燥，粉碎成细粉，加入适量赋形剂制颗粒剂，或者将离心液浓缩后喷雾干燥制粒，得颗粒剂。
本发明中药组合物的有效剂量至少为8g生药/日/人(60kg)，在此剂量范围内，本发明中药组合物可以起到一定的调节免疫功能和治疗由于免疫功能失调而引发的疾病的效果，一般在20-100g生药/日/人(60kg)内，药物可以发挥很好的治疗效果，当剂量高于100g生药/日/人(60kg)，药物的治疗效果没有显著提高，而根据下文描述的药理毒性试验可知该剂量对患者不会产生毒副作用。当以小剂量，如低于8g生药/日/人(60kg)，长期服用时，本发明中药组合物可以起到保健作用。
本发明提供的中药组合物可以调节人体免疫功能，可以治疗和预防由于免疫失调而引起的各种疾病，例如用于治疗糖尿病和癌症等由于免疫功能失调引起的疾病以及用于治疗艾滋病，而且疗效良好，并且该中药组合物经长期实验没有发现毒副作用。
本发明提供了调节人体免疫功能的方法，该方法包括向被治疗者提供有效量的本发明中药组合物。
本发明提供了治疗由于免疫功能失调引发的疾病的方法，该方法包括向被治疗者提供有效量的本发明中药组合物。
本发明提供了治疗艾滋病的方法，该方法包括给予病人(患者或病毒携带者)有效量的本发明中药组合物，其目的在于一定程度上抑制HIV病毒，提高CD4细胞数量(即维持或提高免疫功能)，改善病人的症状，提高生活质量并延长生存时间，为了达到上述目的，所用剂量最好不低于20g生药/日/人(60kg)。
本发明提供了治疗糖尿病的方法，该方法包括给予糖尿病患者有效量的本发明中药组合物，目的在于降低患者的血糖、胆固醇、血脂、血压，通过调节患者的免疫功能，改善患者的血液循环和血液微循环状况以及内分泌等，缓解、改善和消除各种症状和并发症，从而在根本上治疗糖尿病。为了达到上述目的，所用剂量最好不低于20g生药/日/人(60kg)。
本发明还提供了治疗癌症的方法，该方法包括给予癌症患者有效量的本发明中药组合物，其目的在于调节癌症患者的免疫功能来治疗癌症。为了达到上述目的，所用剂量最好不低于20g生药/日/人(60kg)。


图1表示试验例2中实施例1颗粒剂对C8166细胞的毒性作用；图2表示试验例2中AZT对C8166细胞的毒性作用；图3表示试验例2中实施例1颗粒剂对HIV-1诱导的C8166细胞合胞体形成的抑制作用；图4表示试验例2中AZT对HIV-1诱导的C8166细胞合胞体形成的抑制作用；图5表示试验例2中不同浓度的实施例1颗粒剂对融合的抑制作用；图6表示试验例2中不同浓度的Dextran Sulfate对融合的抑制作用；图7表示试验例2中实施例1颗粒剂对HIV-1感染的C8166细胞保护作用；图8表示试验例2中AZT对HIV-1感染的C8166细胞的保护作用；图9表示试验例4中1A和II A对HeLa细胞周期的影响；图10表示试验例4中1A和II A对SK细胞周期的影响；图11表示试验例4中1A和II A对SY5Y细胞周期的影响；图12表示试验例4中1A和II A对A549细胞周期的影响。
具体实施例方式
以下实施例是为了说明本发明的各种实施方式，而不是以任何一种形式来限定本发明。
实施例1本发明中药组合物颗粒剂的制备分别称取黄芪200g、侧耳350g、鬼箭羽350g和桑叶120g，将它们每次用10L水煎煮，煎煮3次，每次煎煮2小时，合并煎煮液，过滤，将滤液浓缩至其相对密度为1.03-1.04(60℃)，静止过夜，滤液过200目筛，将所得滤液离心分离，将离心液浓缩制成稠膏，干燥，粉碎成细粉，加入总量为250g的β-糊精和/或甘露醇，混匀，制粒。灌装为5g/袋的颗粒剂，共得90袋。
服用方法每次1-3袋。
实施例2本发明中药组合物散剂的制备分别称取黄芪150g、侧耳400g、鬼箭羽300g和桑叶150g，将它们每次用10L水煎煮3次，每次煎煮2小时，合并煎煮液，过滤，将滤液浓缩至其相对密度为1.04-1.60(60℃)后静止过夜，然后过200目筛，所得滤液离心分离，将离心液浓缩后进行喷雾干燥成粉，灌装为40袋5g/袋的散剂。
服用方法每次1-3袋。
实施例3本发明中药组合物片剂的制备分别称取黄芪300g、侧耳200g、鬼箭羽500g和桑叶50g，将它们每次用11L水煎煮3次，每次煎煮2小时，合并煎煮液，过滤，将滤液浓缩至其相对密度为1.03-1.04(60℃)后静止过夜，然后过200目筛，所得滤液离心分离，将离心液喷雾干燥成细小颗粒，加入75g糊精和100g 85％的乙醇溶液制成软材，过20目尼龙筛，60-65℃通风干燥，加入0.8％的硬脂酸镁，压片，每片重1g。
服用方法每次5-15片。
实施例4本发明中药组合物胶囊剂的制备分别称取黄芪600g、侧耳100g、鬼箭羽100g和桑叶400g，将黄芪、鬼箭羽和桑叶每次用11L水煎煮3次，每次煎煮2小时，合并煎煮液得混合煎煮液a，将侧耳用1L 75％乙醇在70℃提取三次，每次提取2小时，合并提取液得混合提取液b，将a和b混合后过滤，将滤液浓缩至其相对密度为1.04-1.60(60℃)后静止过夜，然后过200目筛，所得滤液离心分离，将离心液浓缩后进行喷雾干燥成粉，灌制成000号胶囊，每粒胶囊含药物粉末0.5g。
服用方法每次10-30粒。
实施例5本发明中药组合物口服液的制备分别称取黄芪50g、侧耳1000g、鬼箭羽100g和桑叶30g，将它们每次用12L 70％乙醇在70℃提取三次，每次提取1.5小时，合并提取液，过滤，将滤液回收乙醇并浓缩至其相对密度为1.03-1.04(60℃)，静止过夜，滤液过200目筛，将所得滤液离心分离，将离心液灌装10ml的口服液，于130℃高温灭菌。
服用方法每次1-3瓶。
试验例一、本发明中药组合物的急性毒性试验将实施例1的颗粒剂溶于水，配制成最大浓度3.57g生药/ml的溶液，此浓度为可顺利通过小鼠灌胃针头的最大浓度。
取二级ICR小鼠40只，体重19-23g，雌雄各半，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号京动许字(2000)第004号，总049号。实验前禁食12h。
将动物按体重随机分为2组，空白对照组和给药组，每组20只，雌雄各半。口服(ig)给药，给药容积为40ml/kg，对照组服用相同体积的水，首次给药6小时后再次给药一次，共计给药2次。给药后，观察动物的活动、体重、食量等一般状况的变化。
观察详细记录给药后动物出现的异常反应及死亡情况，连续观察7d，死亡动物做大体解剖。
给药后，小鼠无任何不良反应。连续观察7天，给药前后体重未见异常变化，其他一般状况也未见异常反应，未见动物死亡。给药前后体重变化见表1表1.小鼠口服药物前后体重变化(x±s，n＝20)

与对照组比较，均有P＞0.05根据预试，该药物测不出LD50，即其没有急毒性。
二、本发明中药组合物治疗艾滋病的试验将本发明中药组合物进行体外抗HIV-1活性检测和临床试验，结果如下(一)体外抗HIV-1活性检测试剂和溶液(1)试剂MTT(3，(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，即3，(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑盐)；SDS(Sodium Dodecyl Sulfate，即十二烷基硫酸钠)；DMF(N，N′-Dimethyl formanine，即N，N′-二甲基甲酰胺)。
(2)溶液
RPMI-1640完全培养基，含有10％新生小牛血清(Hyclone)，2m M L-谷氨酰胺，10Mm HEPES游离酸，50u M 2-巯基乙醇，100,000IU盘尼西林.100μg/ml硫酸链霉素。
药物实施例1的颗粒剂。将其溶于培养基中，过滤除菌，4℃保存，浓度为2.5mg/ml。
细胞和病毒C8166和HIV-1 IIIB/H9均由英国Medical Research Council，AIDS ReagentProject惠赠。按常规方法制备HIV-1 IIIB，滴定并计算出病毒的TCID50。病毒贮存液分装后，置-70℃保存。细胞和病毒均按常规方法冻存和复苏。
实施例1颗粒剂对C8166的细胞毒性检测3×105/ml C8166细胞悬液100ul与不同浓度的药物溶液混合，同时设置不含药物的对照孔和阳性药物AZT对照孔，37℃，5％CO2培养三天，MTT法检测细胞存活率。ELx800ELISA Reader测定OD值(595nm/630nm)。计算药物对细胞的TC50，即引起50％细胞死亡的药物浓度。
表1给出了实施例1颗粒剂的TC50，图1显示了不同浓度的药物对C8166的毒性作用，图2显示了不同浓度的AZT对C8166的毒性作用。
表1

实施例1颗粒剂对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体的抑制实验将6×105/ml C8166细胞50ul与100ul不同浓度的药物溶液混合，加入50μlHIV-1稀释上清，M.O.I.为0.0089，同时设置不含药物的对照孔和阳性药物AZT对照孔，37℃，5％CO2培养三天，倒置显微镜下(100×)计数合胞体(五个视野)。计算化合物的IC50，即药物抑制50％合胞体形成的浓度。计算药物的SI(SelectiveIndex)，即选择指数，其值等于TC50/IC50。
表2列出了实施例1颗粒剂抑制合胞体形成的IC50。图3显示了不同浓度的实施例1颗粒剂对合胞体形成的抑制作用，图4显示了不同浓度的AZT对合胞体形成的抑制作用。
表2

共培养实验将3×105/ml C8166细胞50ul与100ul不同浓度的药物溶液混合，加入50μlHIV-1慢性感染的H9细胞，同时设置不含药物的对照孔和阳性药物Dextran Sulfate(DS)对照孔，37℃，5％CO2培养4小时，倒置显微镜下(100×)计数合胞体(五个视野)。
表3列出了实施例1颗粒剂抑制融合的IC50。图5显示了不同浓度的实施例1颗粒剂对融合的抑制作用，图6显示了不同浓度的Dextran Sulfate对融合的抑制作用。
表3实施例1颗粒剂抑制融合的IC50

实施例1颗粒剂对HIV-1感染C8166细胞死亡的保护实验将6×105/ml C8166细胞50ul与100ul不同浓度的药物溶液混合，培养板的一半孔加入50μl培养基，另一半加入50μl HIV-1稀释上清，M.O.I.为0.0089，同时设置不含药物的对照孔和空白对照孔，设置阳性药物AZT对照培养板，37℃5％CO2培养五天，MTT法检测细胞存活率。ELx800ELISA Reader测定OD值(595nm/630nm)。用下列公式计算出药物对正常细胞的存活率和HIV-1感染细胞的保护率。
正常细胞存活率(％)＝实验孔OD值/阴性对照孔OD值×100％感染细胞保护率(％)＝(实验孔OD值-阳性对照孔OD值)/(阴性对照孔OD值-阳性对照孔OD值)×100％表4列出了实施例1颗粒剂对正常细胞的毒性作用的TC50和对感染细胞保护作用的EC50，图7显示了不同浓度的实施例1颗粒剂对感染细胞保护作用，图8显示了不同浓度的AZT对感染细胞保护作用。
表4

由以上实验内容可知，本发明实施例1的颗粒剂对C8166的细胞毒性较小，TC50大于1000μg/ml；对HIV-1诱导宿主细胞合胞体形成抑制的IC50为54.64μg/ml(平均值)，选择指数(SI值)大于18；保护试验得到的TC50大于1000μg/ml，IC50为0.71g/ml，选择指数大于1400；对HIV-1感染细胞与正常细胞之间的融合作用没有阻断作用，IC50大于200μg/ml。可见，本发明实施例1的颗粒剂具有一定的体外抗HIV-1活性。
(二)临床试验从2002年9月1日至2003年6月30日，使用本发明实施例1颗粒剂对以下10例患者进行10个月的治疗和临床观察，结果如下随机选择10例艾滋病患者，均按WHO艾滋病诊断标准确诊，即HIV抗体阳性，CD4细胞计数低于250个/mm3。其中男性6人、女性4人，年龄33-55岁，平均年龄42.4岁，病程1-4年，平均2.3年。所选患者均属输液感染。
材料与方法全部艾滋病患者均为门诊观察，观察前均填写统一的观察表格，由专人负责每周询访一次，并详细记录症状及用药后不良反应及毒副作用。
治疗前及治疗后均抽血进行HIV(COPY/ml)和CD4(mm3)的检测，血样送北京地坛医院艾滋病临床试脸研究中心化验。
服药方法实施例1的颗粒剂，每日三次，每次1-3袋，于饭前30分钟温开水送服。
每天由专职护士巡诊，并记录服药中不良反应及毒副作用患者的症状缓解情况和化验结果见表5-表8表5治疗后10个患者症平均状缓解情况
表6治疗期间患者HIV和CD4含量的变化 表710名患者治疗10个月后月常规化验结果 服药10个月，患者Hb、WBc均在正常范围内，即该药对骨髓造血系统未见明显破坏作用；WBc均在正常范围，说明目前患者体内炎症不明显。
表8治疗10个月后患者的胸片结果 所观察的10例AIDS患者中，治疗前临床症状包括发烧、咳嗽、胸闷、乏力、腹泻、皮疹、厌食、恶心、体重下降等。治疗4-6个月后.体温从38.9℃平均值降至36.2℃平均值，三例长期卧床者均恢复正常生活，所有患者能工作。治疗7个月后胸透视显示10人中有8人肺部有点片状阴影，有1人双肺有弥漫性斑片状阴影〔属PCP一卡氏肺囊虫肺炎)。10个月后，8人的肺部点片状阴影消失，1人的肺部弥漫性斑片状阴影明显吸收好转，胸片给予了客观证实。治疗10个月后血常规的检查化验证明白血球总数及分类均在正常范围，证明AIDS患者肺部感染得到控制，与临床咳嗽、胸闷恢复相符合。血色素亦在正常范围，证明该药对人体骨髓造血功能无损害。临床未观察到不良反应和毒副作用。
由上述内容可知，本发明实施例1的颗粒剂能使艾滋病患者的各种症状明显改善或消失、增强体质、改善生活质量等。可能与其增加外周血T淋巴细胞的数量、明显增加辅助性T淋巴细胞的数量、减少抑制性T淋巴细胞的数量、促进T淋巴细胞形成抗体、对淋巴细胞有明显的促进和改善作用、提高和增强患者的机体免疫有关，故临床上使T淋巴细胞CD4的数目增加，从而达到降低HIV病毒载量，对艾滋病的预防和治疗有较好的作用。
三、本发明中药组合物治疗糖尿病的临床试验按WHO 1985年诊断标准，确诊的糖尿病人104例，均为2型糖尿病，其中男性56例，女性48例，平均年龄49.1±9.4岁，病程10.47±2.53年，随机分为两组A组治疗组 使用本发明实施例1的颗粒剂B组对照组 使用“优降糖”(山东博山制药厂生产，产品批号990917)
试验方法疗程3个月；给药方法治疗组服用本发明实施例1颗粒剂，每日三次，每次1-3袋。于餐前30分钟口服。
对照组服用“优降糖”，每日三次，每次2.5mg(片)，于餐前30分钟口服。
两组的降血糖作用见下表9表9 使用本发明实施例1颗粒剂和“优降糖”治疗前后患者血糖平均值变化

可见，实施例1的颗粒剂具有良好的降血糖效果，对糖尿病有一定疗效。
四、本发明中药组合物体外抑制肿瘤生长作用试验材料1、IA(侧耳粉)、IIA(本发明实施例1颗粒剂)2、细胞系宫颈癌HeLa、神经母细胞瘤细胞系SK、肺癌A549和神经母细胞瘤细胞系SY5Y由首都医科大学细胞培养室提供。
3、培养液DMEM(高糖)，胎牛血清，NaHCO3，双抗，PBS，0.25％胰蛋白酶，MTT，PI，95％乙醇(-20℃)，DMSO。
4、25cm2培养瓶，96孔培养板，24孔板，10ml尖底离心管。
测定指标形态的变化相差，HE染色生长抑制变化
细胞周期的变化；克隆形成率。
实验方案1、MTT方法筛选两种药物对肿瘤细胞系生长抑制的有效浓度范围及作用时间，并进行统计学检验。
2、观察有效浓度对细胞形态的影响，相差显微镜观察及染色观察。
3、流式细胞分析药物对细胞周期的影响。
4、克隆形成率分析药物对处于非细胞增殖周期的干细胞的抑制作用。
试验方法(一)MTT法1.分别取100mg药物IA、IIA溶于10ml DMEM培养液，制成浓度为10mg/ml的溶液，分装1ml保存，使用时倍比稀释。
2.将对数生长期的细胞经0.25％胰酶消化，制备单细胞悬液，计数，稀释成8×104/ml的细胞浓度。
3.将上述细胞悬液接种于96孔培养板中，预培养24小时后，弃培养液分组加入不同浓度的药物。
4.分组

分组规则如下IA1-对照；2-5ng/ml；3-50ng/ml；4-500ng/ml；5-5ug/ml；6-50ug/mlIIA7-对照；8-5ng/ml；9-50ng/ml；10-500ng/ml；11-5ug/ml；12-50ug/ml
板1SY5YA-D HeLaE-H板2SK A-D A549E-H各板分别作用24小时、48小时、72小时4.在培养板中每孔加入24ul MTT液(5mg/1ml)，37℃，培养4小时后，每孔加入DMSO 200ul，混匀，在酶标仪上测496nm处吸光值。
5.用SPSS统计学软件统计各浓度之间的差异，找出最佳作用浓度与时间。
6.重复上述实验一次。
(二)IA和IIA对细胞形态、细胞周期、克隆形成率的影响1、将对数生长期的细胞经0.25％胰酶消化，制备单细胞悬液，计数，稀释成8×104ml的细胞浓度。
2、将上述细胞悬液分别接种于预先放置有玻璃片的24孔培养板及50ml培养瓶中，预培养24小时后，弃培养液分组加入最佳浓度药物IA、IIA，培养一定时间。
3、分组

4.细胞培养一定时间后，将12孔板中的细胞取出进行普通相差摄影与染色摄影。
5.细胞培养瓶中的细胞分别消化制备单细胞悬液，计数，将细胞稀释成2×104/ml，分别加入6孔板中，A1-3为SY5Y，B1-3为HeLa，C1-3为SK1，D1-3为A549，1-对照组，2-药物IA，3-药物IIA，37℃培养I-2周后，经染色计数克隆形成率。
6.步骤5的细胞悬液经95％乙醇固定12小时后PI染色，流式细胞分析细胞周期的变化。
结果对肿瘤细胞系生长作用的抑制IA对细胞增殖抑制的影响情况见下表10表10 IA对细胞增殖抑制的影响情况表(OD值x±SD，n＝4)

可知，(1)IA对HeLa细胞的增殖有抑制作用，4种药物浓度(50ng/ml，500ng/ml，5ug/ml，50ug/ml)与细胞连续作用24、48、72小时，对细胞增殖均有明显的抑制作用，但作用与药物的剂量无正相关，其中在药物浓度达到500ng/ml后，药物对细胞的作用呈现出促增殖效应。对HeLa细胞作用的最佳时间与剂量分别为24小时和5ug/ml。(2)IA对于SK细胞的增殖抑制作用较弱，药物浓度为5ug/ml连续作用24、48、72小时对细胞的抑制作用与对照组有显著差异。在药物浓度达到500ug/ml后，药物对细胞的作用呈现出促增殖效应。对SK细胞作用的最佳时间与剂量分别为24小时和为5ug/ml。(3))IA对于SY5Y细胞的增殖有抑制作用，4种药物浓度(50ng/ml，500ng/ml，5ug/ml，50ug/ml)与细胞连续作用24、48、72小时，对细胞增殖均有明显的抑制作用，但作用与药物的剂量无正相关，其中在药物浓度达到500ug/ml后，药物对细胞的作用呈现出促增殖效应。对SY5Y细胞作用的最佳时间与剂量分别为24小时和为5ug/ml。(4)I A对于A549细胞的增殖有抑制作用，4种药物浓度(50ng/ml，500ng/ml，5ug/ml，50ug/ml)与细胞连续作用24、48、72小时，对细胞增殖均有明显的抑制作用，但作用与药物的剂量无正相关，其中在药物浓度达到500ug/ml后，药物对细胞的作用呈现出促增殖效应。对SY5Y细胞作用的最佳时间与剂量分别为24小时和为5ug/ml。
IIA对细胞增殖抑制的影响情况见下表11表11 IIA对细胞增殖抑制的影响情况(OD值x±SD，n＝4)

可知，(1)IIA对HeLa细胞的增殖有抑制作用，3种药物浓度(500ng/ml，5ug/ml，50ug/ml)与细胞连续作用24、48、72小时，对细胞增殖均有明显的抑制作用，当药物浓度达到500ug/ml后，药物与细胞作用48、72小时后仍有一定的抑制作用。对HeLa细胞作用的最佳时间与剂量分别为72小时和500ug/ml。(2)IIA对SK细胞的增殖有抑制作用，4种药物浓度(50ng/ml，500ng/ml，5ug/ml，50ug/ml)与细胞连续作用24、48小时，对细胞增殖均有明显的抑制作用，当药物浓度达到500ug/ml后，药物对细胞的增殖无抑制作用。IIA在所检测的浓度范围内与SK细胞连续作用72小时对细胞的增殖无抑制作用。对SK细胞作用的最佳时间与剂量分别为24小时和500ng/ml。(3)IIA对SY5Y细胞的增殖有抑制作用，3种药物浓度(500ng/ml，5ug/ml，50ug/ml)与细胞连续作用24、48小时，对细胞增殖均有明显的抑制作用，当药物浓度达到500ug/ml后，药物对细胞的增殖无抑制作用。IIA在所检测的浓度范围内与SY5Y细胞连续作用72小时对细胞的增殖无抑制作用。对SY5Y细胞作用的最佳时间与剂量分别为24小时和5ug/ml。(4)IIA(50ng/ml，500ng/ml)与A549作用24小时，对细胞增殖均有明显的抑制作用。当IIA与A549作用48小时，5种浓度(50ng/ml，500ng/ml，5ug/ml，50ug/ml，500ug/ml)对细胞增殖均有明显的抑制作用。但当药物连续作用72小时后，仅低浓度(50ng/ml，500ng/ml)对细胞有增殖作用抑制。对A549细胞作用的最佳时间与剂量分别为48小时和500ng/ml。
对肿瘤细胞系细胞周期的影响将1A和IIA与四种细胞在下表12所示浓度下作用24小时，用流式分析仪分析细胞周期的变化。
表12 1A和IIA与四种细胞作用浓度 通过观察分析结果可知1A和IIA对HeLa细胞周期的影响1A和IIA促进处于G0/G1期的细胞进入S期，G0/G1期的细胞比例下降，使细胞阻滞在S期；在所述浓度下没有发生细胞凋亡。参见图9，其中C表示对照。
1A和IIA对SK细胞周期的影响1A和IIA促进处于G0/G1期的细胞进入G2/M期，G2/M期细胞比例增高，S期变化不明显；在所述浓度下没有细胞发生凋亡。参见图10，其中C表示对照。
1A和IIA对SY5Y细胞周期的影响1A和IIA促进处于G0/G1期的细胞进入G2/M期，G2/M期细胞比例增高，S期变化不明显；在所述浓度下没有细胞发生凋亡。参见图11，其中C表示对照。
1A和IIA对A549细胞周期的影响1A对A549细胞周期的影响不明显；IIA使A549细胞阻滞在G0/G1期，S期的细胞比例下降；在所述浓度下均没有发生细胞凋亡。参见图12，其中C表示对照。
对肿瘤细胞系克隆形成率的影响将1A和IIA与四种细胞在下表13所示浓度下作用24小时，分析药物对细胞克隆形成率的影响。
表13 1A和IIA与四种细胞作用的浓度
在上述浓度下，1A和IIA对四种肿瘤细胞克隆形成率的影响情况参见下表14表14在表13所列浓度下肿瘤细胞的克隆形成率 可见，1A和IIA对四种肿瘤细胞克隆形成率都有一定的抑制作用。
由本试验可知1A和IIA对HeLa、SK、A549和SY5Y细胞的增殖都有良好的抑制作用；对该四种肿瘤细胞系的克隆形成率都有一定抑制作用；对处于S期的HeLa和A549的细胞作用较明显，使S期的细胞比例下降，但是对处于S期的SK和SY5Y细胞作用不明显。由此可知，1A和IIA对肿瘤细胞生长具有一定的抑制作用。
以上所述仅是本发明的具体优选实施方式，并不能对本发明的保护范围构成任何限定性影响，本领域技术人员应该理解的是，根据本发明构思所做的等价修改或替换，均落入本发明的保护范围。
权利要求
1.一种中药组合物，其由黄芪、侧耳、鬼箭羽和桑叶制成，所用原料的重量配比为黄芪5-60份、侧耳10-100份、鬼箭羽10-100份和桑叶3-40份。
2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所用原料的重量配比为黄芪10-30份、侧耳20-50份、鬼箭羽20-50份和桑叶5-20份。
3.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所用原料的重量配比为黄芪15-25份、侧耳30-40份、鬼箭羽30-40份和桑叶10-15份。
4.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所用原料的重量配比为黄芪20份、侧耳35份、鬼箭羽35份和桑叶12份。
5.根据权利要求1-4任一项所述的中药组合物，其特征在于，该药物组合物为口服剂型。
6.制备权利要求1-4任一项所述中药组合物的方法，该方法包括将黄芪、侧耳、鬼箭羽和桑叶用水或醇提取，得到提取液，其中可以将黄芪、侧耳、鬼箭羽和桑叶一起提取，也可以将黄芪、鬼箭羽和桑叶一起提取而将侧耳单独提取，然后混合；将提取液离心过滤，将离心液按本领域常规方法制成各种口服剂型，如果需要的话，其中可使用赋形剂。
7.权利要求1-4任一项所述的中药组合物在制备调节免疫功能的药物中的应用。
8.权利要求1-4任一项所述的中药组合物在制备治疗由于免疫功能失调引发的疾病的药物中的应用。
9.权利要求1-4任一项所述的中药组合物在制备治疗艾滋病的药物中的应用。
10.权利要求1-4任一项所述的中药组合物在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
11.权利要求1-4任一项所述的中药组合物在制备治疗癌症的药物中的应用。
12.根据权利要求11的应用，其特征在于，所述癌症为宫颈癌、肺癌或神经母细胞瘤。
13.一种调节免疫功能的方法，该方法包括，向被治疗者提供药学有效量的权利要求1-4任一项所述的中药组合物。
14.一种治疗由免疫功能失调引发的疾病的方法，该方法包括，向患者提供药学有效量的权利要求1-4任一项所述的中药组合物
15.一种治疗艾滋病的方法，该方法包括，向患者提供药学有效量的权利要求1-4任一项所述的中药组合物。
16.一种治疗糖尿病的方法，该方法包括，向患者提供药学有效量的权利要求1-4任一项所述的中药组合物。
17.一种治疗癌症的方法，该方法包括，向患者提供药学有效量的权利要求1-4任一项所述的中药组合物。
全文摘要
本发明公开了一种由黄芪、侧耳、鬼箭羽和桑叶制成的中药组合物及其制备方法，该方法包括将黄芪、侧耳、鬼箭羽和桑叶用水或醇提取，得到提取液，其中可以将黄芪、侧耳、鬼箭羽和桑叶一起提取，也可以将黄芪、鬼箭羽和桑叶一起提取而将侧耳单独提取；将提取液离心过滤，将离心液按本领域常规方法制成各种口服剂型，如果需要的话，其中可使用赋形剂。该中药组合物具有调节机体免疫功能的作用，可以用于治疗由免疫功能失调引发的疾病。经试验证明，该中药组合物无毒副作用，对艾滋病、糖尿病和癌症具有良好的治疗效果。
文档编号A61P3/00GK101057888SQ20061007634
公开日2007年10月24日 申请日期2006年4月21日 优先权日2006年4月21日
发明者张和平 申请人:张和平