专利名称：Fk基因及其编码蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及FK基因，该基因编码的FK蛋白，以及所述基因和蛋白在医学中的应用。所述蛋白可与其他蛋白相互作用并参与泛素介导的蛋白降解过程，从而影响肿瘤的发生与发展。
背景技术：
某些蛋白在肿瘤的发生发展过程中起着重要的抑制或促进作用，研究该基因及其编码蛋白的功能和作用机制，可为肿瘤的治疗提供新的方法和视角。
发明内容
本发明发现了一种参与泛素介导的蛋白降解过程的FK蛋白，并克隆了编码该蛋白的FK基因，构建了含有该基因的表达载体和含有该表达载体的宿主细胞，并且发现该蛋白在肿瘤的发生发展中起重要作用，基于以上发现，完成了本发明。
FK又叫HGNC29249，Fbx42，KIAA1332。定位于染色体1p36.23-p36.11。全长3011bp，表达蛋白约为80kD。ORF2151bp。编码717个氨基酸。
同源序列分析Pan troglodytes LOC456474类似于FBXO42蛋白Homo sapiens AK055598.1与CELL POLARITY PROTEIN TEA1弱相似Pongo pygmaeus CR858005.1 cDNA DKFZp469K075Homo sapiens AB037753.1 KIAA1332蛋白的mRNAHomo sapiens BC047296.1与RIKEN cDNA 6720460I06基因相似根据生物信息学预测，这个蛋白质含有两个主要的结构域，第一个是从第46至第83个氨基酸的F-box结构域，第二个是从第231至第272个氨基酸的kelch重复序列结构域。
本发明将pcDNA 3.1(-)-FK表达质粒转染到MCF-7细胞中，使FK基因在该细胞中表达，提取细胞总蛋白，Western Blot鉴定了FK蛋白的存在。
MTT法检测FK蛋白对乳腺癌细胞增殖的影响，结果表明，FK蛋白对乳腺癌细胞的增殖起抑制作用。
因此，根据本发明，提供了1、在肿瘤发生发展中起重要作用的蛋白FK蛋白，尤其是重组蛋白，该蛋白具有序列表中序列2所示的氨基酸序列，或者通过所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失，取代或增加而得到的氨基酸序列。
2、本发明提供了编码上述蛋白的FK基因，它是具有序列1所示的碱基序列的DNA或者与所述DNA在严格条件下杂交的DNA。
3、含有上述基因或者编码上述蛋白的基因的表达载体。
4、本发明提供了由上述表达载体转化的宿主细胞。
5、生产本发明的重组蛋白的方法，培养上述转化的宿主细胞，使转化细胞产生本发明的重组蛋白。
6、针对如以上项1所述的蛋白的抗体，它是使用所述重组蛋白作为免疫原而产生的特异性抗体。它可以是单克隆或多克隆抗体。
7、以上项1所述的蛋白或以上项2所述的基因在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
8、含有以上项1所述的蛋白和药学可接受的载体的药物组合物。
9、本发明提供了一个引物对，用于进行PCR扩增，引物如下所示引物15’-TAT AGA ATT CGC CAC CAT GGA CTA CAA GGA CGA CGA TGA CAA GGG TAC CATGGC CAG CTC CTC AGA CAG-3’引物25’-GCG CAA GCT TTT ATC TCT TTG CTC GTA CAA AGT ACA AGG CG-3’
图1为FK蛋白在真核细胞MCF-7中的表达图(Western blot)。一抗为小鼠抗人Flag单克隆抗体，二抗为羊抗鼠辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗。1为阴性对照，2为细胞裂解液。MCF-7细胞用带Flag标签的pcDNA3.1(-)-FK转染。蛋白水平用抗Flag抗体检测。1、2道分别表示阴性对照和MCF-7的细胞裂解产物。
图2为染色体基因定位。此基因定位于染色体1p36.23-p36.11，cDNA全长为3011bp，其中标示为基因在1号染色体的位置。
具体实施例方式
本发明的一个方面是可抑制乳腺癌细胞增殖的FK蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白等，优选是重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明的蛋白可以是糖基化或可以是非糖基化。
本发明的另一个方面是编码上述蛋白的多核苷酸FK基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。多核苷酸序列片段包括其互补链可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链或双链的。DNA可以是编码链或非编码链。或上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。
本发明还涉及包括本发明的多核苷酸的载体，用本发明的载体制造的遗传工程宿主细胞和用重组技术生产的本发明的多肽产品及方法。本发明的多核苷酸序列可以包括在用于表达多肽的众多表达载体的任意一种中。适宜的载体例如包括细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒，腺相关病毒、逆转录病毒或其它载体。本发明中适用的表达载体可以是原核或真核表达载体，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。含有本发明的基因序列的载体可以用来转化或转导适当宿主细胞以使宿主表达此多肽。
宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳动物细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或者是原核细胞，例如大肠杆菌等细菌细胞。
利用常规的基因重组技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列用来表达或生产重组的具有抑制乳腺癌细胞增殖的基因编码的蛋白多肽。包含(1)用本发明的具有抑制乳腺癌细胞增殖的FK基因(或变异体)，或者含有该FK基因的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3)从培养物包括培养基或培养的细胞中分离、纯化蛋白质。从而可以大量生产本发明的多肽。
本发明的FK蛋白具有抑制乳腺癌细胞增殖的作用，其可用于乳腺癌的治疗。因此，本发明的一个目的是本发明的上述蛋白在制备治疗肿瘤，尤其乳腺癌中的用途。
本发明的蛋白可以单独或与合适的药用载体组合使用。这种组合物可以包含治疗有效量的蛋白或拮抗剂以及药学可接受的载体或赋型剂，这样的载体包括但不限于盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘醇，乙醇，或混合物，这些制剂应适合给药方式。
本发明的药物组合物可以以适当的方式给药，如通过局部、静脉内、腹腔内、肌内、皮下等途径给药。给药于患者的用量取决于许多因素，如给药方式，待治疗者的身体条件和诊断医生的判断。
通过使用本发明的蛋白或者免疫学上等效的多肽，可以获得其抗体，抗体用于所述蛋白的检测和纯化。其次可以利用本发明的蛋白或其部分氨基酸序列作为免疫原来产生抗体。另外通过将抗体接种给宿主动物并回收血清的常规方法产生多克隆抗体，还可以通过常规杂交瘤方法产生单克隆抗体。
对其进行生物信息学分析，发现其表达谱较广泛，并包含F-box和kelch重复序列结构域。
1、FK表达信息(1)高表达的组织BM-CD71+早幼红细胞、胸腺、颈上神经节、丘脑下核、丘脑、扁桃体、脑桥、小脑、额叶前部皮质、全脑、骨骼肌、心、前列腺、肾上腺、脑垂体、甲状腺、Burkitt氏淋巴瘤、721B淋巴瘤、睾丸、胎盘、肝脏、肾脏、肺、支气管上皮细胞。
(2)低表达的组织BM-CD105+内皮细胞、三叉神经节、嗅管、顶叶、胰岛、大肠直肠腺瘤、精子、胎肝。
因此，本发明的蛋白通过与其他蛋白相互作用参与众多重要生理病理过程。随着研究的深入，可将其用于肿瘤尤其是乳腺癌的诊断和治疗。
实施例实施例1用PCR方法从人乳腺癌cDNA文库克隆编码FK蛋白的基因。用乳腺癌cDNA文库为模板，在FK基因N端接上Flag标签，用下列引物进行PCR扩增引物15’-TAT AGA ATT CGC CAC CAT GGA CTA CAA GGA CGA CGA TGACAA GGG TAC CAT GGC CAG CTC CTC AGA CAG-3’引物25’-GCG CAA GCT TTT ATC TCT TTG CTC GTA CAA AGT ACA AGGCG-3’扩增反应的条件在50μL的反应体积中含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl(PH 8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，0.25U的pfu DNA聚合酶(Takara公司产品)。按下列条件反应26个周期94℃ 30sec；59℃ 30sec；72℃ 2min 30sec。扩增产物用QIAGEN公司的试剂盒纯化，用EcoRI及HindIII双酶切后，克隆到相同酶切的pcDNA3.1(-)真核表达载体中。DNA序列分析结果表明PCR产物与预期的DNA序列基本相符。
实施例2FK在真核细胞中的表达Western Blot是在蛋白质电泳和固相免疫测定的基础上发展起来的，其基本原理为抗原抗体反应。细胞蛋白提取物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到固相支持物上(本实验采用硝酸纤维素膜)与特异的一抗反应(本实验用小鼠抗人Flag单克隆抗体，Sigma)，再与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(本实验室保存兔抗鼠二抗)孵育，显色，可以得到特异蛋白分子的免疫印迹图。该方法具有从混杂抗原中检测出特定的抗原的特点，因此本实验用于检测带有Flag标签的FK基因转染MCF-7细胞后的表达情况。
1)瞬时转染实验于转染前一天将MCF-7细胞接种于10cm培养板中，接种密度为2×106个细胞/孔，每孔加入培养液10ml。24小时后，细胞长至覆盖培养孔底面积约85-90％时，可准备转染。在EP管中配制下述溶液溶液A24μg pcDNA3.1(-)-FK表达质粒，溶于1.5mL无血清无双抗DMEM培养液。溶液B将48μL脂质体溶液(lipo-fectamine 2000 reagent)加入到1.5mL无血清无双抗DMEM培养液中，室温静置5分钟。然后将溶液A、B混合，室温静置20分钟。用无血清和不含双抗的DMEM培养液洗涤细胞。将上述溶液A、B的混合液中加入12mL无血清无双抗的DMEM培养液，混匀后加至细胞表面。37℃，5％ CO2条件下孵育4-6小时后，再用正常含10％胎牛血清的DMEM培养液取代前述培养液，继续培养细胞至48小时。
2)细胞总蛋白的提取培养的细胞经0.25％胰酶消化使之分散，4℃低速离心去上清，将沉淀置于冰上30min，再用预冷的PBS洗2次，每106细胞加入裂解液100μL，使细胞充分裂解30min，再于4℃，20000×g离心15min，收集上清。
3)Bradford法测定细胞裂解液蛋白的浓度首先配制考马斯亮蓝染色液；将标准牛血清白蛋白(BSA)配制成1mg/ml的蛋白标准液，分别将10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg蛋白标准液和5μL待测蛋白质样品加入3mL考马斯亮蓝染液中，室温孵育10min，在595nm波长处测定吸收值。BSA标准样品测定标准曲线，在一定范围内OD595与蛋白浓度成正比。样品蛋白质的浓度经标准曲线拟合方程来计算。
4)电泳及免疫反应流程如下A、制胶(5％浓缩胶，10％分离胶)；B、50μg蛋白样品加入上样缓冲液，煮沸，上样；C、电泳，浓缩胶80V电压，分离胶120V电压；D、转膜，100V，1.5h；E、封闭，1h；F、一抗反应，4℃，过夜；G、TBST洗膜，三次，每次10min；H、二抗反应，1.5h；I、TBST洗膜，三次，每次10min；J、显色、曝光。
实施例3MTT法检测不同浓度的FK蛋白对乳腺癌细胞增殖的影响MTT(四甲基偶氮唑兰)可被细胞摄取，并被活细胞内线粒体脱氢酶还原成一种不溶于水的蓝紫色产物甲瓒，并沉淀于细胞中，而死细胞没有这种功能。甲瓒可溶于二甲基亚砜(DMSO)，溶液在570nm处有最大吸收。故该波段处吸收值越大代表存活细胞量越多。MTT法广泛应用于细胞毒性实验、细胞生长测定等。本实验利用MTT法观察FK蛋白对MCF-7生长的影响。具体操作方法如下将培养到对数生长期的MCF-7细胞接种于96孔板中，每孔接种细胞数为1×104个。次日按照浓度梯度加入FK蛋白(25、50、100ng)，每浓度作用6孔细胞，37℃，5％ CO2进行培养。分别培养1d、2d、3d、4d后，在每个细胞培养孔内加入50μlL1mg/mL的MTT溶液，同样培养条件下作用4小时后取出，小心吸出每孔内液体，每孔加入二甲基亚砜150μL，轻微振荡10分钟，使蓝紫色结晶充分溶解在二甲基亚砜中。用自动酶标仪测量96孔板中每孔在570nm处的吸光值。MTT实验表明FK蛋白对MCF-7细胞生长增殖起抑制作用，并且与剂量有关。
FK基因[1].ST25SEQUENCE LISTING<110>北京大学<120>FK基因及其编码蛋白和应用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2154<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)..(2151)<223>
<400>1atg gcc agc tcc tca gac agt gaa gat gac agt ttc atg gct gtg gac48Met Ala Ser Ser Ser Asp Ser Glu Asp Asp Ser Phe Met Ala Val Asp1 5 10 15cag gaa gaa act gtg ctg gaa ggg aca atg gat caa gat gag gag ccc96Glu Glu Glu Thr Val Leu Glu Gly Thr Met Asp Gln Asp Glu Glu Pro20 25 30cac cca gta ttg gag gct gag gag act aga cat aat agg tcc atg tcg 144His Pro Val Leu Glu Ala Glu Glu Thr Arg His Asn Arg Ser Met Ser35 40 45gag ctg cca gaa gag gtt ttg gag tat atc ctg tcc ttt ctc tca ccg 192Glu Leu Pro Glu Glu Val Leu Glu Tyr Ile Leu Ser Phe Leu Ser Pro50 55 60tat cag gaa cac aaa act gcg gcc ctt gtc tgc aaa cag tgg tat cga 240Tyr Gln Glu His Lys Thr Ala Ala Leu Val Cys Lys Gln Trp Tyr Arg65 70 75 80ctt atc aaa ggt gta gcc cat cag tgt tat cat ggt ttc atg aag gct 288Leu Ile Lys Gly Val Ala His Gln Cys Tyr His Gly Phe Met Lys Ala85 90 95gtc cag gaa gga aac att cag tgg gag agc cgt acc tat cct tat cct 336Val Gln Glu Gly Asn Ile Gln Trp Glu Ser Arg Thr Tyr Pro Tyr Pro100 105 110gga acc cca atc act cag cgc ttc tcg cac agt gca tgc tat tat gat 384Cly Thr Pro Ile Thr Gln Arg Phe Ser His Ser Ala Cys Tyr Tyr Asp115 120 125gct aat cag tct atg tat gtg ttt gga ggc tgt acc cag agc agc tgc 432Ala Asn Gln Ser Met Tyr Val Phe Gly Gly Cys Thr Gln Ser Ser Cys130 135 140aat gct gct ttc aat gac ctc tgg aga ctt gac cta aac agc aaa gag 480Asn Ala Ala Phe Asn Asp Leu Trp Arg Leu Asp Leu Asn Ser Lys Glu145 150 155 160tgg atc cga cct ttg gct tca ggg tcc tat cct tcc ccc aaa gct gga 528Trp Ile Arg Pro Leu Ala Ser Gly Ser Tyr Pro Ser Pro Lys Ala Gly165 170 175gca act ctg gtc gtg tac aag gac ttg cta gtg ctg ttt ggt ggc tgg 576Ala Thr Leu Val Val Tyr Lys Asp Leu Leu Val Leu Phe Gly Gly Trp180 185 190acg cgg cca agc cct tat ccc cta cac cag cca gag aga ttc ttt gat 624Thr Arg Pro Ser Pro Tyr Pro Leu His Gln Pro Glu Arg Phe Phe Asp195 200 205
FK基因[1].ST25gaa ata cac act tac tca ccc tct aaa aat tgg tgg aac tgc att gtg 672Glu Ile His Thr Tyr Ser Pro Ser Lys Asn Trp Trp Asn Cys Ile Val210 215 220aca acc cat ggg cca cct ccc atg gct ggc cac tcc tcc tgt gtg ata 720Thr Thr His Gly Pro Pro Pro Met Ala Gly His Ser Ser Cys Val Ile225 230 235 240gat gat aaa atg att gtc ttt ggt ggc tct tta gga tcc cgg caa atg 768Asp Asp Lys Met Ile Val Phe Gly Gly Ser Leu Gly Ser Arg Gln Met245 250 255agc aat gat gtc tgg gtc ctt gac ctt gag cag tgg gcg tgg tcc aag 816Ser Asn Asp Val Trp Val Leu Asp Leu Glu Gln Trp Ala Trp Ser Lys260 265 270ccg aac atc tct ggc ccc agt cct cat cct cga ggt ggc caa tct cag 864Pro Asn Ile Ser Gly Pro Ser Pro His Pro Arg Gly Gly Gln Ser Gln275 280 285att gtc ata gat gat gca act atc tta atc ctc gga ggg tgt ggc ggt 912Ile Val Ile Asp Asp Ala Thr Ile Leu Ile Leu Gly Gly Cys Gly Gly290 295 300ccc aat gct cta ttc aag gat gct tgg ttg ttg cac atg cat tct ggt 960Pro Asn Ala Leu Phe Lys Asp Ala Trp Leu Leu His Met His Ser Gly305 310 315 320cct tgg gcc tgg cag cca ctc aag gta gaa aat gaa gag cat ggg gcc 1008Pro Trp Ala Trp Gln Pro Leu Lys Val Glu Asn Glu Glu His Gly Ala325 330 335cca gaa ctg tgg tgc cat cca gct tgc cgg gtg gga cag tgt gtg gtg 1056Pro Glu Leu Trp Cys His Pro Ala Cys Arg Val Gly Gln Cys Val Val340 345 350gtc ttc agc cag gct cct agt ggg aga gcc cca ctc agc ccc agt ttg 1104Val Phe Ser Gln Ala Pro Ser Gly Arg Ala Pro Leu Ser Pro Ser Leu355 360 365aac tct cgc cca tca cct atc agt gcc act cct cca gct ctc gtt cct 1152Asn Ser Arg Pro Ser Pro Ile Ser Ala Thr Pro Pro Ala Leu Val Pro370 375 380gaa acc cga gag tac cgc tct cag tct cca gta aga agc atg gat gaa 1200Glu Thr Arg Glu Tyr Arg Ser Gln Ser Pro Val Arg Ser Met Asp Glu385 390 395 400gct cct tgt gtt aac ggc cgc tgg gga aca ctg aga ccc agg gct caa 1248Ala Pro Cys Val Asn Gly Arg Trp Gly Thr Leu Arg Pro Arg Ala Gln405 410 415agg cag act cct tca ggt tcc cgg gaa ggg agc ctt tcc cca gcc aga 1296Arg Gln Thr Pro Ser Gly Ser Arg Glu Gly Ser Leu Ser Pro Ala Arg420 425 430gga gac ggc tct cct atc ctc aat ggt ggg agt ttg tct cca gga acg 1344Gly Asp Gly Ser Pro Ile Leu Asn Gly Gly Ser Leu Ser Pro Gly Thr435 440 445gca gct gtg ggt ggc tct tct ttg gac agt cct gta cag gcc ata tct 1392Ala Ala Val Gly Gly Ser Ser Leu Asp Ser Pro Val Gln Ala Ile Ser450 455 460cca agt act cca tct gct gct gaa gga tac gac ctg aaa ata gga ctt 1440Pro Ser Thr Pro Ser Ala Ala Glu Gly Tyr Asp Leu Lys Ile Gly Leu465 470 475 480tct ttg gcc ccc cga cga gga tca cta cca gat cag aaa gat ctg aga 1488Ser Leu Ala Pro Arg Arg Gly Ser Leu Pro Asp Gln Lys Asp Leu Arg485 490 495tta gga tcc ata gat ctg aat tgg gat ctg aaa ccc gct tcc agt agt 1536Leu Gly Ser Ile Asp Leu Asn Trp Asp Leu Lys Pro Ala Ser Ser Ser500 505 510
FK基因[1].ST25aat ccc atg gat ggc atg gac aat agg aca gtt ggg gga agt atg aga 1584Asn Pro Met Asp Gly Met Asp Asn Arg Thr Val Gly Gly Ser Met Arg515 520 525cac cct cct gaa cag aca aat ggt gtg cat acc cca cct cac gtg gcc 1632His Pro Pro Glu Gln Thr Asn Gly Val His Thr Pro Pro His Val Ala530 535 540agt gcc ctt gca ggg gcc gtc tcc cca ggt gcc ctg cgt cgg agt ctg 1680Ser Ala Leu Ala Gly Ala Val Ser Pro Gly Ala Leu Arg Arg Ser Leu545 550 555 560gaa gcc atc aaa gcg atg tcc tcc aaa ggc ccc tcg gcc tct gca gca 1728Glu Ala Ile Lys Ala Met Ser Ser Lys Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala565 570 575cta agt cct cct ctt ggg tct tct cca ggc tct cct ggg agc cag agt 1776Leu Ser Pro Pro Leu Gly Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Ser Gln Ser580 585 590ttg agc agt gga gaa aca gtg ccc atc cct cgc cca ggg cct gcc caa 1824Leu Ser Ser Gly Glu Thr Val Pro Ile Pro Arg Pro Gly Pro Ala Gln595 600 605gga gat gga cat tcc tta cct ccc att gct cgc cgc ctg ggc cac cac 1872Gly Asp Gly His Ser Leu Pro Pro Ile Ala Arg Arg Leu Gly His His610 615 620cct cca cag tcc cta aat gtt ggc aaa ccc cta tac cag agt atg aac 1920Pro Pro Gln Ser Leu Asn Val Gly Lys Pro Leu Tyr Gln Ser Met Asn625 630 635 640tgc aag ccc atg cag atg tac gtg ctg gac att aaa gac acc aag gag 1968Cys Lys Pro Met Gln Met Tyr Val Leu Asp Ile Lys Asp Thr Lys Glu645 650 655aag ggg cgg gtc aaa tgg aaa gta ttt aat agc agt tct gtg gtt gga 2016Lys Gly Arg Val Lys Trp Lys Val Phe Asn Ser Ser Ser Val Val Gly660 665 670cct cct gaa acc agc ctg cat acc gtg gta caa ggc tgg ggt gaa ctc 2064Pro Pro Glu Thr Ser Leu His Thr Val Val Gln Gly Trp Gly Glu Leu675 680 685atc ata ttt gga gga ctc atg gac aag aaa cag aat gtg aag tac tat 2112Ile Ile Phe Gly Gly Leu Met Asp Lys Lys Gln Asn Val Lys Tyr Tyr690 695 700cca aaa aca aac gcc ttg tac ttt gta cga gca aag aga taa 2154Pro Lys Thr Asn Ala Leu Tyr Phe Val Arg Ala Lys Arg705 710 715<210>2<211>717<212>PRT<213>人<400>2Met Ala Ser Ser Ser Asp Ser Glu Asp Asp Ser Phe Met Ala Val Asp1 5 10 15Gln Glu Glu Thr Val Leu Glu Gly Thr Met Asp Gln Asp Glu Glu Pro20 25 30His Pro Val Leu Glu Ala Glu Glu Thr Arg His Asn Arg Ser Met Ser35 40 45Glu Leu Pro Glu Glu Val Leu Glu Tyr Ile Leu Ser Phe Leu Ser Pro50 55 60
FK基因[1].ST25Tyr Gln Glu His Lys Thr Ala Ala Leu Val Cys Lys Gln Trp Tyr Arg65 70 75 80Leu Ile Lys Gly Val Ala His Gln Cys Tyr His Gly Phe Met Lys Ala85 90 95Val Glu Glu Gly Asn Ile Gln Trp Glu Ser Arg Thr Tyr Pro Tyr Pro100 105 110Gly Thr Pro Ile Thr Gln Arg Phe Ser His Ser Ala Cys Tyr Tyr Asp115 120 125Ala Asn Glu Ser Met Tyr Val Phe Gly Gly Cys Thr Gln Ser Ser Cys130 135 140Asn Ala Ala Phe Asn Asp Leu Trp Arg Leu Asp Leu Asn Ser Lys Glu145 150 155 160Trp Ile Arg Pro Leu Ala Ser Gly Ser Tyr Pro Ser Pro Lys Ala Gly165 170 175Ala Thr Leu Val Val Tyr Lys Asp Leu Leu Val Leu Phe Gly Gly Trp180 185 190Thr Arg Pro Ser Pro Tyr Pro Leu His Gln Pro Glu Arg Phe Phe Asp195 200 205Glu Ile His Thr Tyr Ser Pro Ser Lys Asn Trp Trp Asn Cys Ile Val210 215 220Thr Thr His Gly Pro Pro Pro Met Ala Gly His Ser Ser Cys Val Ile225 230 235 240Asp Asp Lys Met Ile Val Phe Gly Gly Ser Leu Gly Ser Arg Gln Met245 250 255Ser Asn Asp Val Trp Val Leu Asp Leu Glu Gln Trp Ala Trp Ser Lys260 265 270Pro Asn Ile Ser Gly Pro Ser Pro His Pro Arg Gly Gly Gln Ser Gln275 280 285Ile Val Ile Asp Asp Ala Thr Ile Leu Ile Leu Gly Gly Cys Gly Gly290 295 300Pro Asn Ala Leu Phe Lys Asp Ala Trp Leu Leu His Met His Ser Gly305 310 315 320Pro Trp Ala Trp Gln Pro Leu Lys Val Glu Asn Glu Glu His Gly Ala325 330 335Pro Glu Leu Trp Cys His Pro Ala Cys Arg Val Gly Gln Cys Val Val340 345 350Val Phe Ser Gln Ala Pro Ser Gly Arg Ala Pro Leu Ser Pro Ser Leu
FK基因[1].ST25355 360 365Asn Ser Arg Pro Ser Pro Ile Ser Ala Thr Pro Pro Ala Leu Val Pro370 375 380Glu Thr Arg Glu Tyr Arg Ser Gln Ser Pro Val Arg Ser Met Asp Glu385 390 395 400Ala Pro Cys Val Asn Gly Arg Trp Gly Thr Leu Arg Pro Arg Ala Gln405 410 415Arg Gln Thr Pro Ser Gly Ser Arg Glu Gly Ser Leu Ser Pro Ala Arg420 425 430Gly Asp Gly Ser Pro Ile Leu Asn Gly Gly Ser Leu Ser Pro Gly Thr435 440 445Ala Ala Val Gly Gly Ser Ser Leu Asp Ser Pro Val Gln Ala Ile Ser450 455 460Pro Ser Thr Pro Ser Ala Ala Glu Gly Tyr Asp Leu Lys Ile Gly Leu465 470 475 480Ser Leu Ala Pro Arg Arg Gly Ser Leu Pro Asp Gln Lys Asp Leu Arg485 490 495Leu Gly Ser Ile Asp Leu Asn Trp Asp Leu Lys Pro Ala Ser Ser Ser500 505 510Asn Pro Met Asp Gly Met Asp Asn Arg Thr Val Gly Gly Ser Met Arg515 520 525His Pro Pro Glu Gln Thr Asn Gly Val His Thr Pro Pro His Val Ala530 535 540Ser Ala Leu Ala Gly Ala Val Ser Pro Gly Ala Leu Arg Arg Ser Leu545 550 555 560Glu Ala Ile Lys Ala Met Ser Ser Lys Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala565 570 575Leu Ser Pro Pro Leu Gly Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Ser Gln Ser580 585 590Leu Ser Ser Gly Glu Thr Val Pro Ile Pro Arg Pro Gly Pro Ala Gln595 600 605Gly Asp Gly His Ser Leu Pro Pro Ile Ala Arg Arg Leu Gly His His610 615 620Pro Pro Gln Ser Leu Asn Val Gly Lys Pro Leu Tyr Gln Ser Met Asn625 630 635 640Cys Lys Pro Met Gln Met Tyr Val Leu Asp Ile Lys Asp Thr Lys Glu645 650 655
FK基因[1].ST25Lys Gly Arg Val Lys Trp Lys Val Phe Asn Ser Ser Ser Val Val Gly660 665 670Pro Pro Glu Thr Ser Leu His Thr Val Val Gln Gly Trp Gly Glu Leu675 680 685Ile Ile Phe Gly Gly Leu Met Asp Lys Lys Gln Asn Val Lys Tyr Tyr690 695 700Pro Lys Thr Asn Ala Leu Tyr Phe Val Arg Ala Lys Arg705 710 71权利要求
1.可抑制肿瘤细胞的生长和增殖的蛋白，该蛋白具有序列表中序列2所示的氨基酸序列，或者通过所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失，取代或增加而得到的氨基酸序列。
2.编码上述蛋白的基因，它是具有序列1所示的碱基序列的DNA或者其互补序列或与所述DNA在严格条件下杂交的DNA。
3.含有权利要求2所述基因或者编码权利要求1所述蛋白的基因的表达载体。
4.由权利要求3所述的表达载体转化的宿主细胞。
5.生产本发明的重组蛋白的方法，该方法包括培养权利要求4所述的转化的宿主细胞，使转化细胞产生本发明的重组蛋白。
6.针对如权利要求1所述的蛋白的抗体，它是使用所述重组蛋白作为免疫原而产生的特异性抗体。
7.权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的基因在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
8.含有如权利要求1所述的蛋白和药学可接受的载体的药物组合物。
9.一种用于对进行权利要求2所述基因的PCR扩增的引物对，引物如下所示引物15’-TAT AGA ATT CGC CAC CAT GGA CTA CAA GGA CGA CGA TGACAA GGG TAC CAT GGC CAG CTC CTC AGA CAG-3’引物25’-GCG CAA GCT TTT ATC TCT TTG CTC GTA CAA AGT ACA AGGCG-3’。
全文摘要
本发明涉及FK基因，该基因编码的FK蛋白，以及所述基因和蛋白在医学中的应用，所述蛋白可与其他蛋白相互作用并参与泛素介导的蛋白降解过程，从而影响肿瘤的发生与发展。
文档编号A61P35/00GK101058604SQ20061007627
公开日2007年10月24日 申请日期2006年4月21日 优先权日2006年4月21日
发明者尚永丰, 孙露洋, 吴歌 申请人:北京大学