专利名称：一种短棒状杆菌制剂或无细胞短棒状杆菌制剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种短棒状杆菌制剂或者无细胞短棒状杆菌制剂(NCPP)在制备抗纤维化药物方面的用途，特别是在制备抗肝纤维化、肺纤维化、心肌纤维化、血管纤维化、肿瘤组织纤维化、肿瘤的放疗、化疗产生的纤维化病变、肾纤维化、骨髓纤维化或者老年性痴呆等药物方面的用途，所述的NCPP是由短棒状杆菌(CP)经破碎制备的无细胞纳米级制剂，属于生物制品领域。
背景技术：
肝纤维化(Hepatic fibrosis，HF)是多种致病因素引起的慢性肝病的共同病理基础，是进一步向肝硬化发展的主要中间环节。据世界卫生组织统计，我国为乙型肝炎病毒感染的高流行地区，已有六亿人感染过乙肝病毒，约1.2亿人携带乙肝病毒，其中约1/4的病人最终发展为慢性肝病，包括慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌。因此，在“肝炎-肝纤维化-肝硬化”疾病进展过程中，肝纤维化的防治是治疗肝病的关键。
特发性肺纤维化(IPF)为原因不明的进行性纤维化的肺泡壁慢性炎症，寻常性间质性肺炎(UIP)，也称肺纤维化(IPE)、纤维性肺泡炎(CFA)作为一个间质性肺炎特殊组织病理类型，是在IPF肺活检中发现的典型类型.在低倍镜下，组织表现异质性，在正常肺组织中夹杂病变区域，间质炎症，纤维化和蜂窝样改变，这些改变在胸膜下外周肺实质最为严重。
特发性肺纤维化是一种至今还没有查明病因的慢性肺间质性疾病。起病隐袭、进行性加重、最终导致肺、心功能衰竭。本病成为不可预防、不易早期发现、不好治疗、进行性损害的″绝症″。目前尚无有效的治疗药物。急性肺纤维化后，纤维组织代替正常的组织，肺泡结构变形失去呼吸功能，最终导致呼吸衰竭，不得不依赖呼吸机、甚至死亡。
心肌纤维化是由于心肌长期供血不足，或高血压、病毒性心肌炎等因素损伤心肌，导致部分心肌死亡，刺激机体产生免疫反应，损伤修复过度以致纤维组织增生，代替了正常的心肌组织，心室肥厚，形成心肌纤维化。纤维化形成后，心脏收缩舒张功能障碍，泵血能力降低；纤维瘢痕形成，心肌电传导障碍，引起心律失常，甚至猝死；心脏顺应性降低，心室内压力增高，严重时可引起心脏破裂；纤维化最终可发展成心力衰竭，组织器官缺血缺氧，全身器官功能衰竭，最终死亡。心肌纤维化是一个复杂的病理过程，涉及神经系统、免疫系统和内分泌系统，其中免疫系统起重要的作用。
血管纤维化，是由于感染、高血脂、高血糖等慢性损伤因素导致血管壁发生炎症损伤，激活免疫系统，在损伤--修复的反复过程中，促纤维化因子生成增多，促进血管壁发生组织纤维化，从而导致管壁变厚、管腔狭窄，在其他因素的参与下进一步形成动脉粥样硬化。血管纤维化以后，管壁增厚，管腔变细，血流也难以通畅。既然血管遍布全身，血管纤维化的危害也是极大的。累及心脏冠状动脉，造成心脏供血不足，继而诱发心肌纤维化等心脏病；累及脑动脉，造成脑供血不足、缺血，诱发中风、猝死；累及下肢动脉(脉管炎)，造成下肢局部缺血、营养障碍、甚至坏死，如不及时治疗只有选择截肢。
肿瘤也和组织纤维化有关系，而且这种关系在肿瘤的发生、转移以及放疗、化疗中均存在。组织纤维化可促进肿瘤的产生，长期持续的纤维化反应导致大量炎症细胞浸润，组织破坏和修复过程同时进行，产生大量促纤维化因子，刺激上皮增殖，产生活性氧等损伤DNA，损伤不断积累最终导致细胞癌变，产生肿瘤。流行病学资料表明，多种纤维化反应可显著增加肿瘤转移的危险。纤维化反应促进肿瘤的生长、侵袭和转移。
肿瘤的放疗、化疗亦会产生明显的纤维化病变。高剂量的放疗可导致支气管狭窄、支气管软化和纵膈纤维变性以及肺纤维化等，表现为肺收缩、胸膜增厚、气管或纵膈偏向照射区。胸部放疗和化疗同时使用时，常导致急性食管炎综合征，产生轻度到重度的纤维化，导致食管永久性狭窄。这些纤维化样病变，一旦形成即难以逆转，严重时明显地影响病人的生存质量。
肾纤维化是肾脏在对抗慢性损伤(肾炎、高血压等)修复受损组织的过程中，细胞外基质成分在肾脏中过度增生与沉积，纤维组织代替正常肾组织，导致慢性肾功能不全，最终发展为肾功能衰竭。除了变态反应引起的炎症和细菌感染对肾脏造成损伤引起肾纤维化以外，临床比较常见的还有高血压肾病、糖尿病肾病、泌尿道阻塞性肾病可引起肾纤维化。
骨髓纤维化与肝硬化病机理相似，只是纤维组织增生的部位不同，有时两者同时存在。骨髓纤维化为一种骨髓增殖性疾病，其骨髓造血组织逐渐为纤维组织所代替而严重地影响了造血功能，导致造血功能衰竭。原发性骨髓纤维化病因未明，继发性骨髓纤维化可由化学(化疗)、物理因素(放疗)、药物(激素)、损伤及感染影响，肿瘤、白血病细胞浸润等引起。骨髓纤维化多数是慢性的，一般病程平均5～7年，部分可转变为急性白血病。少数表现为急性骨髓纤维化。
老年性痴呆包括血管性痴呆和阿尔兹海默症是一种由于脑纤维化、脑萎缩引起的神经退行性疾病。逆转血管纤维化可有效治疗血管性痴呆。防止大脑皮层和海马的蛋白质纤维化有可能治疗阿尔兹海默症。
短棒状杆菌菌苗(CPV，1995版《中国生物制品规程》)或称短棒状杆菌制剂(CPP，2000版《中国生物制品规程》)是一种非特异性免疫调节剂。它是由短棒状杆菌(CP)经甲醛灭活后制成的死菌苗，其制备过程公开在1995版及2000版《中国生物制品规程》。目前应用的CPP制剂还有法国Merleux研究所生产的灭活菌苗；英国Wellcome药厂生产的灭活菌苗等。
为了降低CPP的副作用、提高药效，中国专利申请CN02123571.6、CN02123572.4、CN02123570.8公开了一种无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)、其制备方法及其在制备治疗结核病药物上的用途。是由短棒状杆菌(CP)制备的无细胞制剂，热原小于160EU/ml，蛋白质含量10-40％(g/g)，核酸含量3-25％(g/g)，其余为多糖，粒度小于100nm。该NCP是将CP破碎至纳米级，经离心去除无效的上清部分，收集沉淀部分制备的，热原低、无杂菌污染、无残留甲醛，颗粒具有纳米级，粒度均一，吸收度和扩散度提高，有利于人体吸收并提高药效；同时减少发烧、胸痛，注射局部红肿、硬结等副作用，是一种有前途的免疫调节剂。
CN02123570.8进一步公开了一种短棒状杆菌制剂(CPP)或无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)在制备治疗HIV感染或爱滋病药剂中的应用。
CPP作为免疫调节剂，免疫系统的作用主要表现在激活单核巨噬细胞、使NK细胞活性增强、促进机体对多种抗原产生IgG和IgM、诱生干扰素、白细胞介素-2等，因此具有抗肿瘤和抗感染作用。其抗肿瘤作用已为许多实验和临床研究所证实。对实验动物接种肿瘤前后应用CPP，能显着抑制某些实体瘤(如乳腺癌、黑色素瘤等)、腹水型肿瘤及白血病的生长。肿瘤消退的动物对于再次攻击的肿瘤细胞有特异性的抵抗力。CPP对肿瘤转移亦有抑制作用。
基于上述原理及临床实践，开发CPP及NCP的新的用途是非常有意义的。
发明内容
本发明的目的是提供一种短棒状杆菌制剂(CPP)或无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)在制备治疗抗肝纤维化药物方面的用途。
其中所述的抗肝纤维化包括肝纤维化、肺纤维化、心肌纤维化、血管纤维化、肿瘤组织纤维化、肿瘤的放疗、化疗产生的纤维化病变、肾纤维化、骨髓纤维化以及老年性痴呆等。
其中所述的短棒状杆菌制剂是一种非特异性免疫调节剂。见2000版《中国生物制品规程》它是由短棒状杆菌(CP)经甲醛灭活后制成的死菌苗。
其中的无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)及其制备方法见CN02123570.8、CN02123571.6、CN02123572.4和CN02123570.8。
具体地说，本发明的NCPP是由短棒状杆菌(CP)经破碎制备的无细胞纳米级制剂，具有低热原、粒度均一、无甲醛残留的特点。
NCPP由于具有纳米级，吸收度、扩散度明显提高，与全菌体制剂具有相同的脾激活及抑瘤等生物学活性，并可降低发烧、胸痛、注射局部红肿、硬结等副作用。
本发明NCPP是由CP经破碎制备的无细胞纳米级制剂，其粒度小于100nm。
其中所述的CP，学名为粉刺丙酸杆菌(propionibacterium acnes)菌号为65101(76-27或7627)、65102(H-84)或65103(77-1或771)。
本发明所述的NCPP的热原小于160EU/ml，蛋白质含量10-40％(g/g)，核酸含量3-25％(g/g)，其余为多糖。
优选本发明NCPP的热原小于60EU/ml，蛋白质含量20-30％(g/g)，核酸含量3-10％(g/g)，其余为多糖。
本发明NCPP的粒度优选为10-50nm。
本发明所述的NCPP是通过下述步骤制备的1)CP工作种子批菌种连续2-4次传代后接种于大瓶或营养罐，在培养基中培养5-7天；2)收集无杂菌污染的菌体，加热煮沸15-60分钟得到菌液；3)无菌试验合格的菌液经洗涤后，用破碎装置破碎菌体；4)菌体破碎后的悬液经离心后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液；5)将悬液加热灭菌，得到NCPP。
其中步骤1)中所述的CP学名为粉刺丙酸杆菌，菌号为65101(76-27或7627)、65102(H-84)或65103(77-1或771)。
培养基为选自硫乙醇酸盐、蛋白胨、肝或酵母透析液培养基中的一种，且为低热原培养基。
步骤1)中培养条件为36-37℃培养。
优选所述培养基为不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基。
其中步骤3)中所述的菌体是灭活菌，菌体浓度为50-500亿/ml。
所述破碎装置是将菌体破碎到小于100nm，优选粒度为10-50nm的超高压射流对撞机。
其中所述菌体破碎是在无菌条件下进行。
其中步骤3)中所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤至少2次；步骤4)中所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤1-5次。
步骤4)菌体破碎后悬液的离心条件是在4℃-室温，6000-12000rpm离心30-150分钟。
步骤5)中所述的加热为在60-65℃加热0.5-2小时。
本发明的制备方法中，进一步包括将步骤5)得到的NCP分装后，安瓿在60±2℃加热30分钟。
本发明中所述培养基优选为经过0.22μm或μm0.45μm膜过滤的低热原培养基。
本发明所述的制备方法中，还包括将步骤5)得到的NCP冷冻干燥，得到NCPP的冻干制剂。
上述方法制备的NCPP热原小于160EU/ml，蛋白质含量10-40％(g/g)，核酸含量3-25％(g/g)，其余为多糖。
优选上述方法制备的NCPP热原小于60EU/ml，蛋白质含量20-30％(g/g)，核酸含量3-10％(g/g)，其余为多糖。
上述方法制备的NCPP粒度小于100nm，优选粒度为10-50nm。
本发明中所述的无菌检验合格是指按照《中国生物制品规程》规定的方法检验不得有任何细菌生长。
本发明中由于采用低热原培养基，特别是硫乙醇酸盐培养基，并结合严格的质控，以及整个生产过程中无菌低热原操作，保证了最终产品低热原和无杂菌的污染。
本发明通过超高压射流对撞机将CP破碎至纳米级，通过选择不同的离心力(转速)，确定了离心提取条件，获得的沉淀部分为NCP，经多次动物试验证明，该制剂与全菌体具有相同的脾激活及抑瘤等生物学活性，上清部分则无脾激活及抑瘤作用，表明本发明的NCPP具有良好的生物学活性。
为了消除CPP中残留甲醛对机体的刺激性，尤其是对敏感胸膜的刺激性，本发明中采用加热灭活替代了甲醛灭活。动物实验表明，加热灭活的NCPP、CPP较甲醛灭活的CPP具有相同的脾激活及抑瘤等生物学活性。
超高压射流对撞机的工作原理是将混有被加工物的液体用高压泵(工作压力为10-3000kgf/cm2)加压后分成两股，以高速射流进入两片直径为8MM人造金刚石芯片组成的信道中，相向对撞后流出。由于液体的速度很高，流体相向对撞时产生很强的冲击波，使金刚石芯片产生高频、高强超声波。大功率高频超声波使被加工物颗粒瞬间粉碎、超微化。
本发明的制备过程中，为更好地破碎菌体，采用超高压射流对撞机，在菌体浓度为50-500亿/ml，工作压力为800-1500kgf/cm2的条件下破碎，破碎后的菌体悬液在4℃-室温下，6000-12000rpm离心30-150分钟，弃上清，沉淀用无菌生理盐水溶液洗涤0-5次后制成悬液，在60-65℃加温0.5-2小时，无菌试验合格后合并，经配制、分装，分装后安瓿在60±2℃加热15-60分钟，得到高质量、粒度和均一性良好的目的产品。
本发明的NCP是将CP的细胞破碎至纳米级，经离心去除无效的上清部分，收集沉淀部分制备的，产品具有低热原、无杂菌污染、无甲醛残留，颗粒具有纳米级，粒度均一，吸收度和扩散度提高，有利于人体吸收并提高药效；同时可减少发烧、胸痛，注射局部红肿、硬结等副作用，是一种有前途的免疫制剂。
根据需要，本发明的NCP可以制成无菌生理盐水的悬浮制剂，固体含量为1.0mg/ml或2.0mg/ml，也可以制成冻干粉针或适合药用的其它剂型。
本发明的NCPP为免疫调节剂，可以用于癌性胸水、结合手术治疗早、中期肺癌，乳腺癌、鼻咽癌、晚期肺癌、黑色素瘤以及癌症体表转移灶的治疗，亦可用于牛皮癣、再生障碍性贫血、女阴白斑、感染性哮喘、结核病的治疗或辅助治疗，特别是在肌体的纤维化治疗方面，例如抗肝纤维化、抗肺纤维化方面，有着很好的应用；尤其是在抗肝纤维化方面，作用显着。
下面结合附图和具体实施例详细描述本发明，所述的实施例用于描述本发明而不是限制本发明。
图1是现有技术的CPP的电镜照片。
图2是本发明的NCP的电镜照片。
具体实施例方式
下面是本发明的具体实施例，其中CP学名为粉刺丙酸杆菌(propionibacterium acnes)，菌号为65101(76-27)、65102(H-84)公开于1993版《中国医学细菌菌种目录》，北京理工大学出版社(ISBN7-81013-859-6/R.7)，65103(77-1或771)公开于2000版《中国生物制品规程》，化学工业出版社。
实施例1
参照2000版《中国生物制品规程》中描述的方法进行细菌种子批的建立、检定以及其它检定。
本实施例中采用的培养基为北京三药科技开发公司出品的硫乙醇酸盐培养基(不含琼脂)，成分为胰酪胨15g/l，酵母浸粉5g/l，葡萄糖5g/l，氯化钠2.5g/l，L-胱氨酸0.5g/l，硫乙醇酸钠0.5g/l。使用前将培养基用0.22μm膜过滤。
启开CP(学名粉刺丙酸杆菌，propionibacterium acnes)771(见《中国生物制品规程》)菌种管，每管含菌60亿，用毛细管吸取约0.2-0.3ml硫乙醇酸盐培养基(不含琼脂)，加在菌种管底部使之完全溶解后吸出，加入中管(容量38ml)中，用上述培养基8-10ml混合，置37℃培养2天。取菌液用上述培养基(菌液∶培养基体积比＝1∶9)混合，置37℃培养2天。取上述培养的菌液用上述培养基(按1∶9)混合，置37℃培养3天，收获菌液。逐瓶镜检，有杂菌污染者弃之。合并收集无杂菌污染的菌体加热煮沸15分钟，用超高压射流对撞击(日本Nanonizer Inc.产品，型号NMG-75-200)在1000kgf/cm2压力下破碎菌体3次；破碎后的悬液在室温、6000rpm离心90分钟，收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤沉淀3次，无菌检验(2000版《中国生物制品规程》)及热原检测(2000版《中国人民共和国药典》)合格后制成固体含量为0.5mg/ml的悬液，60℃加热1小时，得到NCP。
其中CP，学名为粉刺丙酸杆菌65103(77-1)或771。
经鲎试剂法(2000版《中华人民共和国药典》)检测(固体含量1mg/ml)，本发明的NCP热原20EU/ml；考马斯亮兰法(《生物化学实验原理和方法》，北京大学出版社)测定蛋白质含量25％(g/g)；紫外法(2000版《中国生物制品规程》)260nm测定核酸含量10％(g/g)；蒽酮法(2000版《中国生物制品规程》)测定多糖含量为10％(g/g)。考虑到蛋白质和核酸的测定结果比较准确，估计其余的多糖未测出。电镜测定粒度为60-100nm。
分装后，安瓿在60±2℃加热20分钟。
实施例2参照实施例1的方法，将CP(学名粉刺丙酸杆菌，propionibacterium acnes)65101(76-27)连续4次传代后接种于营养罐，在硫乙醇酸盐培养基(不含琼脂)(使用前将培养基用0.45μm膜过滤)中，36-37℃培养6天；逐瓶镜检，有杂菌污染者弃之；合并收集无杂菌污染的菌体加热煮沸60分钟，用超高压射流对撞机在1500kgf/cm2压力下破碎菌体5次；破碎后的悬液8000rpm离心1小时，用无菌生理盐水洗涤沉淀5次，无菌检验(2000版《中国生物制品规程》)及热原检测(2000版《中国人民共和国药典》)合格后制成固体含量为2.0mg/ml的悬液，65℃加热60分钟，得到NCP。
经鲎试剂法(2000版《中华人民共和国药典》)检测(固体含量1mg/ml)，NCP热原160EU/ml；考马斯亮兰法(《生物化学实验原理和方法》，北京大学出版社)测定蛋白质含量40％(g/g)；紫外法(2000版《中国生物制品规程》)260nm测定核酸含量5％(g/g)；蒽酮法(2000版《中国生物制品规程》)测定多糖含量为20％(g/g)。考虑到蛋白质和核酸的测定结果比较准确，估计其余的多糖可能未测出。电镜检测粒度为10-50nm。参见图2，粒度均匀。图1为现有技术的CPP的电镜照片。
分装后，安瓿在60±2℃加热30分钟。
实施例3参照实施例1的方法，将CP(学名粉刺丙酸杆菌，propionibacterium acnes)65102(H-84)连续4次传代后接种于营养罐，在蛋白胨培养基中36-37℃培养7天；逐瓶镜检，有杂菌污染者弃之；合并收集无杂菌污染的菌体加热煮沸30分钟，用超高压射流对撞机(日本Nanonizer Inc.产品，型号AQUA300)800kgf/cm2压力下破碎菌体10次；破碎后的悬液12000rpm离心，用无菌生理盐水洗涤沉淀4次，无菌检验(2000版《中国生物制品规程》)及热原检测(2000版《中华人民共和国药典》)合格后制成固体含量为1.0mg/ml的悬液，65℃加热100分钟，得到NCP。
经鲎试剂法(2000版《中华人民共和国药典》)检测(固体含量1mg/ml)NCP热原60EU/ml，考马斯亮兰法(《生物化学实验原理和方法》，北京大学出版社)测定蛋白质含量12％(g/g)，紫外法(2000版《中国生物制品规程》)260nm测定核酸含量25％(g/g)，蒽酮法(2000版《中国生物制品规程》)测定多糖含量为16％(g/g)，考虑到蛋白质和核酸的测定结果比较准确，估计其余的多糖未测出。电镜检测平均粒度为40-80nm，粒度均匀。分装后，安瓿在60±2℃加热30分钟。
实施例4其它同实施例1，不同之处在于破碎后的悬液在8000rpm离心1小时后，用冻干机冻干，得到粉针剂。
比较例1采用2000版《中国生物制品规程》中描述的方法将CP(学名粉刺丙酸杆菌，propionibacterium acnes)771连续3次传代后接种于营养罐，在硫乙醇酸盐培养基(不含琼脂)中36-37℃培养5天；逐瓶镜检，有杂菌污染者弃之；合并收集无杂菌污染的菌体分别加热煮沸30、60分钟进行无菌试验，无菌试验合格的菌液经离心后，用新鲜无菌生理盐水溶液洗涤沉淀3次并制成悬液，60-65℃加热1小时，无菌检测合格后分装，安瓿在60±2℃加热30分钟，经检测两种样品每瓶含菌为6.0×109。
比较例2其它同比较例1，不同之处在于采集之无杂菌污染的菌体加入甲醛溶液至最终浓度约为0.5％(ml/ml)杀菌48小时，经检测每瓶含菌为6.0×109，游离甲醛含量为0.06g/L。
实验例1由比较例2看出，CPP中残留有微量的甲醛，甲醛能固定蛋白质，杀死细菌，但对机体具有较强的刺激性。CPP中甲醛残留量虽然很少(应不高于0.06g/l)，但仍会对人体，尤其是对敏感的胸膜产生刺激性。
本发明中按照2000版《中国生物制品规程》中第240-241页中CPP制造及检定规程中规定的方法对比较例1、2制备的CPP的脾激活及抑瘤生物学活性进行了试验，结果见表1。
同时，本发明中按照下述方法对本发明实施例1-4的NCP脾激活及抑瘤生物学活性进行了试验，结果见表1。
脾激活试验用体重18-20g纯种小鼠(C3H、615或C57BL)，试验组及对照组各10只，雌雄各半。试验组每只小鼠腹腔分别注射CPP 0.5ml(含菌1.5×109)及实施例1-3的NCP制剂0.5ml(1-3的NCP固体含量都调整到1mg/ml)，对照组注射同量生理氯化钠溶液。14天处死小鼠，分别称体重、脾重、计算脾指数，其指数应不低于2.0。
抑瘤实验(艾氏腹水瘤)用体重18-20g纯种小鼠(C3H、615、C57BL、K-LACA或昆明鼠)，试验组及对照组各10只，雌雄各半。每只小鼠腹腔注射活的瘤细胞(5.0×106/ml)0.2ml(用传代5-8天非血性腹水)。试验组于注射瘤细胞前1天及注射后次日起，连续腹腔分别注射CPP 0.25ml(含菌1.5×109)及实施例1-3的NCP 0.25ml(1-3的NCP固体含量调整到2mg/ml)5次，每次间隔1天。对照组注射同量生理氯化钠溶液。对照组小鼠全部因癌性腹水死亡为起点计算试验组小鼠存活率，观察期30天，其存活率应不低于70％。
表1
脾激活及抑瘤实验可说明CPP或NCP的生物学活性及药效。表1的结果表明，加热煮沸30分钟、加热煮沸60分钟、0.5％甲醛溶液灭活制备的CPP以及本发明的NCP，其小鼠脾激活及抑瘤实验效果相同，无明显差异，说明加热煮沸灭活以及破碎提取对CPP及NCP的生物学活性及药效无明显影响。
实验例2本实验为人体对NCP、CPP、UCP吸收性能的比较内容家兔CPP、UCP及NCP皮内吸收实验。UCP为超声波破碎细菌，在冰浴条件下，输入高能超声波破菌10次，每次30s，每次间歇30s；将超声液8000rpm离心30min，取沉淀加N.S悬浮制成。
家兔1500-2000克，雌雄各半，分为CPP组、UCP组及NCP组，每组各4只。
给药每只兔背部皮内注射，对照组CPP组0.2ml/只(150亿/ml，相当于2.5mg/ml)，NCP组0.2ml/只(2.5mg/ml)，UCP组0.2ml/只(2.5mg/ml)。
方法观察并测试注射局部，结果见表2
结论观察72小时，NCP易于被吸收，未产生明显红肿、硬结，CPP、UCP不易被吸收，产生了明显的红肿、硬结反应。此结果说明将CPP的细胞破碎至纳米级，制备NCP，更有利于机体的吸收，并能显着减少副作用。
实验例3
小鼠一次肌注最大剂量的NCP 31.7mg/ml，小鼠未出现死亡，未发现与给药有关的临床表现，也未发现给药对体重的影响，给药剂量相当临床用药量的452.9倍，说明人临床拟用剂量是一个安全剂量。
实验例4本实验例研究了NCPP对肝纤维化的影响，表明无细胞短棒状杆菌纳米级制剂(NCPP)作为一种具有抗病毒、抗肿瘤作用的免疫增强剂，对肝纤维化的形成过程起着重要的作用，为其制备抗纤维化药物提供了依据。
材料C57/B6和615小鼠18-20g，雌雄各半；猕猴，年龄3-4岁，雌雄各12只，均由中国军事医学科学院实验动物中心提供；痤疮丙酸杆菌(Ppropionibacterium acnes，P.acnes，ATCC12930)购自美国菌种保藏中心(ATCC)，短棒状杆菌(corynebacterium parvum，又名痤疮丙酸杆菌，CPP，Propionibaterium acnes，CMCC65101)由中国药品生物制品检定所提供或采用法国Merleux研究所生产的灭活菌苗；NCPP是由短棒状杆菌(CMCC65101)破碎至纳米级的无细胞制剂，参见实施例1。细胞因子IFN-γ、TNF-αELISA检测试剂盒为Pharmingen公司的产品。
方法1腹腔巨噬细胞培养将C57/B6小鼠30只随机分3组痤疮丙酸杆菌组、NCPP组、生理盐水对照组。第1d，痤疮丙酸杆菌组小鼠每只每次腹腔注射3×1010.mL-1痤疮丙酸杆菌0.1ml；NCPP组小鼠每只每次腹腔注射5mg.mL-1NCPP0.1ml；对照组小鼠每只每次腹腔注射生理盐水(NS)0.1mL。第7d再次注射，方法同初次。
初次注射后的第10d处死小鼠，置消毒液浸10min后，用不完全RPMI1640 5mL反复洗腹腔，取腹腔液，1500r.min-1离心15min，洗2次，加完全RPMI1640 1mL，细胞计数，调整细胞数为2×106/ml。将细胞悬液加入24孔板每孔1mL，37℃5％CO2孵箱培养2h。弃上清，每孔用含5％小牛血清的RPMI1640洗板3次；弃去未粘附细胞单层，贴壁细胞为巨噬细胞单层；将终浓度为10ug.mL-1LPS加入巨噬细胞单层，每孔1mL，培养至48h；收集上清液，置-20℃冰箱保存待测。
2.细胞因子的检测取上述培养上清液检测IFN-γ和TNF-α等各种细胞因子，按试剂盒说明书操作。
3脾指数、脾脏病理检查C57/B6小鼠，18-20g，雌雄各半，随机分为3组(NCPP组、痤疮丙酸杆菌组及对照组)，每组10只，腹腔注射1mg/mL-1NCPP 0.5mL和6×109.mL-1痤疮丙酸杆菌0.5mL(1mg.mL-1NCPP相当于每mL痤疮丙酸杆菌含菌6.0×109)，对照组注射0.5mL生理氯化钠溶液。14d处死小鼠，进行脾指数测定，并做脾脏病理检查。
4抑瘤试验615小鼠18-20g，雌雄各半，随机分为3组(NCPP组、痤疮丙酸杆菌组及对照组)，每组10只，试验组每只腹腔注射活的瘤细胞(5.0×106.mL-1)0.2mL，于注射癌细胞前1d及注射后次日起，连续(间隔1d)腹腔注射1mg.mL-1NCPP 0.5mL与6×109.mL-1痤疮丙酸杆菌0.5mL 5次，计算小鼠存活率。
5猴肝病理检查猕猴随机分为4组，生理盐水(NS)组作为阴性对照，NCPP设为3个给药剂量组(9，3，1mg.mL-1)/只/次，每组6只，雌雄各半，后肢外侧肌肉内交替注射给药，每周两次，连续90d。于停药次日，处死动物。解剖取肝脏，生理盐水洗净，取材后固定于10％中性甲醛固定液，经梯度乙醛脱水、二甲苯透明、腊块包埋、切片(厚7um)及苏木素伊红(HE)染色等步骤。在光学显微镜下观察结果。
6结果1细胞因子IFN-γ的检测 NCPP组与痤疮丙酸杆菌组比较，NCPP组小鼠腹腔巨噬细胞IFN-r的水平明显高于痤疮丙酸杆菌组，两组有显著差异(p＜0.05)；与生理盐水组比较，NCPP组和痤疮丙酸杆菌组均有显着差异(p＜0.05)。见表7。
2细胞因子TNF-α的检测 NCPP与痤疮丙酸杆菌组比较NCPP组小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α的水平明显低于痤疮丙酸杆菌组，两组有显着差异(p＜0.05)；与生理盐水组比较，NCPP组和痤疮丙酸杆菌组均有显着差异(p＜0.05)。见表7。
3脾指数、脾病理及抑瘤率NCPP组和痤疮丙酸杆菌组均引起小鼠脾脏明显增大，脾指数增高。痤疮丙酸杆菌组与NCPP组脾脏病理结果相同与正常对照组比较，脾窦中单核细胞及多核巨细胞明显增多，表明两组均可刺激单核巨噬细胞增加。但NCPP组对小鼠艾氏腹水瘤有明显的抑瘤作用，而痤疮丙酸杆菌组抑瘤作用较差。见表8。
表7ELISA法检测小鼠腹腔巨噬细胞中IFN-r和TNF-α的含量(n＝10)
*P＜0.01，compared with control group.
△P＜0.01，compared with P.acnes group.
表8NCPP与P.acnes脾激活(脾指数)及抑瘤作用(存活率)
猴肝病理检查结果形态学观察判断为阴性的标准肝脏病理检查结果肝小叶、肝窦、肝板及肝细胞结构正常，肝窦未见扩张，肝细胞未见明显变性。在肝组织中偶见肝细胞点状坏死，个别汇管区可见少量慢性炎性细胞浸润。
镜下观察猴肝脏病理结果与正常对照组比较，NCPP高、中剂量组肝脏组织结构正常，肝细胞浊肿，肝窦内炎性细胞较多，杜氏细胞增多，窦内皮细胞核增大，汇管区可见炎性细胞浸润，散在肝细胞红染，红染肝细胞变小、固缩；低剂量组汇管区炎性细胞明显少于高、中剂量组。NCPP无毒作用剂量介于1～3mg/只，在此剂量下，重复给药安全；3个月长期重复给药，肝没有明显的纤维化现象。CPP具有类似的作用。
结论肝纤维化的发生机制比较复杂，是多种因素相互作用的结果。多数学者认为，各种病因引起肝细胞(hepatic cell，HC)损伤，刺激库普弗细胞，分泌多种细胞因子，与血小板、肝窦内皮细胞(SEC)等细胞分泌的细胞因子，激活肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)，并引起大量细胞外基质(ECM)沉积，导致了肝纤维化的发生。这些细胞因子，如转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、干扰素(IFN-α、IFN-γ)等，是一类由单核-巨噬细胞、淋巴细胞和内皮细胞等分泌的多肽物质，对细胞外基质中胶原蛋白的代谢有着重要的调控作用。Knittel、Friedman等学者认为TGF-β是最主要的致肝纤维化的细胞因子，在肝脏内主要由库普弗细胞、肝窦内皮细胞合成分泌。TGF-β以激活HSC，使细胞表面的I型受体磷酸化，活化的I型受体可激活Smad2、Smad3(为受体激活的Smad亚类成员)，后者与Smad4结合成异二聚体并转位至胞核，从而调节ECM等目的基因的转录；也可以抑制基质金属蛋白酶合成，促进金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)、纤溶酶原激活物抑制因子PAI-1生成，使ECM降解减少，最终引起大量ECM沉积。TNF-α是一类主要由单核-巨噬细胞产生的细胞因子，可促进肝内HSC细胞及纤维母细胞的增殖，并促使HSC向肌纤维母细胞转化。TNF-α在肝纤维化的形成过程中起着重要的促进作用。干扰素是具有确切抗纤维化作用的细胞因子，目前已被美国肝病年会正式推荐使用。它的作用机机制可能是抑制HSC细胞增殖分化，减少细胞外基质的合成，促进其降解；可以降低成纤维细胞I、III胶原mRNA水平，减少胶原合成；可以经JAK1/STAT1信号转导通路诱导激活抑制因子Smad7，抑制TGF-β信号转导途径的活化因子Smad3/Smad4的磷酸化，从而抑制TGF-β的信息传递途径，达到抗纤维化的作用。但是基因工程干扰素存在着半衰期短、易产生抗体、与靶器官以外的器官组织及细胞受体广泛结合、大剂量应用不良反应明显等缺点。
随着分子生物学的发展，抗肝纤维化药物的研究进展较快。抗肝纤维化药物包括细胞因子拮抗剂(如Decorin)、影响胶原合成代谢类药物(如多聚不饱和卵磷脂)、中草药(如丹参)及基因治疗等。虽然目前抗肝纤维化研究的药物种类繁多，它们在体外试验及动物模型均呈现一定的作用，但是临床应用尚无十分有效的药物，有待于进一步研究。
巨噬细胞(macrophage，Mφ)在肝纤维化过程中发挥着重要的作用。本试验结果表明痤疮丙酸杆菌(ATCC12930)可能刺激单核巨噬细胞分化为炎症Mφ，产生部分IFN-γ(抗纤维化因子)，具备一定抑瘤作用；而NCPP(来自短棒状杆菌CMCC65101)可以刺激单核巨噬细胞分化为活化Mφ，可明显促进小鼠产生较高水平的IFN-γ，较低水平TNF-α，且具有明显的抑瘤作用；NCPP高、中、低剂量长期重复给药，猴肝病理检查没有明显的纤维化现象。即NCPP活化Mφ，不引起肝纤维化。
实验例5研究表明，肝纤维化的形成是一个缓慢复杂的过程，HSC的增生和激活在这一过程中处于中心环节，各种致肝纤维化因素都是通过这个环节，以HSC为靶细胞，造成细胞外基质(ECM)在肝脏沉积导致肝纤维化发生。肝脏炎症细胞中的巨噬细胞-库普弗细胞(Kupffercell，KC)，在此过程中发挥着重要的作用。我们的研究显示，无细胞短棒状杆菌纳米级制剂(NCPP)可以刺激小鼠腹腔巨噬细胞分化为活化Mφ，产生较高水平的IFN-γ和较低水平TNF-α，是一种具有抗病毒、抗肿瘤作用的免疫增强剂；猕猴3个月长期重复给予NCPP，取各器官组织(包括肝脏)病理检查，未见肝纤维化现象。为了研究CPP、NCPP是否具有抗纤维化作用，我们通过建立免疫损伤性肝纤维化大鼠实验模型，对其进行了初步研究，结果报告如下
1材料与方法1.1材料健康雌性Wistar清洁级大鼠91只，体重150-200g，购自中国药品生物制品检定所实验动物中心。短棒状杆菌(corynebacterium parvum，CP，CMCC65101或65102)由中国药品生物制品检定所提供或采用英国Wellcome药厂产品；NCPP是由短棒状杆菌破碎至纳米级的无细胞制剂，制备方法见实施例2。人血清白蛋白购自上海新兴血液制品研究所，批号20001067；弗氏佐剂为Sigma公司产品，批号为12K8930；无菌生理盐水购自北京双鹤药业股份有限公司，批号为021120812；大鼠肝脏病理检查由山东大学医学院病理研究室完成。肝功能指标采用自动生化分析仪检测，由中国预防医学科学院完成。血清PIIINP、COL IV、HA、Laminin采用ELISA方法测定，试剂盒购自大连泛邦化工技术开发有限公司(美国TPI公司产品)。血清IFN-γ、TNF-α、TGF-β1的含量的测定采用放免法，由北京环亚泰克生物医学技术有限公司完成。
1.2方法1.2.1动物模型的建立按王宝恩等在《实验性免疫性肝纤维化模型的研究》(Chin Med J(中华医学杂志)，1989，69503)报道的方法建立大鼠免疫性肝纤维化模型。将人血清白蛋白用生理盐水稀释，与等量的不完全福氏佐剂乳化，每只大鼠两侧腹股沟皮下多点注射，每次注射0.5ml，含白蛋白5mg，致敏过程共注射3次，第1次注射间隔14天，第2次注射间隔10天。第3次注射10天后，经大鼠尾静脉攻击注射人血清白蛋白0.5ml/只，含白蛋白5mg，每周2次，共注射8周。
1.2.2给药治疗于造模完成后，将大鼠分为五组，每组10只，肌肉注射给药。正常对照组(未造模处理)无菌生理盐水0.1ml/只；模型对照组无菌生理盐水0.1ml/只；CP组、NCPP低剂量组NCPP 0.25mg/只；NCPP中剂量组NCPP0.5mg/只；NCPP高剂量组NCPP1mg/只。每周2次，持续3个月。
1.2.3标本采集及统计分析于末次给药后次日，将大鼠麻醉，腹主动脉采血，离心制备血清，分别测定肝肾功能、血清中PIIINP、COL IV、HA、Laminin以及IFN-γ、TNF-α、TGF-β1的含量；观察肝脏的外观，取出肝脏称重并留取肝左叶做HE染色，镜下观察病理学改变。
统计分析定量资料数据用x±s表示，单因素方差分析；定性资料用频数表记录，秩和检验分析；P＜0.05有统计学意义。
2结果2.1大鼠肝脏病理学检查结果正常大鼠肝脏外观为紫红色，肝表面光滑有光泽。HE染色显示肝小叶间无纤维间隔，没有肝细胞变性、坏死；模型对照组中大鼠肝脏为浅紫色，表面粗糙无光泽，肝脏边缘不齐，肝表面可见结节。病理检查显示汇管区及中央静脉周围可见结缔组织增加，部分样本存在肝细胞气球样变性、坏死，可见少量凋亡细胞，炎细胞散在或聚集呈灶状分布；NCPP治疗各组大鼠肝脏外观大致正常，个别表面略显粗糙。病理显示肝脏结构基本正常，汇管区结缔组织增生，肝组织中纤维结缔组织增生程度明显减轻，少数可见假小叶形成，纤维间隔变细，肝细胞变性、坏死较轻。高剂量组对肝纤维化的改善明显。具体分级结果见表9，经秩和检验得P＜0.005，各组的肝纤维化分级存在程度上的差别。
表9大鼠肝脏病理分级结果
2.2各组大鼠肝肾功能的测定结果模型对照组谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)明显升高，而白蛋白(ALB)降低，与正常对照组有显著差异；经不同剂量的CP、NCPP治疗后，肝功能明显改善，NCPP中剂量组和高剂量组AST、ALT、TBIL甚至接近正常水平。见表10。
表10NCPP治疗前后免疫损伤性肝纤维化大鼠肝肾功能的测定
**与模型对照组相比较，P＜0.01，*与模型对照组相比较，P＜0.05▲▲与空白对照相比较，P＜0.01，▲与空白对照相比较，P＜0.052.3各组大鼠血清学指标的测定结果模型对照组血清PIIINP、COL IV、HA及Laminin的含量较正常对照组明显增加(P＜0.01)，不同剂量CP、NCPP组各血清学指标较模型对照组明显下降，中、高剂量组作用显著，各指标几乎恢复正常水平。见表11。
表11 NCPP治疗前后免疫损伤性肝纤维化大鼠血清胶原水平的测定
**与模型对照组相比较，P＜0.01，*与模型对照组相比较，P＜0.05▲▲与空白对照相比较，P＜0.01，▲与空白对照相比较，P＜0.052.4各组大鼠血清中IFN-γ、TNF-α、TGF-β的测定结果，见表12。
表12 NCPP治疗前后免疫损伤性肝纤维化大鼠血清细胞因子水平的测定
**与模型对照组相比较，P＜0.01，*与模型对照组相比较，P＜0.05▲▲与空白对照相比较，P＜0.01，▲与空白对照相比较，P＜0.05在我国，肝纤维化多见于慢性乙肝患者，其所造成的肝脏损伤主要为免疫性损伤，人血清白蛋白所致的大鼠肝纤维化与人类肝脏慢性损伤和纤维化过程相似，所以，免疫损伤性肝纤维化大鼠是较为理想的实验模型。
肝纤维化发生时细胞外基质过度增生、降解受阻，其主要成分是胶原蛋白，以I型和III型胶原为主，早期纤维化时III型胶原的比例大于I型，PIIINP可反映III型胶原合成的活性；HA是一种糖胺多糖，由间质细胞合成，肝内皮细胞摄取和降解，可反映肝纤维化和肝损伤；Laminin和COL IV都是构成基底膜的主要成分，其水平的升高反映基底膜增生、肝血窦毛细血管化的情况。对上述四种血清指标的联合检测，对肝纤维化的诊断具有一定的参考价值。
本发明的试验研究中，对模型对照组的病理检查显示该组大鼠有明显的肝纤维化表现，肝功能损伤严重，与正常对照组比较有显著差异，CP、NCPP的各个剂量组对大鼠肝纤维化模型的治疗作用明显，肝脏组织病理改变向良性方向发展，肝功能得到较好的改善；血清学指标的检测也显示NCPP各剂量组血清PIIINP、COL IV、HA及Laminin的含量均低于模型对照组，接近正常水平，表明肝内ECM的合成受到抑制，或降解加速。上述研究提示，采用纳米技术制备的NCPP作为一种非特异性免疫增强剂，对免疫损伤造成的大鼠肝纤维化具有明显的治疗作用。
目通常认为，按免疫功能特性区分，巨噬细胞可分为定居巨噬细胞、炎症巨噬细胞和活化巨噬细胞三类。在某些致炎物质的刺激下，库普弗细胞可转化成炎症巨噬细胞，分泌活性增强，分泌多种细胞因子，随同血小板、肝窦内皮细胞和肝细胞等分泌的多种细胞因子及一些化学介质如TGF-β1、TNF-α、白细胞介素-1(IL-1)、血小板衍生生长因子(PDGF)等共同作用于肝星状细胞(HSC)，使其激活，转化为肌成纤维细胞，促进大量ECM的合成增加，降解减少，导致肝纤维化发生。然而，当巨噬细胞在某些细胞因子或其他刺激因素的的诱导下，成为活化巨噬细胞时，分泌功能减弱，吞噬功能明显增强，同时分泌白介素-10(IL-10)、干扰素(IFN)等抗纤维化因子的能力也增强，有可能逆转肝纤维化的过程。我们以往的实验也发现给与小鼠不同刺激药物其腹腔巨噬细胞可转化为炎症巨噬细胞或活化巨噬细胞，产生不同的效果，结合本次实验结果我们初步分析，NCPP可能通过将库普弗细胞转化成活化巨噬细胞，增强IFN-γ的分泌，抑制HSC的活化和增殖，继而抑制ECM的合成或促进其降解而发挥抗肝纤维化的作用。
实验例61.短棒状杆菌制剂(CPP)或无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)对肺纤维化的治疗。
特发性肺纤维化(IPF)，是指原因不明并以普通型间质性肺炎(UIP)为特征性病理改变的一种慢性炎症性间质性肺疾病，它是严重危害人类健康的主要疾病之一。目前，对IPF治疗尚无确实、有效的方法。本发明研究了一种短棒状杆菌制剂(CPP)或无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)治疗IPF的有效性。实验中，确诊的IPF患者180例，诊断均符合2000年美国胸科学会/欧洲呼吸病学会(ATS/ERS)提出的IPF(UIP)临床诊断标准。入选患者按性别、入院顺序编码。采用随机数字表法分为常规治疗组、CPP组和NCP组，常规治疗组服用，泼尼松0.5mg/kg，每日1次口服，疗程4周，CPP组注射规格为1mg/mL(6×109/mL)的痤疮丙酸杆菌1.0mL，NCPP组注射规格为1mg/mL-1(6×109/mL)的本发明实施例3的NCPP 0.5mL，疗程4周.治疗三周后，NCP组组肺功能及血气指标较治疗前有较明显改善(P＜0.05)，CPP组有一定改善，NCP组有效率89.86％，CPP组有效率63.5％，比常规治疗组明显增高(P＜0.05)。
其它实施例的NCPP也具有基本相同的效果。
2.短棒状杆菌制剂(CPP)或无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)对心肌纤维化的治疗心室重构作为高血压最常见的并发症之一，是以心肌细胞增生及间质胶原网络数量、质量发生改变为特征的变化。尤其心肌间质纤维化使心肌硬度增加，顺应性下降，导致心脏舒张功能障碍，是心力衰竭、心律失常发生发展的重要环节。因此，早期有效地抑制心肌间质纤维化、预防心室重构有极其重要的临床意义。原发性高血压(EH)引起的左室肥厚(LVH)及心肌间质纤维化，作为心血管疾病的独立危险因素已为人们重视。其代表了从高血压到心衰或死亡过程中的关键环节，同时也有充分证据表明，LVH及心肌间质纤维化是中风、心肌梗死、猝死、心绞痛，心衰和肾衰竭的主要危险因素。
本发明探讨了上述实施例的短棒状杆菌制剂(CPP)或无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)对心肌纤维化的治疗作用，实验中，原发性高血压患者(1999年WHO^ISH诊断标准)360例。男240例，女120例；年龄50～72岁，平均(60.5±3.5)岁。经常规检查排除继发性高血压，糖尿病及慢性肝、肾功能不全、肝纤维化等，并经超声心动图检查证实室间隔或左室后壁厚度≥12mm。随机分为两组CPP组和NCP组，CPP组注射规格为1mg/mL(6×109/mL)的痤疮丙酸杆菌1.0mL，NCPP组注射规格为1mg/mL-1(6×109/mL)的本发明实施例2的NCPP 0.5mL，疗程8周.另选正常对照组50例(正常对照组应该用什么？)，治疗四周后应用超声心动图监测治疗前后左心室各项指标，同时采用放射免疫法检测血清 型前胶原、透明质酸、血管紧张素。结果高血压病组治疗前与对照组比较， 型前胶原，透明质酸，血管紧张素明显升高，一氧化氮明显下降，与治疗前比两组治疗后收缩压，舒张压，血管紧张素(ng^L)， 型前胶原(Lg^L)，透明质酸(Lg^L)，室间隔厚度(mm)，左室后壁厚度(mm)，左室舒张内径(mm)，左室重量(g)，左室重量指数(g/m2)均有一定的下降(P＜0.05)，一氧化氮(mmol/L)有明显的升高(P＜0.05)说明本发明的短棒状杆菌制剂(CPP)或无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)具有抑制心肌纤维化及左室肥大的作用。
3.本发明还通过临床研究证明，本发明的上述实施例的短棒状杆菌制剂(CPP)或无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)在用量为对血管纤维化、肿瘤组织纤维化、肿瘤的放疗、化疗产生的纤维化病变、肾纤维化、骨髓纤维化以及老年性痴呆等均有一定的作用。
权利要求
1.一种短棒状杆菌制剂或无细胞短棒状杆菌制剂在制备抗纤维化药物方面的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抗纤维化包括抗肝纤维化、肺纤维化、心肌纤维化、血管纤维化、肿瘤组织纤维化、肿瘤的放疗、化疗产生的纤维化病变、肾纤维化、骨髓纤维化或者老年性痴呆。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的用途是在制备抗肝纤维化药物方面的用途。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的短棒状杆菌制剂一种非特异性免疫调节剂，由短棒状杆菌经甲醛灭活后制成的死菌苗。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的短棒状杆菌制剂为2000版《中国生物制品规程》。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的无细胞短棒状杆菌制剂是由短棒状杆菌经破碎制备的无细胞制剂，粒度小于100nm；优选所述无细胞短棒状杆菌制剂的粒度为10-50nm。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的无细胞短棒状杆菌制剂热原小于160EU/ml，蛋白质含量10-40％(g/g)，核酸含量3-25％(g/g)，其余为多糖；优选，所述的无细胞短棒状杆菌制剂热原小于60EU/ml，蛋白质含量20-30％(g/g)，核酸含量3-10％(g/g)，其余为多糖。
8.根据权利要求4-7任何一项所述的用途，其特征在于，所述的短棒状杆菌学为粉刺丙酸杆菌，菌号为76-27、H-84或77-1。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的短棒状杆菌为粉刺丙酸杆菌77-1。
10.根据权利要求4-8任何一项所述的用途，其特征在于，所述的无细胞短棒状杆菌制剂是通过下述步骤制备的1)CP工作种子批菌种连续2-4次传代后接种于大瓶或营养罐，在培养基中培养5-7天；2)收集无杂菌污染的菌体，加热煮沸15-60分钟得到菌液；3)无菌试验合格的菌液经洗涤后，用破碎装置破碎菌体；4)菌体破碎后的悬液经离心后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液；5)将悬液加热灭菌，得到NCPP。
全文摘要
本发明涉及一种无细胞短棒状杆菌纳米级制剂(NCPP)在制备抗纤维化药物方面的用途，特别是在制备抗肝纤维化药物方面的用途。所述的NCPP是由CP经破碎制备的无细胞纳米级制剂，其粒度小于100nm。具有低热原、粒度均一、无甲醛残留的特点。NCPP由于具有纳米级，吸收度、扩散度明显提高，与全菌体制剂具有相同的脾激活及抑瘤等生物学活性，并可降低发烧、胸痛、注射局部红肿、硬结等副作用。本发明的NCPP为免疫调节剂，在肌体的纤维化治疗方面，例如抗肝纤维化、抗肺纤维化方面，有着很好的应用；尤其是在抗肝纤维化方面，作用显著。
文档编号A61P43/00GK1868487SQ200610076228
公开日2006年11月29日 申请日期2006年4月19日 优先权日2005年4月19日
发明者高尚先, 李守悌 申请人:中国药品生物制品检定所