专利名称：人类抗Aβ的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的抗体，该抗体为人类抗Aβ1-32淀粉样蛋白抗体。本发明还涉及所述抗体的纯化方法，以及此种抗体及其药物组合物在淀粉样蛋白相关疾病，包括原发和继发的淀粉样变性疾病、特别是老年性痴呆的治疗与诊断方面的应用。
背景技术：
老年性痴呆是一种常见的进行性神经退行性疾病。患者最初表现为部分性遗忘，此后出现烦躁，定向障碍，失语，失认或失用(认知能力下降)，痴呆。有时则表现为欣快和抑郁。常见的发病年龄从40岁一直延续到90岁，女性患者多于男性。患病人数估计约占65岁以上老年人群的5％。因此，老年性痴呆已成为工业化国家的主要问题之一。
老年性痴呆患者脑内特定区域的淀粉样蛋白沉积是老年性痴呆神经病理学改变的核心特征，同时伴有星形胶质细胞增生，小胶质细胞增生，神经细胞骨架异常以及突触缺失。正是这些病理改变与老年性痴呆患者特征性的智力下降和痴呆密切相关。这些神经炎性沉积或斑块(Neuritic Plaque，)与神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles)共同构成了老年性痴呆的主要神经病理学改变。虽然目前发现其他神经病理学改变与老年性痴呆有关，但研究证据显示这些新发现的病理改变也是通过上述的主要病理改变来间接产生致病作用。
神经炎性斑块为累及多种细胞的球形病理损害。通常以不同程度地分布于边缘系统及其相关的新皮质中。β淀粉样蛋白(Aβ)在细胞间所形成的沉积物包含了丰富的纤维性淀粉样蛋白和非纤维性淀粉样蛋白，两种蛋白以混合的形式存在。神经炎性斑块的主要蛋白成分为β淀粉样蛋白(Aβ)。在神经炎性斑块的内部和紧靠斑块的周围具有退化的轴索和轴突。同时有不同数量的活化的小胶质细胞分布于斑块的内部和近周，而活化的星形胶质细胞则分布于核心的区域。
作为斑块主要组成成份的β淀粉样蛋白(Aβ)来源于一个较大的前体蛋白，即淀粉样蛋白前体蛋白(APP)。APP是在机体多种组织中均可表达的多肽，产生后经过不同的分泌酶的剪切以及翻译后加工不同的过程，产生了具有不同长度的多肽链。如β分泌酶和γ分泌酶对APP接近羧基末端的跨膜区域的裂解产生了β淀粉样蛋白Aβ1-39、Aβ1-40和Aβ1-42。
正常细胞不断分泌β淀粉样蛋白，因而在健康人的血清和脑脊液(CSF)中可以检测到循环的Aβ多肽。老年性痴呆患者由于Aβ产生增加和/或分解减少导致沉积斑块的形成，最终引发了老年性痴呆的一系列神经病理改变。观察发现，APP基因的突变是导致家族性老年性痴呆的主要原因。证明了Aβ在老年性痴呆发病中的作用。
Schenk和他的同事(Schenk et al，Nature 400173，1999)对接受免疫治疗后的PDAPP小鼠脑内的斑块进行了定量研究。用Aβ加Freud’s佐剂对PDAPP小鼠进行免疫的不同时间后，发现这些小鼠脑内沉积的斑块大幅度减少。而对照组小鼠则未显示出任何的改变。
与对照组相比，通过用预处理获得的聚集型Aβ1-42免疫APPV717F转基因小鼠后，不仅明显减弱了年轻小鼠淀粉样蛋白斑块的形成，抑制神经轴索的萎缩以及星形胶质细胞增生，而且能够减少老年小鼠淀粉样蛋白斑块的形成。但是，临床试验证明这种治疗方法引起了很严重的毒副作用，并被立即停止(Dodel et al.，Lancet Neurol2(4)215-20，2003)。另外，用人源化的鼠抗人Aβ的抗体的治疗也产生了很大的毒副作用，原因是鼠的抗体的蛋白序列可以引起人体的排异性免疫反应，特别是长期应用后引起的炎症排斥反应，同时降低了抗体在体内的浓度。
除了上述发现外，迄今为止对淀粉样蛋白相关疾病，特别是老年性痴呆缺乏可供临床使用的有效疗法。然而，老年性痴呆的发病率在世界范围内却日益增长，因而亟待有效疗法的问世。为此，本发明的目的之一就是要为淀粉样蛋白相关疾病，特别是为老年性痴呆的治疗提供有效疗法及其相应的诊断手段。
发明概述最初，人体内存在自身产生的抗Aβ抗体(Du et al.，Neurology.57(5)801-5，2001)。经过我们进一步的研究，证实这些人类自身产生的抗体为专门针对Aβ1-32的抗体。不仅如此，我们将这种特异的抗体应用于老年性痴呆的转基因小鼠模型APPV717L，发现这种特异的抗体可以清除脑内的Aβ。此外，我们还发现这种特定的人类抗Aβ1-32淀粉样蛋白抗体及其各种药物剂型可以有效地用来诊断和治疗老年性痴呆，由此，本发明提供了一种新的人类抗Aβ1-32淀粉样蛋白抗体、其纯化方法及其各种药物剂型，并且提供了所述抗体或其药物组合物在淀粉样蛋白相关疾病，包括原发和继发的淀粉样变性疾病、特别是老年性痴呆的治疗与诊断方面的应用。
具体来说，为了实现对淀粉样蛋白相关疾病，特别是老年性痴呆的治疗提供有效疗法的目的，本发明首先提供了对以下多肽序列具有特异性的人类抗Aβ1-32淀粉样蛋白抗体NH2-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-COOH。
上述抗体，属于IgG，并且具有特异识别Aβ1-12和Aβ25-32二种多肽片断的功能。
含人类IgG的各种体液中存在人类抗Aβ1-32淀粉样蛋白抗体，这种抗体是通过Aβ的亲和层析色谱法从含有人类IgG的人体体液中分离纯化获得的。
此外，本发明提供了人类抗Aβ1-32淀粉样蛋白抗体的纯化方法，该方法是通过Aβ亲和层析色谱法，从含权利要求1所述IgG的人体体液，包括血清、血浆、血液以及脑脊液中，分离纯化所获得的特异识别并与之特异结合的所述抗体。
第三，本发明提供了上述抗Aβ1-32淀粉样蛋白抗体在制备治疗淀粉样蛋白相关疾病药物中的用途。
第四，本发明提供了上述抗Aβ1-32淀粉样蛋白抗体在制备淀粉样蛋白相关疾病诊断试剂中的用途。
发明的详细说明本申请人通过研究发现，在相关的生物体液中，如脑脊液(CSF)和血浆中存在着天然的抗Aβ1-32多克隆抗体，抗体多肽序列为NH2-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-COOH。
并且还发现在老年性痴呆患者与同龄健康对照人群的脑脊液和血浆中Aβ抗体含量明显不同。据此，我们得出了如下的结论，即抗Aβ1-32抗体可以用于淀粉样蛋白相关疾病特别是老年性痴呆的诊断和治疗。并且这一结论得到了实验的证实。
我们发现在人类的IgG样品中含有只针对Aβ1-32的抗体，即抗Aβ1-32抗体。应用Aβ亲和层析色谱法从含有IgG的人体体液中分离纯化出人类Aβ1-32抗体，并应用抗Aβ1-32抗体为老年性痴呆提供治疗。其治疗包括给予临床老年性痴呆患者应用人体体液中分离纯化的Aβ1-32抗体或由含有高滴度抗Aβ1-32抗体的免疫球蛋白(IgG)。本项发明同时也包括所有能够与Aβ形成抗原抗体复合物的抗体片段，如Fab段，等。
因此，本项发明涉及通过Aβ亲和层析色谱法从含有IgG的人体体液中分离纯化所获得的人抗Aβ1-32淀粉样蛋白抗体。而且，这种抗体专门识别Aβ1-32、Aβ1-12和Aβ25-32中的一种或多种的抗体，特别是能够同时识别上述三种Aβ的抗体。
本发明所述抗体的纯化方法可以按以下步骤进行(1)首先获取含有人类IgG的体液；(2)其次，对已获取的人体体液用Aβ亲和层析色谱法分离纯化抗Aβ1-32淀粉样蛋白抗体；(3)再从层析介质中洗脱回收纯化的抗β淀粉样蛋白抗体。
本发明优选的抗Aβ1-32抗体的纯化方法如下。所述Aβ亲和层析色谱法是由Aβ亲和层析色谱柱完成，所述Aβ亲和层析色谱柱是将Aβ1-32与琼脂糖凝胶4B结合，然后用pH3.5-2.5的洗脱缓冲液在4℃下洗脱富集，此过程用FPLC或其它蛋白纯化系统完成。其步骤包括含人IgG体液的获取；然后用Aβ亲和层析色谱法对所获取的体液进行纯化；通过将Aβ1-32与(NHS-active Sepharose 4 fast flow)结合，以洗脱缓冲液(pH3.5-2.5，在4℃下用FPLC系统)洗脱后回收，获得已纯化的抗Aβ1-32抗体。IgG产品或样品可从一个或多个人体中获取。此外，所述Aβ亲和层析色谱法还可以使用能与Aβ结合的葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶。
本发明同时涉及应用所获得的抗Aβ1-32抗体或其组合物，特别是抗Aβ1-32抗体和/或含抗Aβ1-32抗体的IgG，尤其是富含这种特定IgG的体液用于诊断和/或治疗以老年性痴呆为主的淀粉样蛋白相关疾病。其中主要涉及对以老年性痴呆为主的淀粉样蛋白相关疾病的治疗。
此外，本发明提供了抗Aβ1-32抗体的不同的药物组合物，所述组合物含有抗Aβ1-32抗体和可药用载体。
本发明所述组合物的一个具体实施方式
是，组合物中含有静脉注射用免疫球蛋白。
本发明的药物组合物为适宜给药的药物制剂形式，特别是肠道外给药的剂型，优选注射液，包括静脉注射剂型、肌肉注射剂型和皮下注射剂型等。
本发明药物组合物所用的药物载体可以是任何适宜给药的常规药物载体，具体可以使用的载体可见于各种公开出版的有关药物制剂的教科书和文献。
在本发明的一个具体实施中，将Aβ抗体配成浓度为0.1-10mg/ml的溶液，优选的Aβ1-32抗体的给药剂量是0.1-10.0mg/每公斤体重/每周。对于含抗Aβ1-32抗体的IgG产品，给药剂量范围为0.4-2.0mg/每公斤体重/每周。
本发明所述抗体可用于治疗淀粉样蛋白相关疾病，包括原发和继发的淀粉样变性疾病，尤其是老年性痴呆。
本发明所述抗体还可用于淀粉样蛋白相关疾病，包括原发和继发的淀粉样变性疾病，尤其是老年性痴呆的诊断。
实验作为本发明基础的实验工作通过以下材料和方法完成Aβ抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)将1mg Aβ1-40溶解于2ml的水中，然后加包被缓冲液(1.7mM NaH2PO4*H2O；98mMNa2HPO4*7H2O；0.05％ sodium azide；pH7.4)至200ml。每孔加入把被缓冲液100μl，4℃过夜。然后移去包被缓冲液，用封闭缓冲液封闭酶标板80分钟(封闭缓冲液0.25％ casein in PBS，0.05％sodium azide，pH＝7.4)。用洗脱缓冲液(1×PBS/0.05％Tween-20)洗酶标板三次后，加载样本，4℃下过夜。移去样本，用洗脱缓冲液将酶标板洗三次。将生物素结合的抗人单克隆抗体IgG溶于封闭缓冲液中。加入酶标板中。1小时后，用洗脱缓冲液洗三次。然后加入辣根过氧化物酶结合的抗生物素抗体，孵育一小时。用洗脱缓冲液洗四次，然后加入TMP。10分钟后，加入H2SO4(1N)终止反应，最后在450nm的条件下酶标仪测定并读取结果。
β-淀粉样蛋白的酶联免疫吸附测定应用市售的试剂盒来测定Aβ1-42，Aβ1-40和Aβ1-5。
脑脊液和血浆获得患者的知情同意后，按照临床常规程序采集患者和对照者的血浆和腰部的脑脊液。
老年性痴呆的诊断标准所有正常对照者在临床检查过程中均未发现有认知功能的损害和下降。也没有对认知功能具有潜在影响的神经疾病的病史或证据。具有足够完成日常生活活动的能力。未发现有任何缺陷。所有老年性痴呆的患者都经过了临床检查，包括神经精神病学的检查。为了全面完整的反映患者在认知功能和完成日常生活活动能力的方面的缺陷，应用实验室检查和神经病学检查的手段来排除造成可逆性痴呆的原因。所有痴呆患者必须满足适用于痴呆的ICD-10标准和适用于可疑老年性痴呆患者的NINCDS-ADRDA标准。
实施例
下面的例子仅用以说明发明的目的，无意限制本发明的适用范围。
实施例1用Aβ亲和层析色谱柱分离纯化抗Aβ抗体。
将1g免疫球蛋白(IgG)通过Aβ1-40亲和层析色谱柱后，用洗脱缓冲液(pH2.5)洗脱Aβ抗体.多数Aβ抗体由pH2.5的洗脱缓冲液洗脱获得。层析柱将3mg不同的Aβ多肽片断Aβ1-32结合NHS-active separose 4 fast flow(Pharmacia，5ml)，用Pharmacia公司的FPLC系统在4℃的条件下纯化。用Aβ1-40包被的96孔板完成ELISA反应。结果如图1所示。
实施例2静脉注射纯化的人类抗Aβ1-32抗体对老年性痴呆小鼠转基因动物模型(APPV717L)的治疗在本实施例中，通过尾静脉注射分别给予老年性痴呆小鼠转基因动物模型(APPV717L)人类抗Aβ1-32抗体或不具有抗Aβ1-32抗体的IgG，用药剂量为人类抗Aβ1-32抗体100微克/每周/每只，连续给药二周。给药一周后即可观察到小鼠脑内脑脊液和血清中β淀粉样蛋白以及β淀粉样蛋白抗体(Aβ抗体)含量的变化。同时在用药前和用不同剂量Aβ抗体后分别测定上述指标，作为对照。其目的就是要减低脑脊液中β淀粉样蛋白的浓度或增加血中Aβ的浓度，以此来减少脑中淀粉样蛋白斑块的形成。
结果显示用含人类抗Aβ1-32抗体治疗后，老年性痴呆转基因模型小鼠(APPV717L)的脑内海马、大脑皮质以及全脑组织的总Aβ的水平明显低于用不含抗体的IgG治疗组的水平(见图2)，*p＜0.05，与此同时血浆中总Aβ的水平明显升高(见图3)，***p＜0.001。
权利要求
1.对以下多肽序列具有特异性的人类抗Aβ1-32淀粉样蛋白抗体NH2-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-COOH。
2.权利要求1中所述的抗体，属于IgG，并且还具有特异识别Aβ1-12和Aβ25-32二种多肽片断的功能。
3.权利要求1或2所述抗体的纯化方法，是通过Aβ亲和层析色谱法，从含权利要求1所述IgG的人体体液，包括血清、血浆、血液以及脑脊液中，分离纯化所获得的特异识别并与之特异结合的所述抗体。
4.权利要求3所述抗体的纯化方法，包括(1)对已获取的人体体液用Aβ亲和层析色谱法进行分离与纯化；(2)从层析介质中洗脱收集已经纯化的人类抗Aβ1-32淀粉样蛋白抗体。
5.权利要求3所述抗体的纯化方法，其中所述含IgG的体液为从一个或多个人体中所获取的脑脊液、血浆、血清、全血或尿液样本。
6.权利要求4所述抗体的纯化方法，其中所述Aβ亲和层析色谱法是由Aβ亲和层析色谱柱完成，所述Aβ亲和层析色谱柱是将Aβ1-32与琼脂糖凝胶4B结合，然后用pH 3.5-2.5的洗脱缓冲液在4℃下洗脱富集，此过程用FPLC或其它蛋白纯化系统完成。
7.权利要求1或2所述抗体在制备治疗淀粉样蛋白相关疾病药物中的用途。
8.权利要求7所述的用途，其中所述疾病是原发和继发的淀粉样变性疾病。
9.权利要求8所述的用途，其中所述原发淀粉样变性疾病疾病是老年性痴呆。
10.权利要求1或2所述抗体在制备淀粉样蛋白相关疾病诊断试剂中的用途。
11.权利要求10所述的用途，其中所述疾病是原发和继发的淀粉样变性疾病。
12.权利要求10所述的用途，其中所述原发淀粉样变性疾病疾病是老年性痴呆。
13.一种药物组合物，其中含有权利要求1或2所述的抗体和可药用载体。
14.权利要求13所述的组合物，还含有静脉注射用免疫球蛋白。
15.权利要求13或14的药物组合物，为适宜给药的药物制剂形式。
16.权利要求15所述的药物组合物，为注射液。
全文摘要
本发明涉及一种新的抗体，该抗体为人类抗Aβ
文档编号A61K39/395GK101058608SQ200610076319
公开日2007年10月24日 申请日期2006年4月21日 优先权日2006年4月21日
发明者杜燕生 申请人:杜如昱