液，利用酶解、酸沉、乙醇沉淀、冷冻干燥的方法得到a-淀粉酶抑制剂产 品。本发明方法能够用于a-淀粉酶抑制剂的工业化生产，所得产品的比活力可达22. 38U/ mg，不仅能够促进白芸豆的综合利用，提高其附加值，而且也有助于糖尿病的预防与控制。
【附图说明】
[0036] 图1为本发明实施例1-3中白芸豆蛋白液和所得a-淀粉酶抑制剂产品的 SDS-PAGE电泳图。图中：1、标准分子量蛋白；2、白芸豆蛋白液；3、实施例1中所得a-淀粉 酶抑制剂产品；4、实施例2中所得a-淀粉酶抑制剂产品；5、实施例3中所得a-淀粉酶抑 制剂产品。图中箭头所指条带即为淀粉酶抑制剂的条带。
[0037]图2为本发明实施例4中相关步骤中蛋白样品的SDS-PAGE电泳图。图中：1、标准 分子量蛋白；2、白芸豆蛋白液；3、蛋白酶解液；4、酸沉所得上清液；5、酸沉所得上清液的醇 沉蛋白。图中箭头所指条带即为淀粉酶抑制剂的条带。
【具体实施方式】
[0038] 通过以下具体实施例对本发明作进一步的具体说明，但应该理解本发明并不受这 些内容所限制。
[0039] 3, 5-二硝基水杨酸法
[0040] 将 0? 25mLa-淀粉酶液（4U/mL)和 0? 25mL待测样品加入到 0? 5mL0? 02mol/L PBS(pH6. 9)中，于37°C水浴lOmin后，加入1 %可溶性淀粉溶液0. 5mL，精确反应5min后加 入lmLDNS试剂，沸水浴lOmin后迅速冷却，适当稀释后，在540nm波长下测定吸光值。对照 管中不加a-淀粉酶液（以同体积PBS补足），其他与抑制剂管相同，其反应体系如表1所 不〇
[0041] 表1a-淀粉酶抑制率测定体系
[0042]
【主权项】
1. 一种提取白芸豆中a -淀粉酶抑制剂的方法，其特征在于，主要包括以下步骤： (1) 白芸豆的预处理：浸泡、磨浆，过滤除渣，得到滤液； (2) 静置：将滤液在室温下静置，使淀粉充分沉降，然后离心取上清液； (3) 灭酶：将上清液灭除内源性a -淀粉酶活性，然后离心取上清液； (4) 乙醇沉淀：向上清液中加入无水乙醇适当搅拌，沉淀蛋白质，然后离心取下层沉淀 物； (5) 溶解蛋白质：将下层沉淀物中残留的乙醇除去，然后用磷酸盐缓冲液溶解蛋白质， 得到蛋白液； (6) 酶解：将蛋白液调至合适的浓度、温度和pH后，加入碱性蛋白酶酶解杂蛋白； (7) 酸沉：用lmol/L的盐酸将酶解液调节至合适的pH进行酸沉，然后离心取上清液； (8) 乙醇沉淀：向上清液中加入无水乙醇，沉淀a-淀粉酶抑制剂，然后离心取下层沉 淀物，该沉淀物为a-淀粉酶抑制剂。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括冷冻干燥的步骤：将沉淀 物在通风橱中放置l_2h后，于_80°C冷冻干燥48h，超微粉碎后即得粉末状的a-淀粉酶抑 制剂产品。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)白芸豆的预处理，是按每100g 白芸豆300-500mL蒸馏水的量，将白芸豆于室温下浸泡7-10h后去皮，然后按100g白芸豆 600-800mL蒸馏水的量，将白芸豆磨浆，过100目筛去除残渣，得到滤液。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3)的灭酶是将上清液在70°C水浴 灭酶 15_30min。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4)乙醇沉淀，是向上清液中加入无 水乙醇至终浓度为70%，在4°C下搅拌2h，然后离心取下层沉淀物，得到蛋白质。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5)溶解蛋白质，是挥发除去蛋白质 中残留的乙醇，然后用0. 02mol//L、pH6. 9的磷酸盐缓冲液溶解蛋白质，得到蛋白液。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6)酶解是将蛋白液浓度调整为 10-20mg/mL，温度为50-60°C，pH为6. 5-7. 5,碱性蛋白酶的添加量为2-6U/g蛋白质，酶解 时间为2-4h。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（7)酸沉，是用lmol/L的盐酸将酶解 液调节至PH3. 0-5. 5,于4°C下静置l_2h，然后离心取上清液。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（8)乙醇沉淀，是向上清液中加入无 水乙醇至终浓度为70%，在4°C下搅拌2h，然后离心取下层沉淀物。
10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法主要包括如下步骤： (1)浸泡去皮：按每l〇〇g白芸豆300-500mL蒸馏水的量，将白芸豆于室温下浸泡7-10h 后去皮； ⑵磨浆：按l〇〇g白芸豆600-800mL蒸馏水的量，将白芸豆磨衆，过100目筛去除残渣， 得到滤液； (3) 静置：将滤液在室温下静置2-3h，使淀粉充分沉降，然后离心取上清液； (4) 灭酶：将上清液在70°C水浴灭酶30min，然后离心取上清液； (5) 乙醇沉淀：向上清液中加入无水乙醇至终浓度为70%，在4°C下搅拌2h，然后离心 取下层沉淀物，该沉淀物为蛋白质； (6) 溶解蛋白质：将蛋白质在通风橱中放置l-2h以挥发去除残留的乙醇，然后用 200-400mL的0. 02mol/L、pH6. 9的磷酸盐缓冲液溶解蛋白质，得到蛋白液； (7) 酶解：将蛋白液调至蛋白液浓度为10_20mg/mL，温度为50-60°C，pH为6. 5-7. 5,加 酶量为2-6U/g蛋白质，酶解时间为2-4h，得到蛋白酶解液； (8) 酸沉：用lmol/L的盐酸将酶解液调节至pH3. 0-5. 5进行酸沉，于4°C下静置l_2h， 然后离心取上清液； (9) 乙醇沉淀：向上清液中加入无水乙醇至终浓度为70%，在4°C下搅拌2h，然后离心 取下层沉淀物，该沉淀物为a -淀粉酶抑制剂； (10) 冷冻干燥：将沉淀物在通风橱中放置l-2h后，于-80°C冷冻干燥48h，超微粉碎后 即得粉末状的a-淀粉酶抑制剂产品。
【专利摘要】本发明公开了一种可工业化提取白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的方法，属于植物有效成分的制备领域。本方法先将浸泡去皮的白芸豆加水磨浆，过筛去除残渣，所得滤液经静置、离心、灭酶、离心、乙醇沉淀后得到蛋白质，将所得蛋白质用磷酸盐缓冲液溶解，用碱性蛋白酶适度酶解以改变杂蛋白的等电点，然后酸沉，收集上清液，经乙醇沉淀、冷冻干燥后即得α-淀粉酶抑制剂产品。本发明制备的α-淀粉酶抑制剂纯度高、活性强，而且本发明所需设备简单、成本低、无污染，有着较好的经济效益和环境效益，可用于工业化大规模生产。
【IPC分类】A61K36-48, A61P3-10
【公开号】CN104523814
【申请号】CN201410790988
【发明人】赵伟, 让一峰, 杨瑞金
【申请人】江南大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月18日