一种可工业化提取白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种可工业化提取白芸豆中a-淀粉酶抑制剂的方法，属于植物有效 成分的制备领域。
【背景技术】
[0002] 随着社会经济的发展和生活水平的提高，糖尿病逐渐成为了一种普遍的疾病，给 人类的健康造成了严重的威胁。糖尿病是一种以糖代谢紊乱为主的全身性疾病，而餐后高 血糖是糖尿病的一个典型特征。餐后血糖的持续升高会产生葡萄糖毒性，损伤心血管系统， 最终对人体造成不可逆的伤害。因此，控制餐后血糖升高，对于控制和延缓糖尿病的发生和 发展至关重要。目前全球糖尿病人已超过1. 5亿，预计到2025年将会达到3亿，其中我国 的糖尿病患者人数超过5000万，而且发病年龄呈现年轻化趋势。因此，对有关预防和控制 糖尿病产品的研宄与开发有着现实的意义和广阔的前景。
[0003] a-淀粉酶抑制剂是一种被广泛研宄的抗糖尿病的物质，属于糖苷水解酶抑制 剂，其化学本质是多肽、大分子蛋白质或含氮碳水化合物，主要通过特异性抑制唾液及肠道 a_淀粉酶的活性来减少糖分摄取，从而抑制血糖浓度升高。目前已从许多植物种子的胚乳 和微生物的代谢产物中分离得到了a-淀粉酶抑制剂，其中从白芸豆中提取的a-淀粉酶 抑制剂因具有抑制活性高、安全无副作用等优点而被更多地研宄和应用。白芸豆是世界上 第二大豆科作物，在我国各省区均有种植，其中云南、贵州、四川等省份有较大的种植面积。 据我国古医籍记载，白芸豆性味甘、平，是一种滋补食疗佳品。
[0004] 现有从白芸豆中提取a-淀粉酶抑制剂的方法依赖色谱层析柱，无法工业化大规 模应用，或者不能得到活性较高的a-淀粉酶抑制剂，因而不能适应当今社会的迫切需求。 因此，开发一种可工业化提取白芸豆中a-淀粉酶抑制剂的方法不仅可以促进国内农产品 资源的开发利用，而且对于糖尿病的预防和控制也有着积极的作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种可工业化提取白芸豆中 a-淀粉酶抑制剂的方法，适用于白芸豆中a-淀粉酶抑制剂的工业化大规模提取。
[0006] 所述方法主要包括以下步骤：
[0007] (1)白芸豆的预处理：浸泡、磨浆，过滤除渣，得到滤液；
[0008] (2)静置：将滤液在室温下静置，使淀粉充分沉降，然后离心取上清液；
[0009] ⑶灭酶：将上清液灭除内源性a-淀粉酶活性，然后离心取上清液；
[0010] (4)乙醇沉淀：向上清液中加入无水乙醇适当搅拌，沉淀蛋白质，然后离心取下层 沉淀物；
[0011] (5)溶解蛋白质：将下层沉淀物中残留的乙醇除去，然后用pH6. 9的磷酸盐缓冲液 溶解蛋白质，得到蛋白液；
[0012] (6)酶解：将蛋白液调至合适的浓度、温度和pH后，加入碱性蛋白酶酶解杂蛋白；
[0013] (7)酸沉：用lmol/L的盐酸将酶解液调节至合适的pH进行酸沉，然后离心取上清 液；
[0014] (8)乙醇沉淀：向上清液中加入无水乙醇，沉淀a_淀粉酶抑制剂，然后离心取下 层沉淀物，该沉淀物为a-淀粉酶抑制剂。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括冷冻干燥的步骤：将沉淀物在通风 橱中放置l_2h后，于_80°C冷冻干燥48h，超微粉碎后即得粉末状的a-淀粉酶抑制剂产 品。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，步骤（1)白芸豆的预处理，是按每100g白芸 豆300-500mL蒸馏水的量，将白芸豆于室温下浸泡7-10h后去皮，然后按100g白芸豆 600-800mL蒸馏水的量，将白芸豆磨浆，过100目筛去除残渣，得到滤液。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，步骤（3)的灭酶是将上清液在70 °C水浴灭酶 15_30min〇
[0018] 在本发明的一种实施方式中，步骤（4)乙醇沉淀，是向上清液中加入无水乙醇至 终浓度为70% (v/v)，在4°C下搅拌2h，然后离心取下层沉淀物，得到蛋白质。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，步骤（5)溶解蛋白质，是挥发除去蛋白质中残留的 乙醇，然后用〇. 〇2mol//L、pH6. 9的磷酸盐缓冲液溶解蛋白质，得到蛋白液。
[0020] 在本发明的一种实施方式中，步骤（6)酶解是将蛋白液浓度调整为10-20mg/mL， 温度为50-60°C，pH为6. 5-7. 5,碱性蛋白酶的添加量为2-6U/g蛋白质，酶解时间为2-4h。
[0021] 在本发明的一种实施方式中，步骤（7)酸沉，是用lmol/L的盐酸将酶解液调节至 pH3. 0-5. 5,于4°C下静置l_2h，然后离心取上清液。
[0022] 在本发明的一种实施方式中，步骤（8)乙醇沉淀，是向上清液中加入无水乙醇至 终浓度为70% (v/v)，在4°C下搅拌2h，然后离心取下层沉淀物。
[0023] 在本发明的一种实施方式中，所述方法主要包括如下步骤：
[0024] (1)浸泡去皮：按每100g白芸豆300-500mL蒸馏水的量，将白芸豆于室温下浸泡 7-10h后去皮；
[0025] (2)磨浆：按100g白芸豆600-800mL蒸馏水的量，将白芸豆磨衆，过100目筛去除 残渣，得到滤液；
[0026] (3)静置：将滤液在室温下静置2_3h，使淀粉充分沉降，然后离心取上清液；
[0027] (4)灭酶：将上清液在70°C水浴灭酶30min，然后离心取上清液；
[0028](5)乙醇沉淀：向上清液中加入无水乙醇至终浓度为70% (v/v)，在4°C下搅拌 2h，然后离心取下层沉淀物，该沉淀物为蛋白质；
[0029] (6)溶解蛋白质：将蛋白质在通风橱中放置l_2h以挥发去除残留的乙醇，然后用 200-400mL0. 02mol/L、pH6. 9的磷酸盐缓冲液（PBS)溶解蛋白质，得到蛋白液；
[0030] (7)酶解：将蛋白液调至蛋白液浓度为10-20mg/mL，温度为50-60 °C，pH为 6. 5-7. 5,加酶量为2-6U/g蛋白质，酶解时间为2-4h，得到蛋白酶解液；
[0031] (8)酸沉：用lmol/L的盐酸将酶解液调节至pH3. 0-5. 5进行酸沉，于4°C下静置 l_2h，然后离心取上清液；
[0032](9)乙醇沉淀：向上清液中加入无水乙醇至终浓度为70% (v/v)，在4°C下搅拌 2h，然后离心取下层沉淀物，该沉淀物为a-淀粉酶抑制剂；
[0033] (10)冷冻干燥：将沉淀物在通风橱中放置l_2h后，于_80°C冷冻干燥48h，超微粉 碎后即得粉末状的a-淀粉酶抑制剂产品。
[0034] 上述的离心条件是：4°C，9000r/min，离心20min。
[0035] 本发明提取白芸豆中a_淀粉酶抑制剂的方法，采用浸泡、磨浆、灭酶、乙醇沉淀 的方法获得蛋白