注射 至递送部位，例如使用注射器或者通过导管或中心静脉导线。
[0224] 选择用于治疗配制物的施用方案取决于几个因素，包括该实体的血清或组织周 转率、症状的水平、以及该实体的免疫原性。优选地，施用方案将递送至患者的治疗化合物 的量最大化并与可接受的水平的副作用相协调。因此，所递送的配制物的量部分取决于特 定的实体以及要治疗的病症的严重性。
[0225] 在一个实例中，源自STRO-Γ细胞的上清液或可溶因子、STRO-I +细胞或其后代被 作为单一的丸剂递送。或者，源自STRO-Γ细胞的上清液或可溶因子、STRO-I+细胞或其后 代通过连续的灌输而施用，或者通过例如1天、1周、或每周1-7次的间隔来给药。优选的 给药方案涉及避免了显著的不期望副作用的最大剂量或给药频率。每周的总剂量取决于所 使用化合物的类型和活性。适当的剂量由临床医师确定，例如，使用本领域中已知或者怀 疑会影响治疗或者预计会影响治疗的参数。通常，以稍低于最佳剂量的剂量开始，之后以 小的增量增加直至达到期望的效果或者相对于任何负面的副作用的最佳效果。重要的诊断 量度包括糖尿病症状的那些。
[0226] 根据本发明用于治疗或延缓胰功能异常的进展的实例，优选在对病症的诊断后 施用STRO-Γ细胞和/或其后代细胞和/或源自其的可溶因子，例如使用本领域已知的标 准方法和/或本文所述的方法来诊断，例如葡萄糖耐受。
[0227] 对于那些用于预防或延缓胰功能异常的发作的实例，优选在病症的临床诊断前 施用STRO-Γ细胞和/或其后代细胞和/或源自其的可溶因子，例如，当对象患有受损葡 萄糖耐受和/或受损的禁食糖血时，和/或在自身免应答之前的或伴有自身免应答的I型 糖尿病的情况，如由T细胞群体和/或B细胞群体的扩展所指示出的和/或由自身抗体的 产生所指示出的（例如，在I型糖尿病的发作或进展中针对胰β-胰岛细胞的细胞毒T细 胞的扩展和/或针对一或多种胰β_胰岛细胞标记物的自身抗体的扩展）。用于对自身免 疫应答的发作进行确定或预测的方法对技术人员来说是显见的和/或在本文中有描述。例 如，检测到针对源自胰β-细胞或在胰β-细胞表面的抗原自身抗体，表明了对象针对所 述细胞的免疫应答。一种此类测定检测对象血清中的胰岛细胞抗体。此测定包括使含有胰 岛细胞的胰的切片接触来自测试对象的血清。继而用结合人免疫球蛋白的经标记的二抗来 检测来自对象的血清中的免疫球蛋白（其能够结合胰β_胰岛细胞）。用于检测胰岛细胞抗 体的适宜的方法（其中使用荧光标记物）在例如Bottazzo et al，Lancet 2:1279-83,1974 中有描述。作为选择，或者此外，使用测定法来检测结合对象中特定抗原的自身抗体。举 例来说，Brooking et al. (Clin Chim Acta 331:55-59, 2003)描述了基于ELISA的测定法， 用于检测针对GAD65的自身抗体。所描述的测定法在微量滴定平板上使用低浓度的GAD抗 原以捕获样品中的自身抗体。加入液态的生物素化GAD并且其被自身抗体的第二结合位点 所捕获，而且被检测到产生非同位素的可探测信号的是经生物素化的GAD65。Nagata et al, Ann. New York Acad. Sci 1037:10-15, 2004描述了 ELISP0T测定法，其可用于检测针对 胰岛素、IA-2和GAD65的自身抗体的存在。
[0228] 用于监测治疗/预防的方法
[0229] 用于监测治疗/预防的方法在本说明书的基础上对于技术人员来说将会是很显 然的。例如，血液葡萄糖水平和/或胰岛素水平和/或淀粉酶水平用本领域公知的方法和 /或本文所述的方法进行评估。
[0230] 在另一个实施例中，在处理之后获得胰的样品（例如，活组织检查），以及β细 胞（例如，表达胰岛素的细胞）和/或α细胞（例如，表达胰高血糖素的细胞）和/或 胰岛和/或rox-i表达细胞的数目，例如使用免疫组织化学、免疫荧光、或核酸扩增测定法 如聚合酶链反应（PCR)。此类测定法在本文中有描述。
[0231] 本发明将在下述非限制性的实施例中进行进一步的描述。
[0232] 实施例1
[0233] 用STRO-Γ细胞治疗糖尿病小鼠
[0234] L 1材料和方法
[0235] 小鼠中链脲菌素（STZ)-诱导的糖尿病
[0236] 在第1-4天于4-h的午前禁食后，每天用35mg/kg的β -细胞毒素，链脲菌素 (STZ ;Sigma-Aldrich，St. Louis，MO)经腹膜内（i. ρ.)注射7-8周龄的雄性免疫缺陷NOD/ scid 小鼠（NOD. CB17_Prkdcseld/J;Animal Research Centre, Perth, Australia)。将 STZ 溶 解于pH 4. 5的柠檬酸钠缓冲液中，并在制备好后的15min之内注射。将小鼠保持在无菌 条件下。
[0237] 细胞的灌输和治疗组
[0238] 将经免疫磁性选择的来自积累的骨髓细胞的人STRO-Γ基质细胞基本上按照 Gronthos 和 Zannetino (Methods Mol Biol. 449:45_57,2008)所述的那样进行培养扩展， 并且得自 Angioblast Systems, USA。将传代 4，在 ProFreeze?-CDM(Lonza, USA)中低温保 存的STRO-Γ基质细胞解冻，并对每个小鼠将2. 5x 10 6的细胞配制到200 μ 1的媒介物中 用于立即注射。在第10天，STZ处理后，将每个NOD/scid小鼠，用单一剂量的细胞经胸 壁注射入经麻醉小鼠的左心室（动脉途径）。对照小鼠则通过动脉或静脉途径注射200 μ 1 的媒介物（含有 7. 5% DMSO 和 a -MEM 的 ProFreeze?-CDM)。
[0239] 对血液葡萄糖和胰岛素的测定
[0240] 在 4_h 的午前禁食后，用葡萄糖计（Optimum Xceed? Diabetes Monitoring System ;Abbott Diagnostics, Victoria, Australia)测定尾静脉血液中的血液葡 萄糖。通过使用小鼠特异的ELISA试剂盒（Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA Mercodia, Uppsala, Sweden),在第32天处死小鼠前通过对麻醉的小鼠进行心脏内穿刺 (puncture)而获得的血液中测定血液胰岛素。
[0241] 组织样品的制备
[0242] 通过断颈法对小鼠实施安乐死，将胰摘除并对称地切开，将一半在10% 的中性福尔马林中固定，而将另一半包埋入Tissue-Tek OCT Compound(Sakura Finetek, Torrance, CA)并在干冰上冷冻且储存于-70°C。胰被特定地用于本研究中大部分 的分析，而其它组织如肺、肝、心脏、脾、胃、肠/盲肠、膀胱、睾丸和脑则被收集用于组织病 理学。
[0243] 胰组织的组织学和免疫荧光染色
[0244] 对于胰的组织学，将经福尔马林固定的石蜡包埋的（FFPE)切片用苏木精和曙 红（H&E)染色。将装载至显微镜载玻片上的FFPE组织切片（5 μ m)去石蜡化，并通过在 高压锅中的柠檬酸盐缓冲液中加热而进行抗原恢复（antigen retrieval)。在抗原恢复 后用10%的正常山羊血清将该切片封闭2h并用于使用如下抗体（先前经测试和验证可 检测经抗原恢复的组织中的小鼠特异性分子）的免疫荧光检测：豚鼠抗-胰岛素抗体 (1:100 ;Millipore，USA)、小鼠抗-胰高血糖素抗体（10μ g/ml ;克隆 K79bB10 ;AbCAM)、小 鼠抗-PDX-I抗体（10 μ g/ml ;克隆267712 ;R&D Systems)。在2h的初抗温育步骤之后， 用1 %的正常山羊血清/PBS将载玻片洗涤3次5min并在室温与物种特异性二抗（1:400 ; 山羊抗-小鼠 Alexa Fluor 555 ;Molecular Probe或山羊-抗-膝鼠罗丹明；Jackson Laboratories或山羊-抗-小鼠 IgGl-FITC ;AbCAM)进一步温育90min。对照省略掉初抗。 胰组织中平滑肌肌动蛋白（SM)的染色通过使用小鼠抗-SM-FITC mAb (2mg/ml ;克隆1A4 ; AbCAM)的直接荧光染色来进行。
[0245] 免疫染色的评估
[0246] 在Zeiss Observer Zl显微镜（Germany)中观察载玻片并用AxioCam MRm拍摄图 片。用Axio Vision Rel 4. 7软件分析所拍摄的胰组织（经H&E或者针对胰岛素、胰高血 糖素、PDX-I和SM的抗体染色并且经荧光探针检测）的图片。来自每个实验动物的每个 5mm的H&E切片被用于计数胰岛的总数目以及分析胰岛的大小（面积和直径量度）并且针 对每个相应的经图像分析所测量的总切片面积进行归一化（normalize)。此外，每个经抗 原恢复的5 μ m FFPE切片（由抗-胰岛素、胰高血糖素或Η)Χ-Ι抗体染色）被计数阳性染 色的细胞的总数目并且针对相应的经测量的总切片面积或总胰岛面积来进行归一化。通过 图像分析对不同直径的胰微血管的分布进行计数以及测量，并且针对其相应的经检验的 切片面积进行归一化。所有的图像均在20-40X的物镜放大倍数下进行分析。
[0247] 通过半-定量RT-PCR的RNA分析
[0248] 来自实验组胰的RNA样品是在Trizol试剂中从来自每个冷冻组织的总共IOOmm 的切片中提取的。用 illustra RNAspin Mini RNA Isolation试剂盒（GE Healthcare, UK) 从该Trizol组织提取物中纯化RNA。用分光光度计对总RNA进行定量并将Iyg用 olig〇-dT(pdT12_18)和MMLV反转录酶进行反转录。在表1所给出的扩增条件下用Tth Plus DNA聚合酶（Roche Applied Science)以及用针对鼠基因 MafA、Ngn3、和Pdx-I的引物来将 cDNA样品进行PCR扩增。β-肌动蛋白基因被用于对靶基因的表达进行归一化。用Kodak ID 3. 5软件通过对UV-照射下可见条带的光密度测定分析来对PCR产物进行定量。
[0249] 表 L PCR 条件
[0250]
【主权项】
1. 用于在有需要的对象中改善胰功能的方法，该方法包括给所述对象施用STRO-Γ细 胞和/或其后代细胞和/或衍生自其的可溶因子。
2. 权利要求1的方法，其中所述STRO-Γ细胞和/或其后代细胞和/或衍生自其的可 溶因子的施用促进胰β细胞和/或胰岛的再生。
3. 权利要求1或2的方法，其中所述STRO-Γ细胞和/或其后代细胞和/或衍生自其 的可溶因子的施用在所述对象中降低血液葡萄糖水平和/或提高血液/血清胰岛素水平。
4. 权利要求1至3任一项的方法，其中所述STRO-Γ细胞和/或其后代细胞和/或衍 生自其的可溶因子的施用在所述对象中提高胰β细胞的数目和/或相对于胰α细胞提高 胰β细胞的数目和/或降低胰α细胞的数目和/或提高胰岛的数目。
5. 权利要求1至4任一项的方法，其中所述STRO-Γ细胞和/或其后代细胞和/或衍 生自其的可溶因子的施用在所述对象的胰中提高胰和十二指肠同源异型框因子-I(PDX-I) 的表达和/或提高表达rox-i的细胞的数目。
6. 权利要求1至5任一项的方法，其中所述STRO-Γ细胞和/或其后代细胞和/或衍 生自其的可溶因子的施用在所述对象的胰中诱导或促进动脉发生或血管发生。
7. 根据权利要求1或6的方法，其中所述对象患有与胰的内分泌和/或外分泌功能相 关的胰功能异常。
8. 根据权利要求7的方法，其中所述胰功能异常关联或引起异常水平的胰岛素、胰高 血糖素、促生长素抑制素、胰多肽、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、弹性蛋白酶、羧肽酶、胰脂 肪酶或淀粉酶。
9. 根据权利要求8的方法，其中所述异常水平的胰高血糖素是由分泌胰高血糖素的肿 瘤所引起的。
10. 根据权利要求7的方法，其中所述胰功能异常关联或引起营养的吸收障碍。
11. 根据权利要求7的方法，其中所述胰功能异常关联胰炎、胰机能不全，获得性自身 免疫缺陷综合症、癌症、囊性纤维化或Zollinger Ellison综合症。
12. 根据权利要求7的方法，其中所述胰功能异常导致低血糖或高血糖、降低的血清氨 基酸水平、蛋白尿、或者坏死松解性游走性红斑。
13. 根据权利要求7的方法，其中所述胰功能异常关联或引起碳水化合物代谢病。
14. 根据权利要求7的方法，其中所述碳水化合物代谢病通过由胰所产生的胰岛素的 降低所引起或者通过由胰所产生的淀粉酶的降低所引起。
15. 根据权利要求13或14的方法，其中所述碳水化合物代谢病是糖尿病。
16. 根据权利要求1-15任一项的方法，其中将所述STRO-Γ细胞和/或其后代细胞和 /或衍生自其的可溶因子直接施用至对象的血流中。
17. 根据权利要求16的方法，其中动脉内施用所述STRO-Γ细胞和/或其后代细胞和 /或衍生自其的可溶因子。
18. 根据权利要求1-17任一项的方法，其中施用于对象的所述STRO-I+细胞是 STRO-Ib"、和/或表达组织非特异性碱性磷酸酶（TNAP)，和/或所述后代细胞和/或可溶 因子衍生自是STRO-I b^ /或表达TNAP的STRO-I +细胞。
19. 根据权利要求1-18任一项的方法用于治疗或延缓胰功能异常的进展，其中所述 STRO-Γ细胞和/或其后代细胞和/或衍生自其的可溶因子在病症的诊断后施用。
20. 根据权利要求1-19任一项的方法，另外包括监测或探测胰功能异常的发病和/或 进展、和/或血液葡萄糖水平、和/或血液/血清胰岛素水平、和/或β细胞的数目、和/ 或α细胞的数目、和/或胰岛的数目、和/或rox-ι表达细胞的数目、和/或rox-i表达的 量和/或血管的数目。
21. 根据权利要求1-20任一项的方法，其中所述STRO-I +细胞和/或其后代细胞和/ 或衍生自其的可溶因子以组合物的形式施用，所述组合物包含所述STRO-Γ细胞和/或其 后代细胞和/或衍生自其的可溶因子以及载体和/或赋形剂。
22. 根据权利要求21的方法，其中所述组合物另外包含诱导或增强先祖细胞分化成血 管细胞的因子，或者所述组合物包含组织特异性定型细胞。 23. STRO-Γ细胞和/或其后代细胞和/或衍生自其的可溶因子、或者含有STRO-I +细 胞和/或其后代细胞和/或衍生自其的可溶因子的组合物，其用于： (i) 治疗胰功能异常；和/或 (ii) 改善胰功能；和/或 (iii) 诱导或促进胰β细胞和/或胰岛的再生；和/或 (iv) 降低血液葡萄糖水平和/或提高血液/血清胰岛素水平；和/或 (V)提高胰β细胞的数目和/或用于相对于胰α细胞提高胰β细胞的数目和/或用 于减少胰α细胞的数目和/或用于提高胰岛的数目；和/或 (vi) 提高胰和十二指肠同源异型框因子-i(PDx-i)表达和/或用于提高胰中的rox-i 表达细胞的数目；和/或 (vii) 诱导或促进胰中的动脉发生或血管发生。 24. STRO-Γ细胞和/或其后代细胞和/或衍生自其的可溶因子、或者含有STRO-I +细 胞和/或其后代细胞和/或衍生自其的可溶因子的组合物用于： (i) 治疗胰功能异常；和/或 (ii) 改善胰功能；和/或 (iii) 诱导或促进胰β细胞和/或胰岛的再生；和/或 (iv) 降低血液葡萄糖水平和/或提高血液/血清胰岛素水平；和/或 (V)提高胰β细胞的数目和/或用于相对于胰α细胞提高胰β细胞的数目和/或用 于减少胰α细胞的数目和/或用于提高胰岛的数目；和/或 (vi) 提高胰和十二指肠同源异型框因子-i(PDx-i)表达和/或用于提高胰中的rox-i 表达细胞的数目；和/或 (vii) 诱导或促进胰中的动脉发生或血管发生， 的用途 25. STRO-Γ细胞和/或其后代细胞和/或衍生自其的可溶因子在制备用于： (i) 治疗胰功能异常；和/或 (ii) 改善胰功能；和/或 (iii) 诱导或促进胰β细胞和/或胰岛的再生；和/或 (iv) 降低血液葡萄糖水平和/或提高血液/血清胰岛素水平；和/或 (V)提高胰β细胞的数目和/或用于相对于胰α细胞提高胰β细胞的数目和/或用 于减少胰α细胞的数目和/或用于提高胰岛的数目；和/或 (Vi)提高胰和十二指肠同源异型框因子-I(PDX-I)表达和/或用于提高胰中的rox-1 表达细胞的数目；和/或 (Vii)诱导或促进胰中的动脉发生或血管发生， 的药物中的用途。
【专利摘要】用于在有需要的对象中改善胰功能的方法,该方法包括给所述对象施用STRO-I+细胞和/或其后代细胞和/或衍生自其的可溶因子。本发明的方法可用于治疗和/或预防和/或延缓由胰功能异常引起的或与其相关的疾病的发作,例如,由胰不正常的内分泌或外分泌功能引起的疾病。PTA-728220051219
【IPC分类】A61K35-12, A61P5-48, C12N5-077, A61P1-18
【公开号】CN104546912
【申请号】CN201410727242
【发明人】S·伊泰斯库, R·克里希南
【申请人】中胚有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2009年11月19日
【公告号】CA2744228A1, CN102307992A, CN102307992B, CN103800370A, EP2350266A1, EP2350266A4, EP2350266B1, US8894972, US20110243902, US20150064148, WO2010057260A1