一种β-葡聚糖修饰的脑膜炎多糖结合疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种基于β-葡聚糖修饰而制得的新型脑膜炎多糖结合疫苗，该疫苗可用于预防流行性脑膜炎等疾病，属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002]流行性脑膜炎是由脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)引起脑膜发炎的急性呼吸道传染病，流行地域极广，遍及全球各地。流行性脑膜炎的发病周期大约为3-5年，每8-10年爆发一次大流行。流行性脑膜炎的病情复杂多变，轻重不一，有3种临床表现，即普通型、暴发型、慢性败血症型。潜伏期1-7天，一般为2-3天。脑膜炎奈瑟菌隐藏于患者或带菌者的鼻、咽分泌物中，主要通过咳嗽、打喷嚏、说话等由飞沫直接从空气传播，通过进入呼吸道引起感染，传染性很强。通常以7岁以下儿童的发病率最高，学校、工地和商场等人群集中的地区为易发地。
[0003]抗生素虽然可有效抑制流行性脑膜炎的发生，但经常会产生一些后遗症及并发症。随着抗生素的过度使用，细菌耐药菌株数量和种类迅速增长，使得流行性脑膜炎的治愈更加困难。因此，人们需要对流行性脑膜炎进行积极地预防。化学预防可在密切接触人群中防止继发病例的发生。由于继发病例仅占全部脑膜炎奈瑟菌病例的1-2%，化学预防对于控制大多数地方性和流行性疾病的价值甚小。因此，使用安全有效的疫苗进行免疫接种是控制流行性脑膜炎唯一的合理方法。脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖是引起流行性脑膜炎的主要致病因子，脑膜炎奈瑟菌按其荚膜多糖的特异性可分为A、B、C、D、29E、H、1、K、L、W135、X、Y、Z共13个血清型致病菌。其中，A、C、W135和Y血清型菌株的毒力最强，占总病例数的95%以上，是引起脑膜炎流行最常见的菌株。
[0004]由于脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖属T细胞非依赖性抗原，且两岁以下儿童的免疫系统尚未成熟，对大多数荚膜多糖的免疫应答较弱，不能够达到保护人体所需的抗体水平；同时由于荚膜多糖并不能在体内诱导免疫记忆，抗体在体内的存留时间较短。因此，脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖仅适用于5岁以上的儿童，不能用于2岁以下儿童的常规接种。将脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖与载体蛋白结合，可使荚膜多糖转化为T细胞依赖性抗原，从而刺激婴幼儿的T细胞依赖性抗体的合成，并可产生加强应答，同时还能提高免疫球蛋白(IgG)的抗体比例和抗体亲和力的成熟。这种多糖结合疫苗不仅适用于成人，而且适用于婴幼儿。
[0005]自上世纪八十年代至今已陆续有脑膜炎A、C、Y、W135菌群荚膜多糖与变异白喉毒素等载体蛋白的单价至四价结合疫苗的问世，均显示出了良好的安全性、免疫原性和诱导免疫记忆的功能以及较低成本的优势。然而，目前这些结合疫苗均存在接种剂量较大、免疫效率不高等缺点，亟待研发效率更高和免疫原性更强的新型多糖结合疫苗。近年来，已经从优化多糖蛋白比，合适的载体蛋白，创新的连接工艺以及在多糖蛋白中间加入连接桥方面提高结合疫苗的免疫原性。例如，在多糖蛋白中间加入连接桥聚乙二醇(PEG)使多糖特异性IgG抗体滴度增加三倍相比于未使用PEG作为连接桥的结合疫苗。
[0006]目前，越来越多的免疫调节剂受到了关注。研宄发现多种天然多糖具有良好的免疫促进作用，通过与疫苗混合，可增强疫苗的免疫效果，促进机体产生细胞免疫应答与体液免疫应答。然而将免疫调节剂与多糖结合疫苗进行化学修饰或物理混合的研宄，目前还没有相关的文献报道和相关的专利申请。葡聚糖(β-glucan)具有天然、低毒、无药物残留以及安全性等优点，可修饰到脑膜炎球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗上进一步提高免疫原性和抗体持久性。研宄表明，葡聚糖可影响巨噬细胞的形态、激活巨噬细胞、诱导巨噬细胞分泌较高水平的IL-1和NO，刺激T细胞向辅助性Thl细胞亚群分化，提高宿主抵抗病原微生物和肿瘤的能力，葡聚糖还可以通过与补体因子结合由旁路途径激活补体系统，促进吞噬细胞的吞噬活性。因此，基于葡聚糖免疫佐剂和优化多糖结合疫苗连接桥；从而实现上述免疫佐剂、荚膜多糖、载体蛋白通过新型连接桥共价连接，从而研发得到新型、高效具有强免疫原性的结合疫苗。
【发明内容】
[0007]本发明提供了一种制备基于β -葡聚糖修饰的脑膜炎多糖结合疫苗的方法，并依据该方法，制备出了一种新型的脑膜炎多糖结合疫苗。
[0008]本发明的脑膜炎多糖结合疫苗，其中的脑膜炎奈瑟菌多糖为血清型为Α、C、W135和Y群的脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖。
[0009]本发明所涉及的基于葡聚糖修饰的脑膜炎多糖结合疫苗，其所用的载体蛋白为破伤风类毒素。
[0010]本发明所涉及的脑膜炎球菌多糖结合疫苗，其制备方法由如下步骤组成:(I)脑膜炎球菌荚膜多糖的活化反应与衍化反应；(2)脑膜炎球菌荚膜多糖与载体蛋白的偶联和纯化；(3) β -葡聚糖的活化；(4) β -葡聚糖偶联到脑膜炎多糖蛋白复合物上。
[0011]本发明所涉及的脑膜炎多糖结合疫苗，可用于免疫2个月以上各年龄段的儿童，预防儿童患A、C、W135和Y群流行性球菌引起的感染性疾病。其特点是能显著增强脑膜炎奈瑟菌多糖抗原的免疫原性。本发明以β-葡聚糖修饰多糖-载体蛋白结合物，用于进一步提高脑膜炎多糖结合疫苗的免疫原性，减少婴幼儿接种疫苗的次数、减轻婴幼儿的痛苦及家长的精神负担、降低免疫接种成本，并提高免疫覆盖率。
【附图说明】
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[0012]图1脑膜炎多糖结合疫苗的制备反应示意图。
[0013]图2凝胶过滤法分析脑膜炎多糖结合疫苗。用分析型凝胶过滤柱Superose
6(IcmX 30cm)检测脑膜炎多糖结合疫苗。分析条件:流动相为20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)，流速0.5毫升/分钟，检测波长为280纳米。曲线I为破伤风类毒素(TT)，曲线2为PS-TT，曲线3为PS-TT-G。
[0014]图3脑膜炎多糖结合疫苗的分析。图a为1H NMR分析脑膜炎多糖结合疫苗，图b为FT-1R分析脑膜炎多糖结合疫苗。曲线I为破伤风类毒素(TT)，曲线2为PS-TT，曲线3为 PS-TT-G。
[0015]图4PS-TT及PS-TT-G脑膜炎多糖结合疫苗产生的多糖与蛋白特异性抗体滴度。图a为脑膜炎多糖特异性的IgG抗体滴度；图b为脑膜炎多糖特异性的IgGl和IgG2a抗体滴度；图c为脑膜炎多糖特异性的IgM抗体滴度；图d为蛋白特异性的IgG、IgGl和IgG2a抗体滴度。脑膜炎多糖与蛋白特异性抗体滴度由ELISA方法测定。
[0016]图5PS-TT/G1及PS-TT/G2脑膜炎多糖结合疫苗产生的脑膜炎多糖与蛋白特异性抗体滴度。图a为脑膜炎多糖特异性的IgG抗体滴度，图b为蛋白特异性的IgG抗体。
[0017]图6脑膜炎多糖结合疫苗产生的多糖特异性抗体的特异性。其中，(■)为A群脑膜炎多糖结合疫苗；(籲)为β -葡聚糖修饰的A群脑膜炎多糖结合疫苗。
【具体实施方式】
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[0018]以下通过实施例进一步说明本发明。
[0019]实施例一:β -葡聚糖修饰的脑膜炎多糖蛋白结合疫苗的制备和分离纯化
[0020](I)脑膜炎多糖-载体蛋白结合疫苗(PS-TT)的制备
[0021]将5毫克脑膜炎球菌荚膜Y群多糖(PS)溶于1.25毫升生理盐水中，用浓度为0.5摩尔/升的氢氧化钠将溶液的pH值调整为10.8，加入10微升50% (w/v)的溴化氰，反应30分钟。在活化的过程中随着pH的不断降低，用0.5摩尔/升的氢氧化钠维持溶液的pH值为10.8。活化结束后，用0.5摩尔/升的盐酸将溶液的pH值调整为8.5，随后加入0.15毫升浓度为100毫克/毫升的己二酰肼溶液，于室温下反应过夜(图1)。随后，用截留分子量为1kDa的透析袋在20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)中透析12小时，透析三次。透析后的多糖与溶于20mM的MES缓冲液(pH 6.0)的5毫克破伤风类毒素(TT)和10毫克1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)混合，于4°C下反应过夜(图1)。随后，用截留分子量为1kDa的透析袋在20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)中透析12小时，透析三次，得到多糖-载体蛋白结合物(PS-TT)。
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