一种自噬靶向性核酸疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药生物学技术领域，具体涉及一种自噬靶向性核酸疫苗。
【背景技术】
[0002] 结核分枝杆菌（MTB)感染仍是引起高发病率和死亡率的主要原因，2010年全球新 发结核病例880万，引起110万人死亡。卡介苗（BCG)作为目前唯一使用的抗结核疫苗，其 免疫保护力不稳定，在不同研究中其保护力在0-85%间不等。在过去的几十年里根据结核 分枝杆菌抗原的免疫显性及其在宿主细胞中的保护性免疫发明了许多类型的新疫苗。
[0003] LpqH，分子量为19kDa，是一种存在于结核分枝杆菌的细胞壁相关脂蛋白。最初 LpqH被认为是结核分枝杆菌的主要抗原，除此之外，它还具有更为独特的性质，不但能在结 核分枝杆菌感染的人或动物中激发强烈的适应性免疫，还能诱导巨噬细胞分泌大量IL-12。 此外，基于其脂蛋白的特性，LpqH是介导抗结核的固有免疫反应以及主要组织相容性复合 物I(MHC-I)抗原提呈的分子之一。最近发现脂蛋白在人类单核细胞中具有激活自噬的功 能。
[0004] 自噬，即大自噬，是真核细胞中与分解代谢相关的途径。最近，自噬被认为在防御 结核分枝杆菌等胞内病原体的固有免疫和适应性免疫中起重要作用。通过该途径，增加的 抗原被转运到自噬体或自噬泡，并被降解为抗原肽，促进保护性免疫。通过药物手段或免疫 学方法诱导自噬能够清除巨噬细胞内的结核分枝杆菌，为设计通过激活自噬以提高保护效 力的疫苗提供了可能。有趣的是，在小鼠模型中通过阻断HiTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白） 诱导自噬能够增强Ag85B DNA疫苗的效果。
[0005] LC3是自噬小体膜标记，通常散布于整个细胞质。胞质形式的LC3 (LC3-I)与磷脂 酰乙醇胺共轭形成LC3-II，在受到饥饿以及胞内病原体刺激时被聚集到自噬小体膜上，参 与自噬体形成。与溶酶体融合后，含LC3-II的自噬体被降解为肽链，这在将胞质抗原肽载 至MHC-II中起重要作用。因此，我们测试了 MTB抗原LpqH与LC3融合后是否能靶向至自 噬体，并增强候选DNA疫苗的免疫原性。
[0006] 我们发现，在体外通过基因工程使LpqH与LC3融合能提高LC3-II的表达水平并 定位于自噬体上。此外，LC3_LpqH自噬靶向性DNA疫苗在小鼠模型中通过Thl型免疫增强 抗结核的保护效力。
【发明内容】
[0007] 在此处键入技术领域描述段落。本发明的目的是提供一种新型自噬靶向性核酸疫 苗，以及制备方法和应用。
[0008] 本发明构建了 LpqH DNA与编码微管相关蛋白轻链-3 0X3)基因相融合的自噬靶 向性疫苗，该疫苗能够将抗原运送至自噬体并增强抗结核分枝杆菌的保护效应。
[0009] 本发明以LC3为基础构建pCMV-LC3_LpqH质粒，该质粒可以在体内外高效表达 LC3_LpqH融合蛋白。与LpqH / Ag85B相比，LC3_LpqH / Ag85B免疫的感染毒株结核分枝 杆菌的小鼠在肺和脾脏中结核杆菌载量减低，同时伴随IFN- γ、IL-2、IgG2a的升高。
[0010] 本发明提供了一种新型核酸疫苗，其特征在于能够靶向至自噬体，并且能够增强 Thl型免疫和疫苗的免疫保护作用。
[0011] 本发明中LC3不仅可以构建真核表达载体，还能用于构建原核表达载体。
[0012] 本发明提供的自噬靶向性核酸疫苗不仅可以用于小鼠，还可以用于人类。
[0013] 本发明提供的自噬靶向性核酸疫苗涉及一种脂蛋白LpqH，除LpqH外其他结核分 枝杆菌抗原作为DNA疫苗时，也具有显著的免疫保护作用。
[0014] 本发明还提供了该DNA疫苗的构建方法，包括以下步骤：1.对逆转录获得的 Balb / c小鼠 cDNA进行PCR，PCR产物经琼脂糖电泳切胶回收目的片段，获得含LC3分 子编码序列的DNA片段。2.亚克隆入pCMV-LpqH质粒，筛选重组质粒并酶切鉴定，获得 pCMV-LC3_LpqH 质粒。
[0015] 所采用的技术方案的具体内容： 1.对H37Rv基因组DNA进行PCR。PCR产物经琼脂糖电泳切胶回收目的片段，获得含 LpqH分子编码序列的DNA片段。
[0016] 2.克隆入pCMV-HA质粒，获得pCMV-LpqH，转化筛选重组质粒，经酶切鉴定获得 pCMV-LpqH重组质粒。
[0017] 3.对逆转录获得的Balb / c小鼠 cDNA进行PCR，PCR产物经琼脂糖电泳切胶回 收目的片段，获得含LC3分子编码序列的DNA片段。
[0018] 4.亚克隆入pCMV-LpqH质粒，筛选重组质粒并酶切鉴定，获得pCMV-LC3_LpqH质 粒。
[0019] 本发明经动物实验验证，具有以下属性： (1) LpqH能诱导LC3-II数量增加； (2) LpqH通过LC3定位到自噬体； (3) LC3_LpqH融合蛋白在转染细胞内表达，并且表达水平与pCMV-LC3_LpqH质粒呈紧 密的剂量依赖性； (4) pCMV-LC3_LpqH自噬靶向性核酸疫苗能增强Thl型免疫。
【附图说明】
[0020] 图1是LpqH诱导LC3-II数量增加图。
[0021] 图 2 是 HA-LC3_LpqH 瞬时转染 Raw264. 7 细胞。
[0022] 图3是LpqH通过LC3定位自噬体图。
[0023] 图4是特异性IgG抗体及细胞因子分析图。
[0024] 图5是细菌载量分析图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合附图和具体实例对本发明做详细说明，本发明的实例仅用于说明本发明 而不限制于本发明的保护范围。
[0026] 实施例1 :pCMV_LpqH质粒的构建 为构建pCMV-LpqH质粒，利用DNAClub和Premier Primer5设计基因扩增引物（见表 I)，对H37RV基因组DNA进行PCR。PCR产物经琼脂糖电泳切胶回收目的片段，获得含LpqH 分子编码序列的DNA片段。克隆入pCMV-HA质粒，获得pCMV-LpqH，转化筛选重组质粒，经酶 切鉴定获得PCMV-LpqH重组质粒。纯化后重悬，并于_20°C保存。
[0027] 表1、LpqH序列及上下游引物
【主权项】
1. 一种新型自噬靶向性核酸疫苗，能够靶向至自噬体，并且能够增强Thl型免疫和抗 结核分枝杆菌的免疫保护作用。
2. -种如权利要求1所述的新型自噬靶向性核酸疫苗的制备方法，其特征在于该方法 包括以下步骤： A) 设计PCR引物如下，采用H37Rv基因组DNA进行PCR，获得含LpqH分子编码序列的 DNA片段，克隆入pCMV-HA质粒，获得pCMV-LpqH ; B) 设计PCR引物如下，采用逆转录获得的Balb/c小鼠cDNA进行PCR，得到 编码LC3基因的DNA序列上游引物tatgaattcgggtgaagcgtggactgac,下游引物 ggtagatctggaacaggtcacctcgatttc ； C) 将LC3基因的DNA序列克隆入PCMV-LpqH质粒，获得pCMV-LC3-LpqH质粒。
3. -种以LC3为基础构建pCMV-LC3_LpqH质粒，其特征在于粒可以在体内外高效表达 LC3_LpqH融合蛋白。
4. 如权利要求1所述的新型自噬靶向性核酸疫苗，不仅可以用于小鼠，还可以用于人 类。
5. 如权利要求3所述的LC3不仅可以构建真核表达载体，还可以用于构建原核表达载 体。
6. 如权利要求1所述的新型自噬靶向性核酸疫苗，不仅涉及脂蛋白LpqH，除LpqH外其 他结核分枝杆菌抗原作为DNA疫苗时也具有显著的免疫保护作用。
【专利摘要】本发明涉及医药生物学技术领域。本发明公开了一种自噬靶向性核酸疫苗及其制备方法和应用，本发明构建了LpqH DNA与编码微管相关蛋白轻链-3（LC3）基因相融合的自噬靶向性疫苗，该疫苗能够将抗原运送至自噬体，并且能够增强Th1型免疫和疫苗的免疫保护作用。本发明以LC3为基础构建pCMV-LC3-LpqH质粒，该质粒可以在体内外高效表达LC3-LpqH融合蛋白。本发明中LC3不仅可以构建真核表达载体，还能用于构建原核表达载体。本发明提供的自噬靶向性核酸疫苗不仅可以用于小鼠，还可以用于人类。本发明提供的自噬靶向性核酸疫苗涉及一种脂蛋白LpqH，除LpqH外其他结核分枝杆菌抗原作为DNA疫苗时，也具有显著的免疫保护作用。
【IPC分类】C12N15-66, C12N15-85, A61K39-04, A61K48-00, A61P31-06
【公开号】CN104721834
【申请号】CN201310710775
【发明人】张荣波, 胡东, 吴静, 杜昭弘
【申请人】安徽理工大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2013年12月20日