一种海藻多糖的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学技术领域，具体是一种海藻多糖的应用。
【背景技术】
[0002]随着我国养殖业的飞速发展，特别是近年来集约化养殖业发展很快，目前，畜禽疾病防治也面临很多问题。畜禽传染病根据其病原特性大体可分为病毒性疾病、细菌性疾病、真菌性疾病、支原体病等。而病毒性疾病是目前尚无特效药物和治疗方法的“疑难”。而目前针对病毒性传染疾病主要采取的措施是注射疫苗、运用抗病毒药物等治疗方法。这两种方法都存在一定的缺陷，疫苗注射只是针对于某一种病毒有效，不具有广谱性，而运用抗病毒药物进行治疗也具有一定的局限性，它们可以抑制普通的病毒，但对有些病毒的抗性却不够理想，而且长期使用会产生耐药性。
[0003]研宄报道，多糖作为免疫增强剂可以提高传染性法氏囊炎病毒疫苗、新城疫疫苗的效果。海藻多糖已被发现具有多种生物学活性，目前已经公开报道的活性包括海藻多糖具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗凝血等活性，但对于海藻多糖作为免疫增强剂，尤其是其在预防和治疗禽流感病毒方面的用途还未见报道。相对于油乳剂全病毒灭活疫苗而言，海藻多糖具有原料来源丰富，生产成本低，制备工艺简单等若干优势，且其对动物体没有伤害，并同时具有提高动物免疫力、抗病毒、抗氧化、抗菌等功效。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种海藻多糖的应用。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0006]一种海藻多糖的应用，海藻多糖作为制备抗病毒或免疫的制剂。
[0007]所述海藻多糖作为制备抗畜禽养殖动物的病毒或其免疫的制剂。
[0008]所述海藻多糖作为制备抗禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊炎病毒、传染性支气管炎病毒或轮状病毒的制剂。
[0009]所述海藻多糖作为制备增强T细胞或脾淋巴细胞增殖及活性的增强制剂。
[0010]所述海藻多糖是从海带、马尾藻、裙带菜、泡叶藻、墨角藻、蜈蚣藻、麒麟菜、龙须菜、江蓠、石花菜、琼脂、萱藻、浒苔和孔石莼中的一种或几种大型海藻中提取的粗多糖；
[0011]或，将从海带、马尾藻、裙带菜、泡叶藻、墨角藻、蜈蚣藻、麒麟菜、龙须菜、江蓠、石花菜、琼脂、萱藻、浒苔和孔石莼中的一种或几种大型海藻中提取的粗多糖通过降解的方式获得的低分子量多糖或寡糖。
[0012]上述获得海藻多糖由单糖组成，主要为鼠李糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、糖醛酸、蛋白质、K、Na、Ca和Mg，硫酸根含量在2% -40%之间，其中，粗糖分子量为400KDa-1000KDa，经降解后平均分子量在lKDa_400KDa范围内。
[0013]本发明具有的优点:
[0014]本发明中的海藻多糖均来源于大型经济海藻，原料来源丰富，生产成本低，并且海藻多糖属于绿色环保产品，长期使用不存在对养殖动物的伤害作用；通过细胞模型和体内动物实验表明，所得到的的海藻多糖具有明显的抗病毒作用和免疫增强作用，可以对多种病毒具有治疗效果，因此具有广谱性。
[0015]利用本发明中的海藻多糖直接作用于被病毒侵染的细胞、鸡胚，即可反映证明该海藻多糖具有抗病毒作用。按多糖浓度lmg/ml或0.2mg/ml使用，直接作用于细胞或鸡胚。海藻多糖可以显著抑制H9N2流感病毒及传染性法式囊炎B87病毒的活性，如血凝效价降低，病毒拷贝数降低，细胞因子表达升高等。
[0016]本发明海藻多糖调节动物体液免疫力(见实施例2)。以腹腔注射为方法，利用上述海藻多糖为原料，可验证该多糖对抗体反应的免疫调节作用。按动物(小型动物)体重比10mg/kg或50mg/kg使用。海藻多糖与禽流感病毒(AIV)灭活病毒混匀后，按正常免疫剂量，腹腔注射免疫动物。其特征在于:与疫苗相比，海藻多糖效果更好，如抗体水平提升显著，同时免疫调节作用明显。
[0017]同时海藻多糖也能够增强动物细胞免疫力的调节作用(见实施例3)。利用本发明中的海藻多糖与疫苗联合作用，即可证明该海藻多糖具有调节细胞介导的免疫反应的作用。按动物(小型动物)体重比10mg/kg或50mg/kg使用。海藻多糖与AIV灭活病毒混匀后，按正常免疫剂量，腹腔注射免疫动物。其特征在于:与疫苗相比，海藻多糖效果更好，如细胞因子产生水平提高，T淋巴细胞的分型提高，促进脾脏细胞生长活性等。
【附图说明】
[0018]图1为本发明实施例提供的多糖体外抗H9N2病毒血凝效价图，其中，星号表示和对照之间存在显著差异(以下同)。
[0019]图2为本发明实施例提供的多糖体外抗H9N2病毒H9N2相对表达量图。
[0020]图3为本发明实施例提供的多糖对病毒阻断作用相对细胞活性图。
[0021]图4为本发明实施例提供的多糖对病毒抑制作用相对细胞活性图。
[0022]图5为本发明实施例提供的多糖对病毒直接杀灭作用细胞活性图。
[0023]图6为本发明实施例提供的鸡胚抗病毒实验存活率图。
[0024]图7为本发明实施例提供的鸡胚抗病毒实验血凝效价图。
[0025]图8为本发明实施例提供的鸡胚抗病毒实验细胞因子IL-4表达水平图。
[0026]图9为本发明实施例提供的鸡胚抗病毒实验细胞因子IFN-γ表达水平图。
[0027]图10为本发明实施例提供的两次免疫后小鼠体内AIV特异性抗体含量图。
[0028]图11为本发明实施例提供的细胞因子IFN-Y含量图。
[0029]图12为本发明实施例提供的细胞因子IL-4含量图。
[0030]图13为本发明实施例提供的T淋巴细胞分型⑶3+⑶4+含量图。
[0031]图14为本发明实施例提供的T淋巴细胞分型⑶3+⑶8+含量图。
[0032]图15为本发明实施例提供的不同浓度海藻粗多糖对淋巴细胞增殖的影响图。
【具体实施方式】
[0033]实施例1
[0034]分别以蜈蚣藻、孔石莼和马尾藻为例提取海藻多糖的:
[0035]取破碎后的蜈蚁藻(Grateloupia filicina) 100g，加入5000g蒸饱水，于100°C水浴中浸提2小时；分别用100 0,200目和300目筛絹将滤渣滤出，滤液透析除盐后用减压浓缩设备进行浓缩为原体积的1/10，用4倍体积的95%的乙醇醇沉24小时，离心，沉淀冻干，即得蜈蚣藻多糖，待用。
[0036]破碎后的孔石莼(Ulva Pertusa)加40倍的蒸馏水，于125°C水浴中浸提4小时；分别用100 0,200目和300目筛絹将滤渣滤出，滤液透析除盐后用减压浓缩设备进行浓缩为原体积的1/10，用4倍体积的95%的乙醇醇沉24小时，离心，沉淀冻干，即得孔石莼多糖，待用。
[0037]马尾藻(Sargassumqingdaoense) 10g 加入 3000g 蒸饱水，于 91°C水浴中浸提 4小时。分别用100 0,200目和300目筛絹将滤渣滤出，滤液透析除盐后用减压浓缩设备进行浓缩为原体积的1/10，用4倍体积的95%的乙醇醇沉24小时，离心，沉淀冻干，即得马尾藻多糖，待用。
[0038]分别以蜈蚣藻、孔石莼和马尾藻提取海藻多糖为例进一步获得低分子量的多糖或寡糖:
[0039]将上述分别获得不同藻的多糖(粗糖)用水分别配制0.1 %-4%水溶液，向其中依次加入盐酸终浓度为0-2mol/L和双氧水终浓度为1-10%，然后在功率为50-1000W的微波辅助下，以50-90°C降解5-60min，反应后溶液用碱液中和至中性，透析、浓缩、醇沉、离心收集沉淀，冷冻干燥即得平均分子量在lKDa-400KDa范围内各大型海藻中低分子量的海藻多糖或寡糖。
[0040]上述所得海藻多糖的单糖组成，主要为鼠李糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、糖醛酸、蛋白质、K、Na、Ca和Mg，硫酸根含量在2% -40%之间。
[0041]实施例2
[0042]体外抗病毒实验
[0043]I)抗H9N2禽流感病毒
[0044]Madin-Darby canine kidney (MDCK)细胞于24孔细胞培养板上，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中长成单层后，弃掉培养液，用PBS冲洗两遍后接种H9N2病毒，吸附一小时后弃掉病毒，PBS冲洗两遍后加含有100ug/ml或20ug/ml的上述实施例获得海藻多糖及I %胎牛血清的DMEM培养基，阴性对照组不加多糖。37°C ,5% CO2环境中培养24h。取培养液测定血凝效价(Hemagglutinat1n test, HA)，冲洗两遍后提取细胞RNA，反转录之后通过荧光定量PCR检测H9N2表达量。实验表明，加入上述实施例获得海藻多糖后，H9N2的血凝效价有了一定的降低，而H9N2的表达量有显著降低。其中0.2mg/ml孔石药多糖及lmg/ml马尾藻多糖处理组的血凝效价均有显著降低，其余处理组也有一定降低，见附图1。在荧光定量PCR中，lmg/ml蜈蚣藻处理组的H9N2表达量为阴性对照组的0.26倍，0.2mg/ml的蜈蚣藻处理组的H9N2表达量为阴性对照组的0.20倍，说明蜈蚣藻多糖对H9N2病毒有非常明显的抑制作用孔石莼处理组的H9N2表达量为阴性对照组的0.40倍，0.2mg/ml的孔石莼处理组的H9N2表