防风草酸的药物组合物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种化合物防风草酸（Anisomelic acid，AA)的新用途，所述防风草酸 从Anisomeles malabarica分离得到。特别是，本发明涉及防风草酸的药物组合物。本发 明还公开了防风草酸及其组合物在抗病毒癌症治疗中的用途。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是第二常见的影响全世界妇女的恶性肿瘤，每年诊断出约500, 000例新病 例，以及280, 000例死亡。虽然外科手术和化学-放射疗法能治愈80-95 %的早期癌症妇女 以及60%和60%的局部晚期癌症，疾病的复发和转移仍然是癌症死亡的主要原因。目前的 用于晚期和转移性癌症的细胞毒素治疗的可选方案显示出了一般程度的结果，即最大30% 的响应速率以及小于10个月的总体存活数。在传统疗法的成功率有限的情况下，对于宫颈 癌的其他治疗可选方案的兴趣已增加。
[0003] 大多数宫颈癌由一系列高风险的"瘤原性的"人类乳头瘤病毒（HPV)类型感染引 起，目前公认超过99%的宫颈癌起始于HPV的感染。持续性HPV感染导致后续的不同等级 的宫颈非典型增生和宫颈癌。与宫颈癌相关的主要高危基因型是HPV16和HPV18,这两个共 同导致约70 %的宫颈癌。
[0004] HPV病毒基因组的整合以及E6和E7病毒蛋白的表达是这种癌症发展的关键步骤。 E6蛋白对营养防御应答的消除通过几种重要的机制发生。最好地被描述的机制涉及肿瘤抑 制物P53的失活和降解。E6通过与称为E6相关蛋白（E6-AP)的细胞蛋白形成复合物来破 坏P53的肿瘤抑制物功能。结果，失去了 G1/S和G2/M的细胞周期检查点，并且细胞容易会 基因组不稳定，这可能导致瘤的发展。
[0005] 高危E6也激活端粒酶，所述端粒酶阻止端粒侵蚀并允许宿主细胞继续通过多轮 分裂而不破坏DNA。也有报道称在HPV16E6永久人口腔黏膜角质细胞和初级人气道上皮细 胞中，E6激活细胞核因子kB(NF-kB)而导致凋亡抑制蛋白2(IAP2)的表达加强。还发现 C-IAP2的消耗导致细胞死亡，这暗示HPV 16诱导的C-IAP2表达对于永久表型维持是必要 的。
[0006] 在HPV感染中表达非常早的第二个基因是E7。E7蛋白是进入宿主细胞后维持病 毒基因组的关键蛋白，最重要的功能之一是它与细胞蛋白中的视网膜母细胞瘤肿瘤抑制物 (Rb)家族结合的能力。E7通过结合以及目苗向用于降解的蛋白体来刺激pRb的磷酸化和失 活。然后E2F转录因子被释放以携带肿瘤细胞进入S期。E7与p21Cip和p27Kip相互作 用，这样来干扰其抑制细胞周期蛋白-周期蛋白依赖性蛋白激酶（cyclin-cdk)的活性以及 接下来的细胞周期的能力。因此，E7蛋白在适于病毒复制的细胞环境的维持中起着非常重 要的作用。
[0007] 对于可以治疗或改善癌症的痛苦的药剂的持续寻找过程中，天然产品提供了源源 不断的活性化合物的供应，其越来越多地被利用。几种来源于植物的化合物目前已成功的 用于癌症的治疗中。
[0008] 防风草酸是从Anisomeles malabarica(L. )R. Br分离的双猫类化合物，所述 Anisomeles malabarica(L. ) R. Br是一种属于唇形科（Labiatae)的草本植物。这种植物 通常叫做Malabar catmint，其在古代医学中被推荐用于黏膜炎、间歇热、肠道疾病和癌症。 植物的含水醇类（50% )提取物已经显示出具有抗癌活性。
[0009] 到目前为止，防风草酸本身没有被暗示或用于抗病毒癌症的治疗。
【发明内容】
[0010] 本发明是基于AA在HPV16阳性的宫颈癌细胞中显示出诱导细胞凋亡的良好效果 的发现。其在非宫颈癌细胞和非癌的MEF细胞中不能有效地诱导细胞凋亡。
[0011] 出乎意料的是，发现AA抑制E6和E7的蛋白表达水平，因此其能够作为抗HPV剂 起作用。
[0012] 发明人还发现AA诱导P53非依赖性的细胞凋亡，其主要是通过细胞凋亡抑制蛋白 2 (cIAP2)的下调，从而引起细胞凋亡半胱天冬酶的内在激活。
[0013] 与本发明相关的获得的结果揭示了 AA为具有新的作用机制的化合物，其在宫颈 癌细胞中，修复P53介导的生长抑制以及诱导细胞凋亡。
[0014] 在发明人的知识范围内，这是第一次公开AA作为病毒肿瘤蛋白表达的抑制剂以 及作为用于人类乳头瘤病毒（HPV)诱导的瘤的化疗剂。由于癌症中的E6/E7肿瘤蛋白和 cIAP2蛋白作用的普遍重要性，所述化合物及其衍生物能被更广泛地用于抗癌和抗病毒的 疗法中。
[0015] 基于这些发现，本发明提供了防风草酸及其盐的药物组合物用于哺乳动物（包括 人类和动物）的抗癌治疗中，特别是宫颈癌中。
[0016] 进一步地，本发明提供了防风草酸及其盐以乳液或其前体的形式，特别是以基于 水包油的微乳剂或其前体的形式的改进的组合物。
[0017] 本发明还提供了防风草酸和其盐以乳液形式（任选地为体内形成的）在抗病毒癌 症治疗中的应用和用于抗病毒癌症治疗的改进的方法中的应用，包括向哺乳动物施用有效 剂量的防风草酸或其盐的步骤。
[0018] 更具体地说，用于根据本发明的抗病毒的癌症治疗的药物组合物的主要特点是在 权利要求1中的特征部分所述的那些。
[0019] 根据本发明的一个优选的实施例的组合物的特点是权利要求9中的特征部分所 述的那些，治疗哺乳动物主体的方法的特点是权利要求15中的特征部分所述的那些。
[0020] 通过本研宄的方法获得了很多优点。
[0021] 本发明公开了防风草酸本身是在宫颈癌中表达的HPV16-E6和E7肿瘤蛋白的有效 抑制剂。在宫颈癌细胞中，防风草酸诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡两者，这使得其能用作药 物阻止癌细胞增殖以及杀死癌细胞。非依赖于P53的防风草酸诱导细胞凋亡的能力在用其 治疗P53突变或p53缺失的癌症类型中提供了优势。防风草酸的商业应用能进一步拓宽以 治疗其他的HPV相关感染，例如皮肤赘生物和尖锐湿疣。
[0022] 在一个优选的实施方式中，防风草酸以乳液的形式使用。获得的与本发明相关的 结果显示了可以通过以乳液的形式或混合物的形式制备药物组合物来改善防风草酸的溶 解度和可施性，所述乳液在给药时或在体内形成乳液，以此来增加化合物的治疗方式。
[0023] 因此，如以下以更多的细节讨论的，乳液形式的防风草酸被测试其在SiHa细胞中 24和48小时的诱导细胞凋亡的效果。观察到相对于仅用防风草酸，乳液形式的防风草酸诱 导细胞凋亡非常有效。在24小时和48小时，由防风草酸乳液诱导的细胞凋亡高于防风草 酸。由防风草酸乳液诱导的细胞凋亡在24小时本身获得最大的细胞凋亡百分比，而防风草 酸需要花48小时。这清楚地显示出防风草酸乳液改进了药物的生物可利用率和药物到细 胞中的有效转移，这使得其在24小时本身较高的细胞凋亡百分率。所述乳液自身对细胞没 有毒性。
[0024] CAM接种的肿瘤仅用乳液或防风草酸乳液治疗，以不同浓度局部治疗5天。结果显 示防风草酸乳液治疗并不允许肿瘤的发展并抑制肿瘤。这提供了防风草酸乳液在体内CAM 模型中的替代物的功效的良好的证据。
[0025] 接下来，新技术将在随附的附图和【具体实施方式】的帮助下更详细地说明。
【附图说明】
[0026] 图IA显示了用0和40 μΜ的防风草酸（AA)处理的细胞在48小时的时间点的代 表性的相差显微镜图像。图IB显示了通过递增剂量范围的ΑΑ，半胱天冬酶-3的激活。图 IC显示了 AA在高剂量下并不造成对坏死性细胞死亡。图ID显示了 AA在HPV阳性的HeLa 和Caski细胞（ρ53+)中诱导细胞凋亡，在HPV阴性的c33a细胞（ρ53〇细胞凋亡几乎没有 被诱导的效果。图IE显示了在乳腺癌细胞MCF7细胞（ρ53+)和MDA-MB-231(p53_)中，AA 诱导有效的细胞凋亡失败。图IF显示了 AA在40 μ M下，在非癌的MEF细胞中诱导细胞死 亡失败。