用于再生毛细胞和/或支持细胞的方法及组合物的制作方法
【专利说明】用于再生毛细胞和/或支持细胞的方法及组合物 相关申请的交叉参考 本申请要求于2012年9月7日提交的美国临时专利申请号61/698, 246的优先权和权 益，在此以参考的方式并入其全部内容。 技术领域 本发明的领域一般涉及诱导内耳细胞重新进入细胞周期并增殖的方法和组合物。更具 体地，本发明涉及增加细胞内c-myc (原癌基因）活性和/或Notch活性以诱导内耳的毛细 胞和/或支持细胞重新进入细胞周期并增殖。 【背景技术】 一种最普通类型的听力损失是由毛细胞或毛细胞功能的损失引起的感觉神经性聋。毛 细胞是耳蜗的感觉细胞，耳蜗负责将声音转换成电信号。在出生时，人类内耳每个耳蜗仅有 约15000个毛细胞，并且尽管各种遗传或环境因素（例如，曝噪，耳毒性药物中毒、病毒性感 染、老化以及遗传缺陷）导致这些细胞损失，但不能更替这些损失或者受损的细胞。还发现 毛细胞也存在于前庭的椭圆囊中，前庭是调节平衡的器官。因此，毛细胞再生是恢复听力和 前庭功能的重要途径。 迄今为止，对成熟哺乳动物内耳中的毛细胞的再生的研宄集中在对现有支持细胞进行 转分化。支持细胞在内耳内的感觉毛细胞之下，至少部分地包围并物理地支持感觉毛细胞。 支持细胞的实施例包括内杆（柱细胞）、外杆（柱细胞）、内指细胞、（Deiters)外指细胞， Held细胞、Hensen细胞、Claudius细胞、Boettcher细胞、齿间细胞以及（Huschke)听牙。通 过支持细胞中的无调同元蛋白质UProtein Atonal Homolog I) (Atohl)的过表达或激活， 或通过将支持细胞暴露于Atohl激动剂，支持细胞向毛细胞的转分化是生成新的毛细胞的 一个此类途径。然而，此途径的一个局限性是，支持细胞向毛细胞的转分化减少了支持细胞 的现存种群，这会损害内耳功能。此外，Atohl在缺少支持细胞的老化的内耳或扁平上皮中 的过表达，不足以诱导毛细胞。另外，仍不清楚是否所有类型的支持细胞可以基于Atohl的 过表达转分化成毛细胞。 毛细胞再生的其他研宄已经通过例如阻断Rbl和p27kipl的途径检测了胚胎小鼠或新 生小鼠中的毛细胞重新进入细胞周期的情况。然而，在成年小鼠内耳中的类似处理未曾诱 导使其重新进入细胞周期。此外，胚胎小鼠和新生小鼠的重新进入细胞周期的毛细胞一般 随后死亡。 超过150种遗传学耳聋是由于影响毛细胞和支持细胞二者的基因突变。例如，肌球蛋 白VIIA (My〇7a)中的突变引起毛细胞的静纤毛异常，这会导致永久性耳聋。GJB2(连接蛋 白26)突变造成对支持细胞的损害，这导致最常见形式的遗传学耳聋。已开发出各种途径 (例如，基因疗法和反义寡核苷酸疗法）作为遗传性聋的可能的治疗途径。然而，大部分的 这些缺陷在胚胎发育期间发生。到出生时，受影响的毛细胞和支持细胞已经死亡或严重退 化，变得难以干预。因此，为治疗遗传学耳聋，在子宫内和出生后都一直需要再生毛细胞和 /或支持细胞，这可以与其他途径结合，以纠正此疾病根本的基因缺陷。 此外，内耳非感觉细胞（例如在韧带中的纤维细胞）在听力中起重要作用。诸如噪声 和老化的因素可以损害内耳非感觉细胞，这造成听力损失。这些细胞类型，类似于内耳中的 很多细胞，缺乏损伤后自发再生的能力。 因为自发再生不在哺乳动物的内耳中发生，恢复听力损失需要介入以更替损失或退化 的内耳细胞类型。因此，一直需要再生哺乳动物耳内的毛细胞和/或支持细胞，特别是内耳 中的那些细胞，以更替例如由于遗传或环境因素而损失的那些细胞。再生的毛细胞和/或 支持细胞可用来减缓听力和/或前庭功能的损失，和/或部分或完全地恢复听力和/或前 庭功能的损失。
【发明内容】
本发明部分地基于以下发现：增加例如内耳细胞的耳细胞中c-myc活性、Notch活性或 c-myc和Notch二者的活性，会促进细胞重新进入细胞周期并增殖。当细胞例如是毛细胞或 支持细胞时，可以预期，细胞增殖和随后分化成毛细胞和/或支持细胞可以恢复或改善听 力和/或前庭功能。 在一个方面，本发明涉及一种诱导分化的耳蜗细胞或椭圆囊细胞增殖或重新进入细胞 周期的方法。该方法包括提高细胞内c-myc和Notch二者的活性，使之足以诱导耳蜗细胞 或椭圆囊细胞增殖或重新进入细胞周期。一旦进入到细胞周期，细胞可分化但保留其分化 状态的样子。在某些实施方式中，耳蜗细胞或椭圆囊细胞可以例如是毛细胞或支持细胞。 该方法还可包括下述步骤：在耳蜗细胞或椭圆囊毛细胞或支持细胞增殖后，抑制c-myc和/ 或Notch的活性，以诱导细胞和/或其子细胞的至少一者分化或转分化成毛细胞。增殖后 对c-myc和/或Notch活性的抑制在提高细胞存活率方面可以说是非常重要的。 在另一个方面，本发明涉及一种用于再生耳蜗毛细胞或椭圆囊毛细胞的方法。该方法 包括增加毛细胞内c-myc和Notch二者的活性，从而诱导细胞增殖以生成一种、两种或更多 种子代毛细胞，并且，在细胞增殖后，降低c-myc和/或Notch活性以诱导和/或维持子代毛 细胞的分化。在某些实施例中，耳蜗细胞或椭圆囊细胞例如可以是毛细胞或支持细胞。这 些步骤可以在体内（例如，在哺乳动物内耳中，特别是耳蜗或椭圆囊中）进行，或离体进行， 离体进行中，将所得到的细胞进行培养并且/或引入到受试者的内耳中。 在另一方面，本发明涉及一种用于降低对象听力损失、维持或促进其听力的方法。该方 法包括增加内耳的毛细胞和/或其支持细胞内c-myc和Notch二者的活性，从而诱导细胞 增殖以生成子代细胞，并且，在细胞增殖后，降低c-myc和/或Notch活性，并允许毛细胞源 的子代细胞分化成毛细胞，或允许支持细胞源的子代细胞转分化成毛细胞，从而降低对象 听力损失，维持或促进其听力。通过激活Atohl活性（例如通过基因表达、通过施用有效量 的Atohl或Atohl激动剂）可以诱导支持细胞源的子代细胞转分化成毛细胞。这些步骤可 以在体内（例如，在哺乳动物内耳中，特别是耳蜗）进行，或离体进行，在离体过程中，将所 得到的细胞进行培养和/或引入到对象的内耳中。 在另一个方面，本发明涉及一种用于降低对象前庭功能损失、维持或促进其前庭功能 的方法。该方法包括增加内耳的毛细胞和/或支持细胞内c-myc和Notch二者的活性，从 而诱导细胞增殖以生成子代细胞，并且，在细胞增殖后，降低c-myc和/或Notch活性，并允 许毛细胞源的子代细胞分化成毛细胞，或允许支持细胞源的子代细胞转分化成毛细胞，从 而降低对象前庭功能的损失、维持或促进其前庭功能。通过激活Atohl活性（例如通过基 因表达、通过施用有效量的Atohl或Atohl激动剂）可以诱导支持细胞源的子代细胞转分 化成毛细胞。这些步骤可以在体内（例如，在哺乳动物内耳中，特别是椭圆囊中）进行，或 离体进行，在离体过程中，将所得到的细胞进行培养和/或引入到对象的内耳中。 在本发明的上述各方面中，通过使细胞与有效量的c-myc蛋白质或c-myc激活剂接触 可增加 c-myc活性。在c-myc活性增加后，可以抑制c-myc活性以限制耳蜗细胞或椭圆囊 细胞的增殖和/或以促进耳蜗细胞或椭圆囊细胞的存活。类似地，在本发明的上述各方面 中，通过使细胞与有效量的Notch蛋白质、Notch胞内域（NI⑶）蛋白质或Notch激活剂接 触，可增加 Notch活性。通过使细胞与有效量的Notch抑制剂接触，可以抑制Notch活性。 在某些实施方式中，可对对象的内耳施用c-myc蛋白质或c-myc激活剂。在某些实施 方式中，可为对象的内耳施用Notch蛋白质、NICD蛋白质、Notch激活剂和/或Notch抑制 剂。在其他实施方式中，可为对象的内耳共同施用c-myc蛋白质或c-myc激活剂连同Notch 蛋白质、NI⑶蛋白质、Notch激活剂和/或Notch抑制剂。 通过参考以下附图、详细说明书和权利要求书，可更完全地理解本发明的前述方面和 实施方式。 【附图说明】 通过参考在此描述的附图可更完全地理解本发明的主题和特征。 图1㈧示出人类c-myc的全长蛋白质序列（NP_002458. 2 ;SEQ ID NO :1)，并且图（B) 示出c-myc蛋白质共有蛋白质序列（SEQ ID NO :9)。 图2⑷示出人类Notch全长蛋白质序列（NP_060087. 3;SEQ ID N0:2)，图⑶示出人 类Notch胞内域的蛋白质序列（NP_060087. 3残基1754-2555 ;SEQ ID NO :7)，并且图（C) 示出Notch胞内域的共有蛋白质序列（SEQ ID NO :10)。 图3(A)示出人类Atohl的全长蛋白质序列（NP_005163. I ;SEQ ID NO :3)，并且图（B) 示出Atohl共有蛋白质序列（SEQ ID NO :11)。 图4示出人类c-myc mRNA (信使核糖核酸）的核酸序列（NM_002467. 4 ;SEQ ID NO :4)。 图5⑷示出人类Notch mRNA的核酸序列（NM_017617. 3 ;SEQ ID NO :5)，并且图⑶示 出人类Notch胞内域的核苷酸序列（NM_017617. 3核苷酸位置5260-7665 ;SEQ ID NO :8)。 图 6 示出人类 Atohl mRNA 的核酸序列（NM_005172. I ;SEQ ID NO :6)。 图7示出在将Ad-Cre-GFP病毒和Ad-Myc病毒注射到45日龄的NKDfl°x/fl° x小鼠的耳 蜗后4天（A-E)、8天（K-O)或12天（P-T)后，细胞类型特异性和BrdU双重标记的耳蜗毛 细胞和支持细胞这些细胞。实线箭头表示BrdU标记的毛细胞，并且空心箭头表示标有BrdU 的支持细胞。图7 (F-J)示出未注射的对照耳蜗，其中没有发现具有细胞类型特异性标记和 BrdU双重标记的毛细胞和支持细胞。图7(A、F、K和P)示出BrdU标记。图7(B、G、L和Q) 示出毛细胞的Myo7a标记。图7(C、H、M和R)示出支持细胞的Sox2标记。图7(D、I、N和 S)示出细胞核的DAPI标记。图7 (E、J、0和T)示出合并的图像。 图8示出在注射Ad-Cre-GFP/Ad-Myc混合物35天后，随后每天施用BrdU持续5天后， NKDfl°x/fl°x小鼠耳蜗上皮中细胞类型特异性和BrdU双重标记的耳蜗毛细胞和支持细胞。图 8 (A、F和K)示出BrdU标记。图8 (B、G和L)示出毛细胞的Myo7a标记。图8 (C、H和Μ)示 出支持细胞的Sox2标记。图8(D、I和Ν)示出细胞核的DAPI标记。图8(E、J和0)示出合 并的图像。图8 (A-E)示出BrdU和My〇7a标记，表明注射35天后增殖毛细胞是存活的（图 8A、图8B、图8C和图8E的实线箭头）。图8(F-J)示出来源于一个母代毛细胞的分裂的两 个毛细胞的放大图像，此子代毛细胞显示出静纤毛（图8J的实线无尾箭头）。图S(K-O)示 出BrdU和Sox2标记的细胞（图8K、图8M和图80的空心箭头），表明注射35天后增殖支 持细胞是存活的。图8(K、L、M和0)中的实心箭头示出My〇7a+/BrdU+毛细胞。图8(K、L、 M和0)中的无尾箭头示出Myo7a+/Sox2+/BrdU+毛细胞。 图9示出具有细胞类型特异性和BrdU双重标记的老龄NKDfl°x/fl°x小鼠耳蜗上皮耳 蜗毛细胞和支持细胞，其中所述小鼠在15天的过程中注射有Ad-Cre-GFP/Ad-Myc混合物。 图9 (A、F和K)示出毛细胞的Myo7a标记。图9 (B、G和L)示出分裂细胞的BrdU标记。图 9(C、H和M)示出支持细胞的Sox2标记。图9(D、I和N)示出细胞核的DAPI标记。图9(E、 J和0)示出合并的图像。图9 (A-J)示出用Ad-Myc和Ad-Cre-GFP腺病毒注射后My〇7a+/ BrdU+毛细胞（A、B和E ;箭头）和Sox2+/BrdU+支持细胞（B、C、E、G、H和J ;无尾箭头）。 图9(K-0)示出在单独注射Ad-Cre-GFP病毒的17个月大小的NICDfl°x/fl° x小鼠中的相同染 色。后一组中没有发现BrdU标记的毛细胞或支持细胞。比例尺：10 μ M。 图10示出在用Ad-Myc/Ad-NICD转导10天的培养的成年人类耳蜗组织（图10Α-Ε)和 椭圆囊（图10F-J)组织中的BrdU (图IOA和图10F)、Myo7a (图IOB和图10G)和Sox2(图 IOC和图10H)标记的毛细胞和支持细胞。空心箭头（图10A、图10C、图10D、图10E、图10F、 图10H、图101和图10J)表示增殖的支持细胞（Sox2+/BrdU+)，并且实线箭头（F-J)表示增 殖的毛细胞（Myo7a+/BrdU+)。细胞核由DAPI (D和I)染色示出。 图11示出在成年猴类耳蜗培养物中的My〇7+毛细胞（A和F)和Sox2+支持细胞（C和 H)。分裂细胞（B和G)由EdU标记。图11 (A-E)示出Ad-GFP感染的对照猴类耳蜗，其中没 有识别出EdU+。图11 (G、H和J)示出暴露于Ad-Myc/Ad-NICD病毒的猴类耳蜗培养物中的 EdU+/S〇x2+支持细胞（无尾箭头）。在对照培养物和Ad-Myc/Ad-NICD病毒感染的培养物 中，都没有观察到毛细胞重新进入细胞周期（A、E、F和J;箭头）。比例尺：20μΜ。 图12示出对rtTa/tet-on-Myc/tet-on-NICD小鼠的支持细胞（箭头；B、C和Ε)而不 是内毛细胞（无尾箭头；A、C和E)增殖的选择性诱导，其中该小鼠暴露于由植入式渗透泵 持续施用9天的多西环素以诱导NICD和Myc的表达。重新进入细胞周期的细胞在相同的周 期中经由每天的EdU(图12B)给药标记。细胞核用DAPI (图12D)染色。内毛细胞用小清 蛋白（Parvalbumin) (Parv ;图12A)染色。支持细胞用Sox2(图12C)染色。由于Notch激 活（图12A、图12C和图12E中最右边的无尾箭头），示出还表达Sox2的单Parv+毛细胞。 没有示出外毛细胞，因为它们在渗透泵的手术植入期间丢失了。比例尺：20 μM。 图13示出在体内暴露于升高的c-myc和Notch二者的活性后选择性诱导外部毛细胞 以重新进入细胞周期。使rtTa/tet-on-Myc/tet-on-NIO)小鼠暴露于通过植入式渗透泵持 续施用的多西环素 12天，以诱导NI⑶和Myc的表达，然后收获小鼠组织用于染色。在暴露 于多西环素期间，通过每天的EdU(图13B)给药标记重新进入细胞周期的细胞。细胞核用 DAPI染色（图13D)。内外毛细胞用Espin(Esp ;图13A)染色。支持细胞用Sox2(图13C) 染色。注意，与图12中所示的实验相比，在本实验中外毛细胞在渗透泵的植入期间是备用 的。图13(B和E ;箭头）中示出Esp+