装载了肿瘤裂解物的微粒的制作方法
【专利说明】装载了肿瘤裂解物的微粒
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求享有在2012年9月6日提交的申请号为61/697, 498的美国临时申请、 在2013年9月5日提交的申请号为14/019,025的美国申请，以及在2013年9月5日提交 的申请号为14/019, 007的美国申请的优先权。所有在先申请的公开内容通过提述并入本 文。
[0003] 发明背景
[0004] 肿瘤细胞存在在某种程度上是因为其选择了一种或多种突变使得其部分或全部 逃离体内的免疫监控。
[0005] 在引发对肿瘤细胞的免疫应答的尝试中，之前的研宄者已使用树突状细胞，其为 专业的抗原呈递细胞，对免疫系统递呈肿瘤抗原。举例来说，用肽或肿瘤裂解物脉冲的树突 状细胞已被用于为黑色素瘤患者接种疫苗。
[0006] 然而，由于这些抗原仅由树突状细胞内吞且通常通过只诱导辅助T细胞而并不提 供强免疫应答的主要组织相容性复合体（MHC) II类途径呈递，因此以之前的方式简单地向 免疫系统提供肿瘤抗原并不有效。
[0007] 相反地，经由MHC I类途径递呈肿瘤抗原可通过激活⑶8+T细胞促成更强的抗肿 瘤免疫力。之前的研宄者已尝试通过使用基因转移方法由MHC I类途径递呈肿瘤抗原。然 而，这些方法具有劣势，包括（1)局限的识别全部重要的肿瘤特异性抗原的能力，（2)局限 的对特异性肿瘤抗原基因定位的能力，（3)只有一种或少数的已知肿瘤抗原基因可以被引 入树突状细胞以及（4)所述方法费时且繁琐。
[0008] 发明概述
[0009] 一些实施方案涉及分离的树突状细胞，其包含基本上由⑴微粒和（ii)微粒内装 载的肿瘤裂解物所组成的吞噬组分。在特定的实施方案中，所述肿瘤裂解物以约200 μ g至 约500 μ g的量存在。在特定的实施方案中，所述肿瘤裂解物以约200 μ g的量存在。
[0010] 在一些实施方案中，所述肿瘤裂解物是选自癌症的裂解物，所述癌症选自下组：乳 腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、肾母细胞瘤、横 纹肌肉瘤、骨肉瘤、肝癌、胰腺癌、黑色素瘤、前列腺癌和眼黑色素瘤。
[0011] 在一些实施方案中，所述微粒是酵母细胞壁微粒。在一些实施方案中，所述树突状 细胞是已分离不超过8天的未成熟细胞。
[0012] 另一实施方案涉及疫苗，其包含前文所述的分离的树突状细胞。
[0013] 一些实施方案涉及用于产生分离的包含装载了肿瘤裂解物的微粒的树突状细胞 的方法，其包括：（i)将所述肿瘤裂解物装载入微粒来产生装载了肿瘤裂解物的微粒；（ii) 冻干所述装载了肿瘤裂解物的微粒；以及（iii)将所述装载了肿瘤裂解物的微粒与树突状 细胞共同孵育，其中所述孵育引起所述树突状细胞吞噬所述装载了肿瘤裂解物的微粒。
[0014] 在特定的实施方案中，前文所述方法进一步包括（a)在溶液中重悬所述装载了肿 瘤裂解物的微粒以及（b)在步骤（iii)之前冻干所述重悬溶液。在特定的实施方案中，所 述肿瘤裂解物通过冷冻和融化所述肿瘤生成。在特定的实施方案中，前文所述方法进一步 包括重复所述冷冻和融化步骤。在特定的实施方案中，前文所述方法进一步包括在-150°C 冷冻保存所述肿瘤裂解物。
[0015] 在特定的实施方案中，步骤（iii)包括：(a)将肿瘤裂解物加入酵母细胞壁微粒， (b)孵育所述酵母细胞壁微粒，（c)冻干所述酵母细胞壁微粒以及（d)洗涤所述酵母细胞 壁，其中重复步骤（b)-(c)至少一次且在重复步骤（b)之前伴随将水加入所述酵母细胞微 粒的步骤。
[0016] 在特定的实施方案中，步骤（iii)包括：(a)将装载了肿瘤裂解物的微粒与树突状 细胞以约1〇〇: 1的比例接触，（b)将所述装载了肿瘤裂解物的微粒与所述树突状细胞孵育1 至2小时以及（c)收集所述树突状细胞并洗涤所述细胞。
[0017] 在优选的实施方案中，将少量的一种或多种增强免疫应答的佐剂添加至肿瘤裂解 缓冲液中，然后与树突状细胞孵育。一种或多种佐剂的添加增加了肿瘤裂解物对树突状细 胞的作用同时显著减少任何来自这类佐剂的全身作用。通常使用的佐剂包括但不限于蛋白 质、肽、核酸和碳水化合物。
[0018] 示例性佐剂包括但不限于单磷酰脂质A、GpC寡核苷酸（如GpC DNA)、Poly I :C、 Poly ICLC、有效的MHC II表位肽、β葡聚糖，和树突状细胞刺激细胞因子如IL-12。合适 的佐剂是那些已知与树突状细胞上的受体相互作用由此激活树突状细胞并进一步刺激T 细胞（如CD4+和CD8+T细胞）更强的生成的分子。
[0019] 在一些实施方案中，一种或多种增强免疫应答的佐剂的量是至少约5 μ g、至少 约10 μ g、至少约15 μ g、至少约20 μ g、至少约25 μ g、至少约30 μ g、至少约35 μ g、至少 约40 μ g、至少约45 μ g、至少约50 μ g、至少约60 μ g、至少约70 μ g、至少约80 μ g、至少约 80 μ g、至少约90 μ g，或至少约100 μ g。在一个实施方案中，佐剂的量占总裂解物的量的 1-10%之间。佐剂的量足以刺激树突细胞上的受体，如toll-样受体。
[0020] 一些实施方案涉及用于治疗癌症的方法，其包括施用包含前文所述的分离的树突 状细胞的疫苗。在特定的实施方案中，所述癌症选自下组：乳腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺 癌、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、肾母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、肝癌、胰腺 癌、黑色素瘤、前列腺癌和眼黑色素瘤。
[0021] 附图简述
[0022] 图1描述了用于产生树突状细胞的方法。
[0023] 图2描述了用于产生肿瘤裂解物的方法。
[0024] 图3描述了用于产生酵母细胞壁微粒的方法。
[0025] 图4描述了用于将肿瘤裂解物装载入酵母细胞壁微粒的方法。
[0026] 图5描述了用于产生装载了肿瘤裂解物微粒的树突状细胞的方法。
[0027] 图6是装载了肿瘤裂解物微粒的树突状细胞与抗原脉冲的树突状细胞对B3Z细胞 作用的比较图。
[0028] 图7A展示了受B16R)小鼠黑色素瘤困扰的对照小鼠的肺。图7B展示了受B16F0 小鼠黑色素瘤困扰但用肿瘤裂解物微粒装载的树突状细胞治疗的小鼠的肺。
[0029] 优选实施方案的详述
[0030] 本领域的普通技术人员已知的多种方法学作为本文的参考文献。作为参考文献的 描述这些已知的方法学的发表物和其他材料在本文如阐述全文般通过提述以其全文并入。
[0031] 除非明确表明仅指代单数，否则本文所用单数形式"一个"、"一种"以及"所述"指 单数以及复数两者。同样的，除非明确表明仅指代单数，术语的单数形式指单数和复数两 者。举例来说，"疫苗"意为"一种疫苗"或"多种疫苗"。
[0032] 术语"约"与数值和范围有关时意为包括的数字不限于本文阐述的精确数字，且意 在指基本上在引用范围内但不脱离本发明的保护范围的范围。本文所用术语"约"可被本 领域的普通技术人员理解且将在其使用的语境中有一定程度的变化。
[0033] 本文所用"受试者"或"患者"指任何需要用疫苗治疗的动物。举例来说，受试者 可能承受或有风险发展出可被疫苗治疗或预防的病症。本文使用的"受试者"或"患者"包 括人。
[0034] 本文所用术语"治疗有效量"和"治疗水平"分别意为在需要治疗的受试者中针对 施用疫苗提供了特异性应答的疫苗的剂量或受试者的血浆浓度。为方便起见，下文提供了 关于成人受试者的示例性剂量、疫苗递送量、治疗有效量和治疗水平。当需要治疗特定的受 试者和/或病症/疾病时，本领域的技术人员可根据标准实践调整此类量。
[0035] 肿瘤裂解物
[0036] 本文所述的"肿瘤裂解物"指被裂解的肿瘤。肿瘤裂解可在多个条件下发生，包括 肿瘤的重复冷冻和融化，通过均质化物理裂解肿瘤，与高渗或低渗溶液接触和与一种或多 种非离子去污剂接触。肿瘤裂解物在裂解过程中未交联。在另一实施方案中，所述肿瘤裂解 物使用本领域任何已知的技术通过切碎、研磨或捣碎肿瘤，或以别的方式粉碎肿瘤来产生。 在另一实施方案中，所述肿瘤裂解物通过在磷酸盐缓冲液（PBS)如IX PBS存在下，切碎、研 磨、捣碎或粉碎肿瘤来产生。
[0037] 在特定的实施方案中，所述肿瘤裂解物从称量为至少200至500 μ g的实体肿瘤产 生。
[0038] 在另一实施方案中，所述肿瘤裂解物通过切碎、研磨或捣碎或粉碎肿瘤随后重复 冷冻和融化来产生。在特定的实施方案中，将所述切碎的肿瘤冷冻和融化多次。在特定的 实施方案中，将所述切碎的肿瘤冷冻和融化至少1、2、3或4次。在一些实施方案中，所述冷 冻在液氮中实施，且可实施20分钟。在特定的实施方案中，所述融化在室温实施。在另一 实施方案中，所述肿瘤裂解物在冷冻和融化流程后于约_135°C或更低的温度保存。在特定 的实施方案中，所述肿瘤裂解物