积比将在无菌水中的10 μ g/mL的 IL-6添加至培养物；以及以1:1000的体积比将在100 %乙醇中的lmg/mL的PGE2添加至培 养物。添加所有的因子并混合入培养物后，将所述培养物过夜孵育。
[0094] 实施例9 :树突状细胞的收获，疫苗的制备和冷冻保存
[0095] 从孵育箱中取出实施例9制备的树突状细胞培养物。在无菌条件下的护罩中实施 下列步骤。从培养烧瓶中取出IOmL培养基。用4. 0-4. 5mL的IX PBS冲洗培养烧瓶并添加 至培养基中。
[0096] 将I. 5-2. OmL的CellStripper?添加至培养烧瓶。将培养烧瓶置于37°C孵育箱 中10-20分钟。约4mL培养基从管中加回至烧瓶来洗涤和去除细胞。洗涤烧瓶来收获尽可 能多的细胞。在血球计上或Cellometer?上对细胞计数。离心后去除上清。
[0097] 随后，细胞在CryoStor? 10中以5X106细胞/mL重悬，等分入正确标记有患者ID 编号、日期和I. 25X106细胞/mL/每管（约250 μ L)的细胞浓度的冷冻管中。在冷冻管保 留250-500 μ L部分用于无菌性测试，且剩余的管保存在Styrofoam容器中并置于-86°C进 行逐步冷冻。
[0098] 实施例10 :用于患者施用的实体肿瘤疫苗的制备
[0099] -冷冻管的患者细胞从冷冻保存中移出并在37°C的水浴中小心融化。在无菌条件 下，将用于注射的具有5%人血清白蛋白的ImL无菌生理盐水（或ImL无菌IX PBS)轻轻加 至包含细胞的冷冻管中。小心重悬细胞后，从冷冻管取出全部体积且将包含肿瘤细胞的注 射器用于对患者施用疫苗。
[0100] 实施例11 :包含装载了肿瘤裂解物的微粒的树突状细胞V. S.抗原脉冲的树突状 细胞（DC)
[0101] B3Z细胞是表达T-细胞受体的T-细胞杂交瘤，所述T细胞受体特异性地识别在 H-2Kb背景下的OVA (257_264) (SIINFEKL)表位，并且B3Z细胞携载由来自白介素2启动子（X) 的活化的T细胞元件的核因子驱动的β-半乳糖苷酶（IacZ)构建体。这些B3Z细胞用于 评估用卵清蛋白脉冲的树突状细胞与通过装载卵清蛋白的YCWP的方式来装载卵清蛋白的 那些树突状细胞用于抗原递呈的有效性的比较（引起CD8+T细胞应答）。
[0102] 在通过与递呈卵清蛋白表位的树突状细胞上的MHC I类分子相互作用进行激 活后，对B3Z细胞进行工程化来通过表达β -半乳糖苷酶应答。β -半乳糖苷酶催化 X-gal (5-溴-4-氯-吲哚基β -D-吡喃半乳糖苷）的分解来生成5-溴-4-氯-3-羟基吲 哚，一种蓝色产物。对这种蓝色的分光光度测量提供了对卵清蛋白表位的有效MHC I类递 呈的测量。该实验的结果，示于图6中，证明了通过装载了卵清蛋白的YCWP装载树突状细 胞提供了与卵清蛋白脉冲的树突状细胞相比增加了超过100倍的CD8+T细胞应答。
[0103] 实施例12 :体外数据
[0104] 树突状细胞从由雌性C57BL/6J小鼠两条后腿的股骨和胫骨的骨髓获得的细胞来 制备。获得B16R)鼠科黑色素瘤细胞（ATCC(CRL-6322))并使用标准组织培养技术培养。在 树突状细胞培养第7天以100 :1(微粒：DC)的比例通过将微粒加入，用包含B16R)肿瘤裂解 物（约2xl〇-15g/YCWP)的YCWP来装载树突状细胞，持续2小时。在制备包含装载了肿瘤裂 解物的微粒的树突状细胞的三天前，通过静脉注射在〇. 4ml IX PBS中的0. 75xl06B16R)黑 色素细胞挑战（challenge)雌性C57BL/6J小鼠。一旦制备了包含装载了肿瘤裂解物的微 粒的树突状细胞，对治疗组中的每只小鼠用2xl0 6包含装载了肿瘤裂解物的微粒的树突状 细胞进行静脉注射且以三个周剂量重复该疫苗接种。对小鼠的肺转移进行监控直至四周。
[0105] 在第四周末（当对照小鼠中的一只死亡时），处死小鼠并对任何发生的转移进行 计数。未用含装载了肿瘤裂解物的微粒的树突状细胞治疗的全部四只对照动物具有多于50 个肿瘤。然而，治疗的小鼠无一具有可测量的转移。该数据表明含装载了肿瘤裂解物的微粒 的树突状细胞在经过验证的动物模型系统中在治疗癌症上是有效的。该数据列于表1中。
[0106] 表1.对照和治疗小鼠的转移数目
[0107]
[0108] 此外，图7A表明在本实验中的三只对照小鼠的肺（一只在于实验终点前死亡且不 能对其肺进行拍照），而图7B表明四只治疗的小鼠的肺。
[0109] 实施例13 :体内操作
[0110] 为接种受试者，可将一剂1. 25百万剂量的包含装载了肿瘤裂解物的微粒的树突 状细胞在〇.2mL的无血清、10 %二甲基亚砜的冷冻培养基（CryoStorTM CS-10, BioLife Solutinos，Inc.)中冷冻保存。注射前，融化树突状细胞并将其用包含5%人血清白蛋白 (Albuminar-25, Aventis Behring)的注射用无菌生理盐水稀释至lmL。随后可将稀释转移 至3. Occ注射器用于注射并使用不小于23Ga.的针头，其应在融化的2小时内施用。注射 可皮下施用至淋巴结区域。
[0111] 实施例14 :使用SepMate-50系统自全外周血分离单核细胞
[0112] 操作：
[0113]
[0114] 实施例15 :与装载的YCWP组合的树突状细胞的生成
[0115] 在实施例14中的步骤后，实施下列方法：
[0116] I .YCWP 的添加：
[0118] II.细胞因子的制备和添加：
[0119]
[0120] 实施例16 :细胞的收获，疫苗的制备和冷冻保存
[0121] 在实施例15中的步骤后，实施下列方法：
[0122] I.细胞的收获：
【主权项】
1. 一种分离的树突状细胞，其包含基本上由⑴微粒和（ii)微粒内装载的肿瘤裂解物 组成的吞噬组分。2. 权利要求1的树突状细胞，其中所述肿瘤裂解物以约200yg至约500yg的量存在。3. 权利要求1的树突状细胞，其中所述肿瘤裂解物以约200yg的量存在。4. 权利要求1的树突状细胞，其中所述肿瘤裂解物是选自癌症的裂解物，所述癌症选 自下组：乳腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、肾母 细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、肝癌、胰腺癌、黑色素瘤、前列腺癌和眼黑色素瘤。5. 权利要求1的树突状细胞，其中所述微粒是酵母细胞壁微粒。6. 权利要求1的树突状细胞，其中所述树突状细胞是已分离不超过8天的未成熟细胞。7. -种疫苗，其包含权利要求1的分离的树突状细胞。8. -种用于生产包含装载了肿瘤裂解物的微粒的分离的树突状细胞的方法，其包括： (i) 将所述肿瘤裂解物装载入所述微粒来产生装载了肿瘤裂解物的微粒； (ii) 冻干所述装载了肿瘤裂解物的微粒；以及 (iii) 将所述装载了肿瘤裂解物的微粒与树突状细胞共同孵育， 其中所述孵育引起所述树突状细胞吞噬所述装载了肿瘤裂解物的微粒。9. 权利要求8的方法，其进一步包括：(a)在溶液中重悬所述装载了肿瘤裂解物的微粒 以及（b)在步骤（iii)之前冻干所述重悬溶液。10. 权利要求8的方法，其中所述肿瘤裂解物通过冷冻和融化肿瘤生成。11. 权利要求10的方法，其进一步包括重复所述冷冻和融化步骤。12. 权利要求11的方法，其进一步包括在-150°C冷冻保存所述肿瘤裂解物。13. 权利要求8的方法，其中所述步骤（iii)包括： (a)将肿瘤裂解物加入酵母细胞壁微粒，（b)孵育所述酵母细胞壁微粒，（c)冻干所述 酵母细胞壁微粒以及（d)洗涤所述酵母细胞壁，其中重复步骤（b)-(c)至少一次且在重复 步骤（b)之前伴随将水加入所述酵母细胞微粒的步骤。14. 权利要求8的方法，其中步骤（iii)包括： (a)将装载了肿瘤裂解物的微粒与树突状细胞以约100:1的比例接触，（b)将所述装载 了肿瘤裂解物的微粒与所述树突状细胞孵育1至2小时，以及（c)收集所述树突状细胞并 洗涤所述细胞。15. -种用于治疗癌症的方法，其包括将包含权利要求1的分离的树突状细胞的疫苗 施用于对其有需要的患者。16. 权利要求15的方法，其中所述癌症选自下组：乳腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、 神经胶质瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、肾母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、肝癌、胰腺癌、 黑色素瘤、前列腺癌和眼黑色素瘤。
【专利摘要】本发明制备了包含装载了肿瘤裂解物的微粒的树突状细胞。树突状细胞递呈了肿瘤抗原来引发主要组织相容性复合体I类途径并可被用作疫苗来治疗癌症，包括眼黑色素瘤。
【IPC分类】A61K39/00
【公开号】CN104936612
【申请号】CN201380057518
【发明人】T·E·瓦格纳
【申请人】奥比思健康解决方案有限责任公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2013年10月2日